新型人β2整合素α亚单位的制作方法

专利名称：新型人β2整合素α亚单位的制作方法
本申请是1996年2月22日提交的系列号为No.08/605,672的美国专利申请的部分继续申请，该专利申请正在审批；No.08/605,672是1994年12月21日提交的系列号为No.08/362,652的美国专利申请的部分继续申请，该专利申请正在审批；No.08/362,652是1994年8月5日提交的系列号为No.08/286,889的美国专利申请的部分继续申请，该专利申请已在1995年12月28日授权，专利号为美国专利5,470,953。而该专利又是1993年12月23日提交的系列号为No.08/173,497的美国专利申请的部分继续申请，后者已在1995年8月1日授权，专利号为美国专利5,437,958。发明领域本发明涉及编码新型人β2整合素α亚单位的多核苷酸的克隆和表达，这种新型人β2整合素α亚单位被命名为αd，它在结构上与已知的人β2整合素α亚单位--CD11a、CD11b和CD11c有关。本发明还涉及从其他种分离的显示与人αd编码序列同源的多核苷酸。发明背景整合素是一组活跃地参与细胞黏附的膜相关分子。整合素是由一个α亚单位和一个β亚单位非共价结合组成的跨膜异二聚体。目前，至少已经确定了14种α亚单位和8种β亚单位(Springer综述，《自然》346卷，425-434页(1990))。β亚单位一般能与一种以上的α亚单位结合，整合素群体中具有共同的β亚单位的异二聚体被分类成亚族。
有一组局限于白血细胞中表达的人整合素，其特征是含有共同的β2亚单位。由于这种细胞特异性表达，这些整合素通常被称为白细胞整合素、Leu-CAMs或白细胞整合素。由于含有共同的β2亚单位，这组整合素的另一种命名是β2整合素。β2亚单位(CD18)先前是在与三种不同的α亚单位--CD11a、CD11b或CD11c结合的状态下被分离的。Kishimoto等，《细胞》48卷，681-690页(1987)中介绍了编码人CD18的cDNA的分离。在官方的WHO命名中，上述异二聚体蛋白被称为CD11a/CD18、CD11b/CD18和CD11c/CD18；在通常的命名中，它们被分别称为LFA-1、Mac-1或Mol和p150、95或LeuM5(Cobbold等，《白细胞分型III》，McMichael(编辑)，牛津出版社，788页(1987))。已经证明人β2整合素α亚单位CD11a、CD11b和CD11c在还原条件下进行电泳时，分别以表观分子量约180kD、155kD和150kD迁移，而且编码这些亚单位的cDNA已经被克隆(CD11a，Larson等，《细胞生物学杂志》108卷，703-712页(1989)；CD11b，Corbi等，《生物化学杂志》263卷，12403-12411(1988)；CD11c，Corbi等，《EMBO J》6卷，4023-4028(1987))。由分子量的大致相似而定义的人β2整合素α和β链的推定同源物已在其他种属中得到不同的鉴定，这些动物包括猴和其他灵长类(Letvin等《血液》61卷，408-410页(1983))、鼠(Sanchez-Madrid等《J.Exp.Med》154卷，1517页(1981))和狗(Moore等，《组织抗原》36卷211-220页(1990))。
来自其他种属的推定同源物的绝对分子量已显示明显的差异(见诸如Danilenko等，《组织抗原》40卷，13-21页(1992))，在没有序列信息的情况下，对人整合素亚单位和在其他种属中鉴定的整合素亚单位进行明确的比较是不可能的。而且，在不同的种属中已经观察到一个蛋白家族的成员在数量上不同，例如，在兔中比在人中分离到更多的IgA同种型(Burnet等，《EMBO J》8卷，4041-4047页(1989)和Schneiderman等，《美国科学院院报》86卷，7561-7565(1989))。类似地，在人中已经鉴定了至少六种金属硫蛋白的变体(Karin和Richards，《自然》299卷，797-802页(1982)和Varshney等，《分子细胞生物学》6卷，26-37页(1986))，而在鼠中只证明两种这样的变体(Searle等，《分子细胞生物学》4卷，1221-1230页(1984))。因此，在一个物种中一个蛋白家族中存在多个成员并不意味着在其他物种中存在相应的家族成员。
具体到β2整合素，在狗中已经观察到与人CD18相当的推定犬β2能够与四种之多的潜在不同的α亚单位形成二聚体(Danilenko等，上文)。用犬脾细胞免疫鼠制备抗体能够产生这样的单克隆抗体，这种单克隆抗体能免疫沉淀主要基于类似但不是相同分子量而实验性地选来作为人CD18、CD11a、CD11b和CD11c的犬同源物的蛋白。另一种识别和免疫沉淀一种第四α样犬亚单位的抗犬脾细胞抗体---Ca11.8H2，也能够与β2亚单位结合，但这种亚单位具有独特的分子量，并且限制表达于一种分化类型的组织巨噬细胞。
用小鼠树突细胞免疫仓鼠制备抗体能产生两种抗整合素抗体(Metlay等《实验医学杂志》171卷，1753-1771(1990))。第一种抗体---2E6能够免疫沉淀由具有约180kD和90kD的分子量以及分子量范围为150-160kD的次要带的亚单位组成的占优势的异源二聚体。第二种抗体---N418免疫沉淀由具有约150kD和90kD分子量的亚单位组成的另一种明显的异源二聚体。基于细胞黏附阻断研究，人们提出了这样一种假说，抗体2E6识别人CD18的一种鼠对应物。而N418抗原的分子量表明对人CD11c/CD18的一种鼠同源物的识别，进一步的分析表明该鼠抗原显示与在人CD11c/CD18中观察到的组织分布图谱不一致的组织分布图谱。
犬Ca11.8H2抗体和鼠N418抗体识别的抗原可能代表了一类以前鉴定的犬或鼠α亚单位的变体种类(例如糖基化或剪切变体)。此外，这些抗原可能代表独特的犬或鼠整合素α亚单位。在没有一级结构的具体信息的情况下，这些可能性无法区分。
在人中，CD11a/CD18在所有的白细胞上表达，CD11b/CD18和CD11c/CD18主要局限表达于单核细胞、粒细胞、巨噬细胞和自然杀伤(NK)细胞。但CD11c/CD18也在某些B细胞种类中检出。一般来说，CD11a/CD18在淋巴细胞中占优势，CD11b/CD18在粒细胞中占优势，而CD11c/CD18在巨噬细胞中占优势(见综述，Arnout《血液》75卷，1037-1050(1990))。而α链的表达因各细胞类型的激活和分化状态而不同(见综述Larson和Springer《免疫学综述》114卷181-217(1990))。
使用能够阻断β2整合素相关的细胞黏附的单克隆抗体已经证明，β2整合素参与人的免疫和炎症应答。例如，CD11a/CD18、CD11b/CD18和CD11c/CD18活跃地参与自然杀伤细胞与淋巴瘤和腺癌细胞的结合(Patarroyo等《免疫学综述》114卷，67-108页)、粒细胞集聚(Nourshargh等，《免疫学杂志》142卷，3193-3198(1989))、不依赖粒细胞的血浆渗出(Arfors等，《血液》69卷，338-340页(1987))、受到激活的白细胞的趋化应答(Arfors等，上文)和白细胞与血管内皮黏附(Price等《免疫学杂志》139卷，4147-4177页(1987)和Smith等《J.Clin.Invest.》83卷，2008-2017页(1989))。β2整合素在免疫和炎症应答中的基本作用在被称为白细胞黏附缺陷(LAD)的临床综合征中非常明显，该综合征的临床表现包括复发和经常性地受到危及生命的细菌感染的威胁。LAD是由于β2亚单位的异源性突变造成的(Kishimoto等《细胞》50卷，193-202(1987))，并且疾病的严重程度与β2亚单位表达的缺陷程度有关。完整的整合素异源二聚体的形成受到β2突变体的损害(Kishimoto等，上文)。
有趣的是，至少有一种针对CD18的抗体已经显示在体外能够抑制人免疫缺陷病毒类型-1(HIV-1)合胞体的形成，尽管这种抑制作用的精确机制还不清楚(Hildreth和Orentas，《科学》244卷，1075-1078(1989))。该发现与下面的发现一致CD11a/CD18的一个主要受体---ICAM-1也是鼻病毒血清型的主要群体的表面受体(Greve等，《细胞》56卷，839(1989))。
β2整合素结合活性在人免疫和炎症应答中的意义说明有必要对这类表面蛋白进行更完全的理解。鉴定未知的该亚家族的成员以及它们的反受体，并制备能够改变β2整合素生物活性的单克隆抗体或其他可溶性因子，将为在β2整合素相关的免疫和炎症应答中治疗性干预提供实用的方法。发明简述在一个方面，本发明提供新型的纯化和分离的多核苷酸(例如DNA和RNA转录物，包括有义链和反义链)，这些多核苷酸编码具有αd固有的结合和/或免疫特性的新型人β2整合素α亚单位αd及其变体(即删除、添加或取代类似物)。本发明的优选DNA分子包括cDNA、基因组DNA及全部或部分化学合成的DNA分子。目前一个优选的多核苷酸是SEQ ID NO1中列出的DNA，它编码SEQ ID NO2的多肽。本发明还提供包含αd编码序列的重组质粒和病毒DNA结构(表达结构)，其中αd编码序列可操纵地与一个或多个同源或异源的转录调节元件连接。
本发明还提供与编码人αd的多核苷酸显示同源性的分离和纯化的小鼠和大鼠多核苷酸。一个优选的小鼠多核苷酸列于SEQ ID NO52，一个优选的大鼠多核苷酸列于SEQ ID NO54。
本发明的另一个方面是，提供用能表达αd多肽或其变体的本发明的DNA序列转化或转染的原核或真核宿主细胞。本发明的宿主细胞在大量制备αd多肽时特别有用，αd多肽可以从宿主细胞本身或宿主细胞生长的培养基中分离。在其细胞外膜表面表达αd多肽的宿主细胞作为免疫原在制备αd特异的抗体时也特别有用。优选地，用αd转染的宿主细胞也进行共转染来表达一种β2整合素，使异源二聚体在表面表达。
本发明还提供纯化和分离的αd多肽及其片段和变体。优选的αd多肽列于SEQ ID NO2。本发明的新型αd产物可以从天然的原料中分离，但与αd变体产物一样，优选用本发明的宿主细胞通过重组方法进行生产。可以通过改变选择来进行重组过程的宿主细胞和/或分离后加工来制备完全糖基化、部分糖基化和完全去糖基化形式的αd多肽。本发明的αd多肽变体包含水溶性和不溶性的αd多肽，包括具有下面特性、其中一个或多个氨基酸被删除或取代的类似物(1)αd特异的生物学活性或免疫学特征没有丧失，并优选有一个或多个有增强；或(2)一个特别的配体/受体结合或信号功能被特异性地失活。本发明还提供融合的多肽，其中αd氨基酸序列与来自其他多肽的氨基酸序列顺序表达。这样的融合多肽与野生型的αd相比具有修饰的生物学、生物化学、和/或免疫学特性。本发明还包括包含额外的氨基酸残基(例如赖氨酸或半胱氨酸)从而便于多聚体形成的多肽类似物。
本发明还包括特异性地与αd结合的多肽或非肽类分子。优选的结合分子包括抗体(例如单克隆和多克隆抗体)、反受体(例如膜相关和可溶性形式)和其他配体(例如天然产生或合成的分子)，包括那些在αd单克隆抗体和/或特异性反受体存在下竞争性地与αd结合的分子。结合分子在纯化αd多肽和鉴定表达αd的细胞类型时非常有用。结合分子还可用于调节αd的体内结合和/或信号传导活性(即抑制、阻断或激活)。
本发明还提供鉴定αd结合分子的试验，包括体外试验例如固相配体结合试验、溶液结合试验和闪烁亲近试验；以及基于细胞的试验例如杂交筛选试验等等。基于细胞的试验在宿主细胞中提供表型改变作为特异性结合相互作用或特异性结合相互作用被破坏的结果，从而间接定量或测量某些特异性结合相互作用。
鉴定能调节αd活性的抗体或其他化合物的体外试验可以包括，例如，固化αd或一种αd结合的天然配体，将非固化的结合配体用可检测的标记物标记，将结合配体一起温育，测定待测化合物对标记数量的影响，其中在有待测化合物的情况下比没有待测化合物的情况下，结合的标记减少，就说明待测试剂是一种αd结合的抑制剂。
另一种类型的鉴定能调节αd与配体相互作用的化合物的体外试验包括，将αd或其片段固化于包被(或饱和)了一种荧光试剂的固相支持物上，配体用一种能激发荧光的化合物标记，将固化的αd与标记的配体在存在或不存在一种推定的调节化合物的情况下接触，检测荧光试剂的光发射，与没有调节化合物存在时荧光试剂的光发射相比能够影响荧光试剂光发射的化合物就被鉴定为调节化合物。另外，在试验中也可以将αd配体固化而将αd标记。
本发明包含的一种鉴定能调节αd与一种配体相互作用的化合物的基于细胞的方法包含用一个DNA结构转化或转染合适的宿主细胞，该DNA结构中含有一个在启动子控制之下的报告基因，该启动子受含有一个DNA结合结构域和一个激活结构域的转录因子调节；在宿主细胞中表达编码部分或全部αd与转录因子的DNA结合结构域或激活结构域的第一种融合的杂合DNA序列；在宿主细胞中表达编码配体的全部或部分与转录因子的DNA结合区域或激活区域的第二种融合的杂合DNA序列，第二种融合中的DNA结合区域或激活区域与第一种融合中的不同；通过测量在存在或没有推定调节物的情况下，报告基因产物在宿主细胞中的产量，来检测配体与αd在特定宿主细胞中的结合，从而评价推定的调节化合物对αd与配体相互作用的影响。那些与没有调节化合物时报告基因产物的产量相比报告基因产物的产量改变的化合物就被鉴定为调节化合物。这里优选在试验中使用的是lexA启动子、lexA DNA结合结构域、GAL4反式激活结构域、lacZ报告基因和一种酵母宿主细胞。
上述试验的一个修改版本可以用来分离编码一种能结合αd的蛋白的多核苷酸，包括用一个DNA结构转化或转染合适的宿主细胞，该DNA结构中含有一个在启动子控制之下的报告基因，该启动子受含有一个DNA结合结构域和一个激活结构域的转录因子调节；在宿主细胞中表达编码部分或全部αd与转录因子的DNA结合结构域或激活结构域的第一种融合的杂合DNA序列；在宿主细胞中表达编码配体的全部或部分与转录因子的DNA结合区域或激活区域的第二种融合的杂合DNA序列，第二种融合中的DNA结合区域或激活区域与第一种融合中的不同；通过检测宿主细胞中报告基因产物的产量来检测在特定宿主细胞中αd结合蛋白与αd的结合；并从特定宿主细胞中分离编码αd结合蛋白的第二种杂合DNA序列。
在一个使用割裂杂交试验(split hybrid assay)的优选实施方案中，本发明提供了一种鉴定αd蛋白或其片段与αd结合蛋白或其片段结合的抑制剂的方法，这种方法包含如下步骤(a)用第一个DNA表达结构转化或转染所说的宿主细胞，该DNA表达结构包含编码第一个选择标记蛋白的第一个选择标记基因和编码一个抑制蛋白的抑制基因，其中所说的抑制基因在一个启动子的转录控制之下，(b)用第二个DNA表达结构转化或转染所说的宿主细胞，该DNA表达结构包含编码第二个选择标记蛋白的第二个选择标记基因和编码第三个选择标记蛋白的第三个选择标记基因，其中所说的第三个标记基因在一个操纵子的转录控制之下，所说的操纵子特异性地受所说的抑制蛋白作用，从而所说的抑制蛋白与所说的启动子相互作用降低所说的第三个选择标记蛋白的表达；(c)用第三个DNA表达结构转化或转染所说的宿主细胞，该DNA表达结构包含编码第四个选择标记蛋白的第四个选择标记基因和编码一个αd蛋白或其片段与一个转录激活蛋白的DNA结合结构域或所说的转录激活蛋白的反式作用结构域同框的αd融合蛋白基因；(d)用第四个DNA表达结构转化或转染所说的宿主细胞，该DNA表达结构包含编码第五个选择标记蛋白的第五个选择标记基因和编码一个αd结合蛋白或其结合片段与所说的转录激活蛋白的DNA结合结构域或所说的转录激活蛋白的反式作用结构域同框的第二个融合蛋白基因，该DNA结合结构域或反式作用结构域不包含在第一个融合蛋白基因中；(e)将所说的宿主细胞在允许所说的αd蛋白或其片段和αd结合蛋白或其结合片段表达的条件下培养，从而使所说的αd蛋白或其片段与αd结合蛋白或其结合片段相互作用，使所说的DNA结合结构域与所说的反式作用结构域接近，重组成所说的转录激活蛋白；所说的转录激活蛋白作用于所说的启动子，使所说的抑制蛋白的表达提高；所说的抑制蛋白与所说的启动子相互作用，使第三个选择标记蛋白不表达；(f)检测所说的选择基因表达的缺乏；(g)将所说的宿主细胞在存在一种所说的αd蛋白或其片段与所说的αd结合蛋白或其片段结合的待测抑制剂的条件下培养；(h)比较在存在和不存在所说的待测抑制剂的情况下，所说的选择标记蛋白的表达，其中所说的选择标记蛋白的表达降低说明待测抑制剂能够抑制所说的αd蛋白或其片段与所说的αd结合蛋白或其结合片段的结合，从而使所说的转录激活蛋白不能重组，所说的抑制蛋白的表达没有增加，而所说操纵子使所说的选择标记蛋白的表达增加。
本发明包括不同的基因和调节序列编码在单一DNA分子的宿主细胞以及一个或多个抑制基因、选择标记基因、αd融合蛋白基因和αd结合蛋白基因编码在不同DNA表达结构的宿主细胞。在一个优选的实施方案中，宿主细胞用编码抑制基因、选择标记基因、αd融合蛋白基因和αd融合结合蛋白基因的DNA转化或转染，上述基因均编码在不同的表达结构上。无论导入多少个DNA表达结构，每个转化或转染的DNA表达结构进一步包含一个选择标记基因序列，该选择标记基因序列的表达用来证明转化或转染已经确实完成。各转化或转染DNA表达结构上编码的选择标记基因与tet操纵子转录调节选择标记不同，其差别在于tet操纵子调节下的选择标记基因的表达在该优选实施方案中是核心的，即tet操纵子对选择标记基因表达的调控在宿主细胞中提供可以测量的表型改变，用以鉴定结合蛋白抑制剂。各转化或转染DNA表达结构上编码的选择标记基因是提供来作为各DNA表达结构成功转化或转染的决定物。本发明的优选宿主细胞包括命名为YI596和YI584的酿酒酵母(S.cerevisiae)，这两种菌在1996年8月13日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，12301 Parklawn Drive.Rockville.Maryland 20852，并分别被给予保藏号ATCC 74384和ATCC 74385。
本发明的宿主细胞包括任何能够表达如上所需的αd蛋白和αd结合蛋白以及能被前述调节异源蛋白表达的有功能的启动子和操纵子序列转化或转染的宿主细胞。在一个优选的实施方案中，宿主细胞可以是哺乳动物、昆虫或酵母来源的细胞。在此，最优选的细胞是酵母细胞。本发明的优选酵母细胞可以选自包括表1中介绍的酿酒酵母在内的各种菌株。其他的酵母种类包括粟酒裂殖酵母(S.pombe)、乳克鲁维酵母(K.lactis)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis)和白色假丝酵母(C.albicans)。本发明的优选哺乳动物类宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS、HeLa、3T3、CV1、LTK、293T3、Rat1、PC12或任何其他人或啮齿类来源的转染细胞系。优选的昆虫细胞系包括SF9细胞。
在一个优选的实施方案中，选择标记基因受一个操纵子调节，并编码一个所说的宿主细胞的营养所需的合成途径中的一个酶，这样，对于在缺乏所说的必需营养的培养基上生长的所说宿主细胞来说，所说的选择标记蛋白的表达是需要的。这样，在一个抑制蛋白与操纵子相互作用的优选实施方案中，选择标记基因的转录被下调，而宿主细胞通过其不能在缺乏必需营养的培养基上生长但能在含有该必需营养的培养基上生长来进行鉴定。在一个最优选的实施方案中，选择标记基因编码HIS3蛋白，用编码HIS3的DNA表达结构转化或转染的宿主细胞在存在或不含组氨酸的培养基上生长后进行选择。然而本发明可包括任何其他由一个操纵子调节的选择标记基因。其他基因包括，例如，URA3、LEU2、LYS2或那些编码任何产生可被完全地从生长培养基中去除的必需营养的各种途径中所需要的多种酶的基因。此外，传统的报告基因例如氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤火虫萤光素酶、β-半乳糖苷酶(β-gal)、分泌型碱性磷酸酶(SEAP)、绿荧光蛋白(GFP)、人生长激素(hGH)、β-葡萄醛酸酶、新霉素、潮霉素、胸苷激酶(TK)等也可用于本发明。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞包含一个编码四环素抗性蛋白的抑制蛋白基因，该蛋白作用于tet操纵子，使选择标记基因的表达降低。但本发明还包括tet抑制蛋白和操纵子以外的其他抑制蛋白和操纵子，例如大肠杆菌trp抑制蛋白和操纵子、his抑制蛋白和操纵子以及lac抑制蛋白和操纵子。
融合蛋白的DNA结合结构域和反式激活结构域组分可来自同一个转录因子或来自不同的转录因子，只要在αd和αd结合蛋白结合时使这两种结构域接近形成一个有功能的转录激活蛋白，高效率地提高抑制蛋白的表达。一个高效率的转录激活蛋白被定义为同时含有一个能显示与被识别的启动子序列高亲和力结合的DNA结合结构域和一个对表达抑制基因mRNA所需的转录机制蛋白有高亲和力的反式激活结构域。本发明的融合蛋白的DNA结合结构域组分可来自任何不同蛋白质，例如，LexA或Ga14。类似地，本发明的融合蛋白的反式激活组分可来自多种不同的转录激活蛋白，包括如Ga14或VP16。
本发明的调节抑制蛋白转录的启动子序列可以是任何能在所选宿主细胞中驱动转录的序列。启动子可以是特异地被本发明的所选DNA结合结构域识别的DNA序列，或任何其他能与融合蛋白的DNA结合结构域以高亲和力相互作用的DNA序列。在本发明的一个优选实施方案中，本发明启动子序列是一个HIS3或一个醇脱氢酶(ADH)启动子。这里最优选的一个实施方案中，本发明使用了一个ADH启动子。但本发明包括大量的其他启动子，包括例如，来自从编码HIS3、ADH、URA3、LEU2等基因的启动子序列。
本发明的方法包括任何所有的上述宿主中的变化。特别地，本发明包括下面的方法宿主细胞是一种酵母细胞，选择标记基因编码HIS3，选择标记基因的转录受tet操纵子的调节，抑制蛋白基因编码四环素抗性蛋白，四环素抗性蛋白的转录受HIS3启动子的调节，DNA结合结构域来自LexA，反式激活结构域来自VP16。在另一个实施方案中，本发明包括如下的方法宿主细胞是一种酵母细胞，选择标记基因编码HIS3，选择标记基因的转录受tet操纵子的调节，抑制蛋白基因编码四环素抗性蛋白，四环素抗性蛋白的转录受醇脱氢酶启动子的调节，DNA结合结构域来自LexA，反式激活结构域来自VP16。
在本发明的另外的实施方案中，宿主细胞是一种哺乳动物细胞，其改变包括，使用哺乳动物DNA表达结构来编码αd和αd结合融合蛋白基因、抑制基因、和选择标记基因，并使用编码抗生素或药物抗性标记的选择标记基因(即，新霉素、潮霉素、胸苷激酶)。
至少有三种不同类型的文库用来鉴定小分子的调节物。它们包括(1)化学文库，(2)天然产物文库，(3)含有随机肽、寡核苷酸或有机分子的组合文库。
化学文库由已知化合物或通过天然产物筛选而鉴定为“标的”的化合物的结构类似物组成。天然产物文库是微生物、动物、植物或水生有机体的提取物，上述有机体用来按下述方法制备用于筛选的混合物(I)从土壤、植物或水生微生物中发酵和抽提培养液，(II)抽提植物或水生有机体。组合文库由大量的肽、寡核苷酸或有机化合物的混合物组成。它们可以相对容易地用传统的自动合成方法、PCR、克隆或适当的合成方法进行制备。其中最令人感兴趣的是肽和寡核苷酸组合文库。其他令人感兴趣的文库包括肽、蛋白、肽模拟物、多平行合成收集物、重组和多肽文库。
本发明还包括生产针对αd的抗体的杂交瘤细胞系。生产能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞的技术在本领域是熟知的。杂交瘤细胞系可以在用纯化的αd、αd变体或能在其细胞外膜表面表达αd或其变体的细胞免疫一种动物后进行制备。免疫原细胞类型包括在体内表达αd的细胞或通常不能在体内表达αd的转染的原核细胞或真核细胞系。这里本发明优选的抗体由命名为169A、169B、170D、170F、170E、170X、170H、188A、188B、188C、188E、188F、188G、188I、188J、188K、188L、188M、188N、188P、188R、188T、195A、195C、195D、195E、195H、197A-1、197A-2、197A-3、197A-4、199A、199H、199M、205A、205C、205E、212A、212D、217G、217H、217I、217K、217L、217M、226A、226B、226C、226D、226E、226F、226G、226H、226I、236A、236B、236C、236F、236G、236H、236I、236K、237L、237L、236M、240F、240G和240H的杂交瘤分泌。
通过αdDNA和氨基酸序列公开而提供的信息的价值也被指明。在一个实施例系列中，公开的αdcDNA序列使分离人αd基因组序列包括基因组序列的转录控制元件成为可能。本发明还包括αd等位变体和异源种类(例如大鼠和小鼠)的DNA的鉴定。人αd基因组DNA和异源种属的DNA可以用标准的DNA/DNA杂交技术，在适度严格的条件下，使用αdcDNA序列作为探针对一个合适的文库进行筛选来完成。另外，使用基于已知的cDNA序列设计的寡核苷酸引物进行聚合酶链反应(PCR)也可用来扩增和鉴定基因组αdDNA序列。编码αd多肽包括其片段和其他变体的合成DNA可用传统的合成方法进行生产。
本发明的DNA序列信息还可用来通过同源重组或“敲除”策略(见诸如，Kapecchi，《科学》244卷，1288-1292页(1989))产生不能表达有功能的αd多肽或表达一种变异的αd多肽的啮齿类动物。这样的啮齿类动物可用作体内研究αd和αd调节剂的模型。
本发明的DNA和氨基酸序列还使分析αd中活跃地参与反受体结合的表位以及调节而不是活跃地参与结合的表位成为可能。参与膜信号传导的表位的鉴定也包含在本发明的范围内。
本发明的DNA还可用来检测表达αd多肽的细胞类型。使用αdDNA检测αdRNA的标准DNA/RNA杂交技术可用来确定一种细胞中αd转录的组成水平以及应答于内部或外部试剂的转录水平改变。而接着，能改变αd转录或翻译的试剂的鉴定又能用来评估其潜在的治疗或预防价值。本发明的DNA还可以用αdDNA对细胞RNA进行原位杂交来确定在复杂的细胞群体和组织中αd特异性信息的细胞定位。
本发明的DNA还可用来鉴定显示与人αd序列同源的非人多核苷酸序列。获得了非人αdDNA序列就可建立人系统的动物模型(包括，例如，转基因模型)。
作为本发明的另一个方面，针对αd的单克隆抗体和多克隆抗体可用于将αd定位于亚细胞腔体或组织中单个的细胞的免疫组化分析。这类免疫组化分析在与原位杂交联用来定位αd基因的αdmRNA和多肽产物两者时特别有用。
鉴定能表达αd的细胞类型对发展治疗性和预防性试剂有显著的衍生效果。预期本发明的αd相关产物可用于治疗在其疾病过程中巨噬细胞为基本因素的疾病。在本领域中，许多与巨噬细胞活性相关的病理状态的动物模型已经得到介绍。例如，在小鼠中，Jutila等，《白细胞生物学杂志》54卷，30-39页(1993)，报道了巨噬细胞聚集在慢性和急性炎症的位点。在大鼠中，Adams等[《移植》53卷，1115-1119(1992)和《移植》56卷，794-799页(1993)]介绍了一个向异性腹部心脏同种移植后的移植动脉硬化的模型。Rosenfeld等(《动脉粥样硬化》7卷，9-23页(1987)和《动脉粥样硬化》7卷，24-34页(1987))介绍了用一种甾醇添加剂食物喂养在兔中诱导动脉粥样硬化。Hanenberg等(《糖尿病》32卷，126-134页(1989))报告了BB大鼠中胰岛素依赖型糖尿病的自发发展。Yamada等(《胃肠病学》104卷，759-771页(1993))介绍了在大鼠中注射链球菌肽聚糖-多糖多聚体后诱导炎症性肠道疾病、慢性肉牙炎。Cromartie等(《实验医学杂志》146卷，1585-1602页(1977))和Schwab等(《感染与免疫》59卷，4436-4442页(1991))报道了在大鼠中注射链球菌细胞壁蛋白导致特征为外周关节炎症及随后关节损伤的关节炎。最后，Huitinga等(《欧洲免疫学杂志》23卷，709-715页(1993))介绍了Lewis大鼠的实验型过敏性脑脊髓炎，这是多发性硬化的一种模型。在上述每种模型中，αd抗体、其他αd结合蛋白或αd的可溶性形式被用来缓解疾病状态，推测是通过使巨噬细胞活性失活。
本发明提供治疗这些疾病和其他疾病状态的药用组合物。药用组合物的设计目的是抑制αd与其配体之间的相互作用，包括αd的各种可溶性和膜结合形式(包括完整的αd多肽或其活跃地参与αd结合的片段)、可溶性和膜结合形式的αd结合蛋白(包括抗体、配体等)、αd结合活性的细胞内或细胞外调节物、和/或αd和/或αd配体多肽表达的调节物，包括转录、翻译、翻译后加工和/或细胞内运输的调节物。
本发明还包括治疗含有αd结合或表达αd的细胞局部集聚的疾病的方法，在该方法中，向患有所说疾病的病人提供一定数量的本发明的药物组合物，其数量足够调节αd结合水平或调节表达αd的细胞类型的集聚。本发明的治疗方法应用于以下疾病状态，包括但不限于I型糖尿病、动脉粥样硬化、多发性硬化、哮喘、牛皮癣、肺炎、急性呼吸窘迫综合征和类风湿关节炎。附图简述本发明的大量其他方面和优点将用下面的描述显示，对


如下图1A至1D包含人氨基酸序列CD11b(SEQ ID NO3)、CD11c(SEQ ID NO4)、和αd(SEQ ID NO2)的一个排列比较。发明详述本发明用下列与从一个人脾细胞cDNA文库中分离编码αd的cDNA有关的实施例来说明。更具体地说，实施例1说明了使用抗犬αTM1抗体来设法检测一种同源的人蛋白。实施例2详细介绍了纯化犬αTM1和多肽的N末端测序来设计PCR扩增犬αTM1基因的寡核苷酸引物。实施例3谈到了大量制备用于内部测序的犬αTM1，用来设计其它PCR引物。实施例4介绍了使用PCR和内部引物来扩增犬αTM1基因的一个片段。实施例5谈到了编码人αd的cDNA序列的克隆。实施例6介绍了表达αdmRNA的人组织和细胞的Northern印迹杂交。实施例7详细介绍了人αd表达质粒的构建和用获得的质粒转染COS细胞。实施例8谈到了转染COS细胞中αd表达的ELISA分析。实施例9介绍了用人αd表达质粒转染的COS细胞的FACS分析。实施例10谈到了CD18与共转染的COS细胞中αd结合的免疫沉淀。实施例11涉及αd表达结构在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定转染。实施例12谈到了αdCD18依赖的与细胞间黏附分子ICAM-R、一种ICAM-R突变蛋白和补体因子iC3b的结合。实施例13介绍了鉴定αd配体/抗配体相互作用的抑制剂或增强剂(即调节物)的闪烁亲近筛选试验。实施例14谈到了构建编码αd可溶性形式的表达质粒的构建和表达产物的结合分析。实施例15涉及针对αd的多克隆血清和单克隆抗体的制备。实施例16介绍了使用αd单克隆抗体的流式细胞仪分析。实施例17谈到了αd在人单核细胞上的表达。实施例18介绍了使用抗αd多克隆血清分析αd组织分布、αd在外周血淋巴细胞上的表达、在炎症和非炎症滑膜中的表达，在来自乳腺癌病人的病态肺和肝、人骨髓和PBMC中的表达。实施例19谈到了αd在体内和体外表达的上调。实施例20介绍了显示与人αd基因序列同源的大鼠cDNA序列的分离。实施例21谈到了大鼠αdmRNA的组织特异性表达。实施例22涉及全长的大鼠αd表达质粒、大鼠αdI结构域表达质粒包括I结构域/IgG融合蛋白的构建，针对全长和I结构域融合蛋白的单克隆抗体的制备，和针对与人IgG4融合的大鼠αdI结构域序列的多克隆抗血清的制备。实施例23介绍了单克隆抗体199M的特异性。实施例24显示了使用表达大鼠αd的巨噬细胞的T细胞增殖试验的结果。实施例25介绍了来自骨髓的大鼠αd的免疫沉淀。实施例26介绍了大鼠αd在多种动物模型中的表达。实施例27涉及一种使用αd单克隆抗体抑制NK-肿瘤细胞诱导的靶细胞裂解的试验。实施例28谈到了显示与人αd基因序列同源的小鼠cDNA序列的分离。实施例29介绍了另外的用于证明序列分析的小鼠αdcDNA克隆的分离。实施例30涉及多种小鼠组织的原位杂交分析，来确定人αd推定小鼠同源物的组织和细胞特异性表达。实施例31介绍编码人αd推定小鼠同源物的表达结构的制备。实施例32谈到了“敲除”小鼠的设计，其中编码人αd推定小鼠同源物的基因被破坏。实施例33介绍了显示与人αd同源的兔cDNA克隆的分离。实施例35涉及单克隆抗体217L识别的抗原的表征。实施例36介绍了人疾病状态的动物模型，其中分析了αd调节的治疗可能性。实施例37介绍了αd在动物模型疾病状态中的表达。实施例1检测犬αTM1的人同源物的尝试检测针对犬αTM1的单克隆抗体Ca11.8H2(Moore，等上文)对人外周血淋巴细胞的交叉反应，来设法鉴定一种犬αTM1的人同源物。细胞制备物(通常为1×106细胞)与未稀释的杂交瘤上清或一种纯化的鼠IgG阴性的对照抗体(10ug/ml)在冰上于存在0.1％叠氮化钠的条件下温育。结合的单克隆抗体用随后与6ug/ml的FITC接合的马抗鼠IgG(Vector Laboratories，Burlingame，CA)温育来进行检测。染色的细胞用磷酸缓冲盐水(PBS)中的2％ w/v低聚甲醛进行固定，并用Facstar Plus荧光激活细胞分选仪(Becton Dickinson，MountainView，CA)进行分析。通常，用对数放大分析10,000个细胞来测量荧光密度。
结果显示，Ca11.8H2不与人外周血淋巴细胞表面表达的蛋白交叉反应，而对照细胞赘生性犬外周血淋巴细胞基本上都是犬αTM1阳性。
由于针对犬α亚单位的单克隆抗体Ca11.8H2不与人同源物交叉反应，分离犬αTM1DNA对于分离可能存在的对应的人基因来说是据信是必要的。实施例2亲和纯化犬αTM1用于N末端测序亲和纯化犬αTM1来测定N末端氨基酸序列，用于寡核苷酸探针/引物设计。简而言之，将抗αTM1单克隆抗体Ca11.8H2偶联到Affigel 10色谱树脂上(BioRad，Hercules，CA)，蛋白通过特异性的蛋白-蛋白相互作用进行分离。根据BioRad推荐的程序，将抗体按约5mg抗体每ml树脂的浓度接合到树脂上。接合反应后，去除多余的抗体，树脂用三倍体积的0.1M的乙醇胺进行封闭。然后用三十倍体积的磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤树脂。
25克的一只狗脾脏在250ml 25mM Tris-HCl、pH8.0、含有0.32M蔗糖并含有蛋白酶抑制剂的缓冲液中匀浆。在1000g离心15分钟使核和细胞残渣沉淀。在100,000g离心30分钟使膜从上清中沉淀。将膜沉淀在200ml裂解缓冲液(50mM NaCl、50mM硼酸盐、pH8.0、2％ NP-40)中重新悬浮，并在冰上温育1小时。然后在100,000g离心60分钟沉淀不溶物质。将10毫升清亮的上清转入含有0.5ml上述Ca11.8H2接合的Affigel 10树脂的一个15ml的聚丙烯试管中。然后将试管在4℃旋转保温过夜，接着用50倍体积的D-PBS洗涤树脂。然后将树脂转入一个微量离心管中，在1ml含有0.1MTris-HCl、pH6.8、2％ SDS、20％甘油和0.002％溴酚蓝的Laemmli(非还原性)样品缓冲液中煮沸10分钟。离心沉淀树脂并弃去，上清用1/15体积的β-巯基乙醇(Sigma，St.Louis，MO)处理，并上7％聚丙烯酰胺凝胶。分离的蛋白按下述方法转移到Immobilon PVDF膜(Millipore，Bedford，MA)上。
凝胶在去离子的、Millipore过滤的水中洗涤一次，在含10％甲醇的10mM 3-[环己氨基]-1-丙磺酸(CAPS)、pH10.5转移缓冲液中平衡15-45分钟。Immobilon膜用甲醇浸湿，并用过滤水漂洗，然后在CAPS转移缓冲液中平衡15-30分钟。初步的转移用BioRad转移装置在70伏进行3小时。转移后移去Immobilon膜，并在过滤的0.1％R250考马斯染料中染色10分钟。膜在50％甲醇/10％乙酸中脱色三次，每次10分钟。脱色后，膜在过滤水中洗涤，并空气干燥。
检测到了约150kD、95kD、50kD和30kD的蛋白条带。推测50kD和30kD条带是抗体污染产生的。然后对150kD和95kD带进行N末端测序，但95kD蛋白是封闭的，阻碍了测序。从膜上切下150kD蛋白带，直接用Applied Biosystems(Foster City，CA)Model 473A蛋白测序仪按照厂商的指示进行测序。所获得的氨基酸序列采用单字母氨基酸命名列于SEQ ID NO5。
FNLDVEEPMVFQ (SEQ ID NO5)所鉴定的序列包含整合素家族α亚单位的FNLD序列特征(Tamura等《细胞生物学杂志》111卷，1593-1604页(1990))。引物设计和设法扩增犬αTM1的序列根据N末端序列信息，设计了三个用于杂交的寡核苷酸探针a)“Tommer”，一个完全简并的寡核苷酸；b)“Patmer”，一个部分简并的寡核苷酸；c)“Guesser”一个基于哺乳动物密码子使用的非简并性寡核苷酸。这些探针分别列于下面的SEQ ID NO6、7和8。这里以及本文的其他核苷酸序列的核酸符号符合37 C.F.R §1.882。5’-TTYAAYYTGGAYGTNGARGARCCNATGGTNTTYCA-3’ (SEQ ID NO6)5’-TTCAACCTGGACGTGGAGGAGCCCATGGTGTTCCAA-3’ (SEQ ID NO7)5’-TTCAACCTGGACGTNGAASANCCCATGGTCTTCCAA-3’ (SEQ ID NO8)基于序列数据，使用这些寡核苷酸在几种低严格条件下对一个克隆到λZAP(Stratagene，La Jolla，CA)的犬脾/外周血巨噬细胞cDNA文库进行杂交没有检测到相关的克隆。
根据推导的N末端序列随后设计了四个其他的寡核苷酸引物来设法从上面介绍的Stratagene文库的平板裂解物中纯化的噬菌体文库DNA用PCR扩增犬αTM1序列，这四个引物命名为5’Deg、5’Spec、3’Deg和3’Spec(分别列于SEQ ID NO9、10、11和12，其中Deg表示简并，Spec表示非简并)。5’-TTYAAYYTNGAYGTNGARGARCC-3’ (SEQ ID NO9)5’-TTYAAYYTGGACGTNGAAGA-3’ (SEQ ID NO10)5’-TGRAANACCATNGGYTC-3’ (SEQ ID NO11)5’-TTGGAAGACCATNGGYTC-3’(SEQ ID NO12)αTM1寡核苷酸引物与T3或T7载体引物匹配，T3和T7引物分别列于SEQ ID NO13和SEQ ID NO14，它们能与λZAP中发现的Bluescript噬菌粒中的多接头区域的两翼序列杂交。5’-ATTAACCCTCACTAAAG-3’ (SEQ ID NO13)5’-AATACGACTCACTATAG-3’ (SEQ ID NO14)PCR扩增在含镁并含150ng文库DNA、1ug每种引物、200uMdNTPs、和2.5单位的Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)的Taq缓冲液(Boehringer Mannheim，indianapolis，IN)中进行，产物在含有0.25 ug/ml溴化乙啶的Tris-乙酸盐-EDTA(TAE)缓冲液中用1％琼脂糖凝胶电泳进行分离。DNA通过在10×SSPE中吸收过夜转移到Hybond膜(Amersham，Arlington Heights，IL)上，转移之后，固化的DNA用含有0.6M NaCl的0.5M NaOH变性，用含1.5M NaCl的Tris-HCl、pH8.0中和，在用Stratalinker(Stratagene)交联装置进行紫外交联前用2×SSPE洗涤。将膜在预杂交缓冲液(5×SSPE、4×Denhardts、0.8％SDS、30％甲醛)中50℃搅拌温育2小时。
寡核苷酸探针5’Deg、5’Spec、3’Deg和3’Spec(分别为SEQ IDNO9、10、11和12)在用含有100-300uCi γP32-dATP和1-3单位的多核苷酸激酶的Boehringer Mannheim激酶缓冲液中于37℃标记1-3小时。未整合的标记用Sephadex G-25 fine(Pharmacia，Piscataway，NJ)色谱使用10mM Tris-HCl、pH8.0、1mM EDTA(TE)缓冲液移去，流出液直接加入预杂交溶液。膜用探针在42℃处理16小时并搅拌和反复洗涤，最后用1×SSPE/0.1％SDS在50℃的严格条件下洗涤15分钟。印迹随后在Kodak X-Omat AR胶片上-80℃曝光1-4小时。
寡核苷酸5’Deg、5’Spec、3’Deg和3’Spec仅与来自用它们作为引物的反应的PCR产物杂交，而不能如预期的那样与不用它们作为引物的反应的PCR产物杂交。因此，结论是，没有PCR产物是αTM1特异的，因为没有产物能与所有的适当引物杂交。实施例3犬αTM1的大量亲和纯化用于内部测序为提供用于引物设计的其它氨基酸序列，纯化犬αTM1用于内部测序。用三份冷冻的脾(每份约50克)和来自成年犬的两个部分脾的冷冻细胞来制备内部测序的蛋白。50克脾在200-300ml硼酸缓冲液中用Waring搅拌器匀浆。匀浆物质用1倍体积含有4％NP-40的缓冲液稀释，然后将混合物温和搅拌至少1小时。在2000g离心20分钟清除所产生的裂解物中的大量残渣，然后用Corning(Corning，NY)预滤器或Corning0.8微滤器过滤，裂解物进一步用Corning0.4微滤膜系统过滤使之澄清。
脾裂解物和实施例2介绍的抗体接合的Affigel10树脂按150∶1的体积比组合成100ml小份，在4℃旋转温育过夜。在1000g离心5分钟移去裂解物，与更多的抗体接合的Affigel 10树脂混合并按上述温育过夜。然后将吸附的树脂小份合并并与50倍体积的D-PBS/0.1％ Tween 20洗涤，然后将树脂转入50ml Biorad柱。吸附的蛋白用3-5倍体积的0.1M甘氨酸(pH2.5)从树脂中洗脱；收集约900ul的各级份，并用100ul 1M Tris缓冲液、pH8.0中和，从每个级份中移取15ul，在等体积的含有1/15体积1M二硫苏糖醇的2XLaemmli样品缓冲液中煮沸。将这些样品在8％ Novex(San Diego，CA)聚丙烯酰胺凝胶上电泳。使用Daiichi试剂盒(Enprotech，Natick，MA)按厂商推荐的程序用考马斯染料或银染显色。将含有最大量蛋白的级份混合并真空浓缩。剩余的溶液用还原性Laemmli样品缓冲液进行50％稀释，并在Tris-甘氨酸/SDS缓冲液中上1.5mm 7％聚丙烯酰胺凝胶。使用Hoefer转移装置按实施例2中介绍的程序将蛋白从凝胶转移到Immobilon膜上。
从10 PVDF膜上切下对应于犬αTM1的蛋白带，并获得了47ug的总蛋白，将带在4ml 50％的甲醇中脱色5分钟，空气干燥，并切成1×2mm的小片。将膜小片浸入2ml 95％丙酮，4℃、30分钟，并不时震荡，然后空气干燥。
在对膜结合的蛋白进行蛋白裂解前，将3mg的溴化氰(CNBr)(Pierce，Rockford，IL)溶解于1.25ml 70％的甲酸中。然后将此溶液加入含有PVDF膜小片的试管中，在暗处室温温育24小时。然后将上清(S1)移入另一个试管，用0.25ml 70％的甲酸洗涤膜小片。将此上清(S2)移出，加进前面的上清(S1)中。在混合的上清(S1和S2)中加入2毫升Milli Q水，然后将溶液冻干。将PVDF膜小片在氮气中干燥，用1.25ml 60％的乙腈、0.1％四氟乙酸(TFA)在42℃再抽提17小时。将上清(S3)移出，膜小片用1.0ml 80％的乙腈、0.08％的TFA在42℃再抽提1小时。将此上清与前面的上清(S1、S2和S3)混合，真空干燥。
然后将干燥的CNBr片段溶解于63ul8M尿素、0.4M NH4HCO3。将片段在5ul 45mM二硫苏糖醇(DTT)中还原，并接着在50℃温育15分钟。然后将溶液冷却至室温，并加入5ul 100mM碘乙酰胺(Sigma，St Louis，MO)将片段碱裂解。在室温温育15分钟后，样品用187ul Milli Q水稀释至尿素终浓度为2.0 。然后按酶与蛋白1∶25(w∶w)的比例加入胰蛋白酶(Worthington，Freehold，NJ)，蛋白在37℃消化24小时。加入30ul TFA终止消化。
然后在Waters 625 LC系统(Millipore，Milford，MA)上用高效液相色谱(HPLC)将蛋白片段分开，使用在0.05％TFA和HPLC水(缓冲液A)平衡的2.1×250mm 5micron Vydac C-18柱(Vydac，Hesperia，MA)。肽用0.04％TFA中浓度不断增加的80％乙腈(缓冲液B)进行洗脱，38-75％梯度的缓冲液B洗脱65-95分钟，75-98％的缓冲液B洗脱95-105分钟。肽以0.2ml/分钟的流速分级，并在210nm检测。
分级之后，肽的氨基酸序列用自动Edman降解法进行分析。序列分析在Applied Biosystems Model 437A蛋白测序仪上使用厂商的标准循环进行，并使用Model 610A Data Analysis软件程序版本1.2.1。所有的测序试剂由Applied Biosystems提供。8个内部片段中7个的氨基酸序列列于下面，其中“X”表示氨基酸不确定。VFQEXGAGFGQ(SEQ ID NO15)LYDXVAATGLXQPI (SEQ ID NO16)PLEYXDVIPQAE (SEQ ID NO17)FQEGFSXVLX (SEQ ID NO18)TSPTFIXMSQENVD (SEQ ID NO19)LVVGAPLEVVAVXQTGR (SEQ ID NO20)LDXKPXDTA (SEQ ID NO21)引物设计将一个获得的内部氨基酸序列(列于SEQ ID NO22)随后用于设计一个完全简并的寡核苷酸引物，将其命名为p4(R)，列于SEQ IDNO23。FGEQFSE(SEQ ID NO22)5’-RAANCCYTCYTGRAAACTYTC-3’ (SEQ ID NO23)实施例4一个犬αTM1片段的PCR克隆犬αTM1基因的5’部分用PCR从双链的犬脾cDNA中扩增。制备双链的犬脾cDNA将1克来自幼犬脾的冷冻物质浸入干冰上的液氮中，在20mlRNA-Stat 60缓冲液(Tel-Test B Inc，Friendswood，TX)中匀浆。加入4ml氯仿，溶液在12,000g离心15分钟进行抽提。RNA用10ml乙醇从水相中沉淀。然后在Dynal Oligo dT Dynabeads(Dynal，Oslo，Norway)上选择Poly A+RNA。将5小份的100ug总RNA合并并用等体积的2X结合缓冲液(20mM Tris-HCl、pH7.5、1.0M LiCl、1mMEDTA、0.1％SDS)稀释。然后将RNA与Oligo dT Dynabeads(所有的样品用1.0ml或5mg珠)一起温育5分钟。按照厂商推荐的程序，在用2mM EDTA、pH7.5洗脱Poly A+mRNA前，用含有10mMTris-HCl、pH7.5、0.15M LiCl、1mM EDTA和0.1％SDS的缓冲液洗涤珠。然后使用洗脱的Poly A+mRNA和Boehringer Mannheim cDNASynthesis Kit，按照厂商推荐的程序，制备双链的cDNA。部分犬αTM1cDNA的分离在一个标准的PCR反应中使用寡核苷酸引物5’Deg(SEQ ID NO9)和p4(R)(SEQ ID NO23)，使用150ng双链cDNA、500ng每种引物、200uM dNTPs、和1.5单位的Taq聚合酶(BoehringerMannheim)，在含镁的Taq缓冲液(Boehringer Mannheim)中进行。将获得的产物(初次反应的1ul)加入用同样引物的第二轮反应中以增加产物数量。将此条带从1％琼脂糖凝胶中洗脱，在65℃于10mMTris-HCl、pH8.0、1mM EDTA、1.5mM NaCl的缓冲液中转至Schleicher& Schuell(Keene，NH)NA45纸上。并使用TA克隆试剂盒(Invitrogen)按照厂商推荐的程序，连接到pCRtmII载体(Invirtogen，San Diego，CA)中。连接混合物电转化至XL-1 Blue细菌(Stratagene)中。一个克隆2.7被确定含有对应于αTM1肽序列的序列，该序列在引物设计中没有使用。
测序用Applied Biosystems 373A DNA测序仪(Foster City，CA)、使用双脱氧终止循环测序试剂盒(ABI)进行，在该试剂盒中，荧光标记的dNTPs按如下方法在一个不对称的PCR反应掺入(McCabe，“用不对称PCR制备单链DNA”，《PCR方法方法和应用指南》，Innis等(编辑)76-83页，Academic PressNew York(1990))。样品在96℃放置4分钟，然后进行下列步骤的25个循环96℃，15秒、50℃，1秒、60℃，4分钟。包括图形和文本文件的测序数据自动下载到计算机上的样品文件中。克隆2.7的整个插入子的序列列于SEQID NO24。
设法从Stratagene文库(如实施例2介绍)分离全长的犬αTM1cDNA没有成功。以克隆2.7作为探针、使用30％甲醛的低严格条件的杂交，对约1×106噬菌斑进行筛选，没有获得阳性克隆。使用来自克隆2.7的特异性寡核苷酸或与基于保守的α亚单位基元GFFKR的简并寡核苷酸(Tamura等，上文)匹配的基于其他肽片段的氨基酸序列的简并引物，设法扩增克隆2.7中显示的序列的相关下游序列，也没有成功。实施例5推定的犬αTM1的人同源物的克隆为设法分离与犬αTM1同源的人序列，使用来自克隆2.7的约1kb犬αTM1片段作为探针。探针在实施例2介绍的条件下使用NT2(列于SEQ ID NO25)和p4(R)(SEQ ID NO23)引物，用PCR进行制备。5’-GTNTTYCARGARGAYGG-3’(SEQ ID NO25)PCR产物用Qiagen(Chatsworth，GA)Quick Spin试剂盒按厂商推荐的程序进行纯化。纯化的DNA(200ng)用Boehinger Mannheim随机引物标记试剂盒按厂商推荐的程序，用200 uCi α32P dCTP进行标记。未掺入的同位素用Sephadex G25(fine)gravity色谱去除。探针在使用前用0.2N NaOH变性，并用0.4M Tris-HCl、pH8.0中和。
制备pCDNA/Amp(Invitrogen San Diego，CA)中的人脾cDNA文库的Hybond滤纸(Amersham)上菌落提呈物。滤纸先按实施例2介绍的方法变性和中和，接着在含有30％甲醛的预杂交液(8ml/滤纸)中在50℃温育2小时，并温和搅拌。将如上介绍的标记探针加入此溶液中，并与滤纸一起在42℃温育14小时。滤纸在2 X SSC/0.1％SDS中在37℃洗涤两次，在2 X SSC/0.1％SDS中在50℃洗涤两次。最后的严格洗涤是在65℃、1 X SSC/0.1％SDS中洗涤两次(1 X SSC是150mM NaCl、15mM柠檬酸钠、pH7.0)，滤纸用增感屏在Kodak X-OmatAR胶片上曝光6小时。将在复制提呈物上有信号的菌落在含镁的LB培养基(LBM)/羧苄青霉素平板上划线，并在37℃温育过夜。所获得的划线菌落用Hybond滤纸提呈，并将这些滤纸按上述方法进行处理。滤纸在更严格的条件下与按上述方法标记的、来自克隆2.7的1kb探针在50％的甲酰胺杂交溶液中在50℃杂交3小时。探针处理的滤纸用0.1 X SSC/0.1％SDS、65℃的最终严格条件进行洗涤，并用增感屏在-80℃在Kodak X-Omat AR胶片上曝光2.5小时。鉴定阳性克隆，并在LBM/羧苄青霉素培养基中培养过夜。使用Promega Wizardminiprep kit按照厂商推荐的程序由培养物制备DNA，并对所获得的DNA进行测序。
初步筛选获得了18个克隆，而在更严格的杂交条件下的第二轮筛选产生了一个阳性克隆，将其命名为19A2。人αd克隆19A2的DNA序列和推导的氨基酸序列分别列于SEQ ID NO1和2。人αdcDNA和预测的多肽的特征克隆19A2包含成熟蛋白的全部编码区域，加上48个碱基(16个氨基酸残基)的5’上游信号序列和241个碱基的3’非翻译序列，该序列不以聚腺苷酸化的序列终止。成熟蛋白的核心分子量预计为125kD左右。其胞外结构域预计大约包含SEQ ID NO2的17至1108氨基酸残基。该胞外结构域紧接着一段与人CD11c跨膜区域同源的约20个氨基酸区域(SEQ ID NO2的残基1109-1128)。胞内结构域含有约30个氨基酸(大约SEQ ID NO2的残基1129至1161)。该蛋白还含有一个与CD11a、CD11b和CD11c(Larson和Springer，上文)、αE(Shaw等，《生物化学杂志》269卷，6016-6025页(1994))和VLA-1和VLA-2(Tamura等，上文)中共同的I(插入子)结构域同源的约202个氨基酸的区域(残基150至352左右)。其他整合素中的I结构域已经证明参与ICAM结合(Landis等，《细胞生物学杂志》120卷，1519-1527页(1993)；Diamond等，《细胞生物学杂志》120卷，1031-1043页(1993))，这说明αd也可以与表面分子的ICAM家族的成员结合。该区域还没有证明存在于其他整合素亚单位。
αd的推导的氨基酸序列显示与CD11a、CD11b和CD11c的序列分别约有36％、60％和66％的同源性。图1显示了CD11b(SEQ ID NO3)、CD11c(SEQ ID NO4)和αd(SEQ ID NO2)的氨基酸序列排列比较。
β2整合素α亚单位的细胞内结构域通常在同一物种中也各不相同，但个别α亚单位在物种间也显示高度的同源性。与这些发现一致，αd的细胞内区域明显地与CD11a、CD11b和CD11c不同，除了已经证明在所有的α整合素中保守的膜亲和GFFKR氨基酸序列之外(Rojiani等，《生物化学》30卷，9859-9866页(1991))。因为整合素的细胞内结构域涉及“内外”信号传导和亲和性调节(Lands等，上文)，因此αd可能与和CD11a、CD11b和CD11c相互作用的不同细胞质分子相互作用，因而参与与其他β2整合素不同的信号途径。
αd的细胞外结构域含有保守的与I结构域邻接的保守DGSGS氨基酸序列，在CD11b中DGSGS序列是配体相互作用所必需的金属结合区域(Michishita等《细胞》72卷，857-867页(1993))。CD11b和CD11c的三个额外的推测阳离子结合位点在αd序列中是保守的，在克隆19A2(SEQ ID NO1)中为氨基酸465-474、518-527和592-600。其αdI结构域与CD11a、CD11b和CD11c的相应区域的同源性分别为36％、62％和57％。这个区域的低序列同源性表明，αd可能与一套与其他已知的β2整合素相互作用的蛋白不同的细胞外蛋白相互作用。另外，αd对其他已知β2整合素配体如ICAM-1、ICAM-2和/或ICAM-R的亲和性，可能与其他β2整合素/ICAM相互作用中证明的亲和性不同(见实施例12)。分离另外的人αdcDNA克隆用于序列证明为证明编码人αd的DNA序列，用杂交的方法从一个pcDNA/Amp中的人脾Oligo dt-primed cDNA文库(Invitrogen)(实施例5中介绍)中分离另外的人cDNA。该文库是通过选择琼脂糖凝胶电泳上长度大于3kb的cDNA构建的。杂交所用的探针来自下面介绍的αd的5’区域。杂交条件与上述初步分离人αd克隆的条件相同。只有下面的杂交后处理有所不同，滤纸在2 X SSC/0.1％SDS中在室温洗涤两次，在2X SSC/0.1％SDS在42℃洗涤一次。滤纸用Kodak X-Omat AR胶片曝光过夜。
5’αd杂交探针用PCR从19A2克隆中制备，PCR使用引物CD11c 5’For(SEQ ID NO94)和CD11c 5’Rev(SEQ ID NO95)在下面的条件下进行。样品在94℃放置4分钟，然后进行下列步骤的30个循环i)94℃，15秒；ii)50℃，30秒、iii)72℃，1分钟。使用Perkin-Elmer9600热循环仪。CD11c 5’For(5’)CTGGTCTGGAGGTGCCTTCCTG(3’) (SEQ ID NO94)CD11c 5’Rev(5’)CCTGAGCAGGAGCACCTGGCC(3’) (SEQ ID NO95)扩增产物使用BioRad(Hercules，CA)Prep-A-Gene kit按照厂商推荐的程序进行纯化。所获得的5’αd探针为约720碱基长，对应于SEQ ID NO1的1121-1839核苷酸区域。纯化的DNA(约50ng)用Boehinger Mannheim(Indianapolis，Indiana)随机引物标记试剂盒按厂商推荐的程序，用32PdCTP进行标记。未掺入的同位素用Centrisep自旋柱(Princeton Separations，Adelphia，NJ)按照厂商推荐的程序去除。将标记的探针加至含有45％甲酰胺的预杂交溶液中的滤纸中，在50℃温育反应过夜。温育后，滤纸按上面的介绍进行洗涤。
13个克隆在复制提呈物上有信号。将阳性克隆从母板上挑出，在LBM和羧苄青霉素(100ug/ml)稀释，按不同的稀释度铺于Hybond(Amersham)滤纸。复制膜用与初次杂交相同的溶液进行杂交，在杂交后，滤纸用2 X SSC/0.1％SDS、42℃的最终严格条件进行洗涤，并在胶片上曝光。
初次鉴定的13个阳性克隆有10个在第二轮筛选中被证实。在这10个克隆中，2个克隆(命名为A7.Q和A8.Q)被测序，并确定其编码人αd。克隆A7.Q被发现长约2.5kb，包括5’前导序列、部分编码区域和额外的60个碱基的5’非翻译区。该不完全的编码区被确定是相当于SEQ ID NO1的2152核苷酸的内含子区域错误剪接的结果。A8.Q被确定长约4kb，跨越整个αd编码区，还含有相当于SEQ ID NO1的305碱基的内含子区域。与首次分离的αd克隆(SEQ ID NO1)比较，有一个差异被发现，即A7.Q和A8.Q均被确定在碱基1495处有一个三碱基CAG密码子插入。克隆A7.Q和A8.Q的序列分别列于SEQ IDNO96和97，由克隆A7.Q和A8.Q编辑的人序列以及相应的推导氨基酸序列分别列于SEQ ID NO98和99。实施例6组织中人αd表达的Northern分析为测定αd相对表达水平和组织特异性，使用来自克隆19A2的片段作为探针进行Northern分析。将来自各人组织或培养细胞系的约10ug总RNA在存在1ug溴化乙啶的情况下上甲醛琼脂糖凝胶。在100V电泳4小时后，将RNA转移到在10 X SSC中浸泡过夜的硝酸纤维膜(Schleicher & Schuell)上。将膜在真空中80℃烘烤1.5小时。用含有50％甲酰胺的3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)的预杂交溶液在42℃封闭膜3小时。克隆19A2的片段使用Boehringer Mannheim随机引物试剂盒按照厂商的指示，用αP32dCTP和αP32dTTP两者进行标记。未掺入的标记在TE缓冲液中用Sephadex G25柱移去。膜按1.5×106/ml预杂交缓冲液的量用探针进行处理。然后将印迹在室温用2 XSSC/0.1％SDS、在42℃用2 X SSC/0.1％SDS、在50℃用2 XSSC/0.1％SDS、在50℃用1 X SSC/0.1％SDS、在50℃用0.5 XSSC/0.1％SDS、在50℃用0.1 X SSC/0.1％SDS连续洗涤。然后将印迹用胶片曝光19小时。
使用来自克隆19A2的一个BstXI片段(相当于SEQ ID NO1中2011至3388核苷酸)的杂交揭示出在肝、胎盘、胸腺和扁桃体总RNA中在约5kb范围内有弱信号；在肾、脑或心脏样品中没有发现信号。如用溴化乙啶染色测定的，肾样品带中存在的RNA量最少。
在使用克隆19A2的第二个片段(包含SEQ ID NO1的碱基500至2100区域)时，在使用polyA+RNA(Clontech)的人多组织Northern(MTN)印迹中检测到两种不同大小的RNA转录物。在脾和骨骼肌中观察到约6.5kb的条带，在肺和外周血白细胞中观察到4.5kb的条带。观察到的大小上的变化可能是下列原因造成的组织特异性的腺苷酸化、探针与其他整合素家族成员的交叉反应或与可变剪接的mRNA杂交。
使用来自克隆19A2的第三个片段(跨越SEQ ID NO1中的2000至3100核苷酸)进行的Northern分析与用其他克隆19A2片段的结果一致。
来自三种骨髓谱系细胞系的RNA也用相当于SEQ ID NO1的核苷酸500至2100和2000至3100的片段作为探针进行了分析。预先用PMA刺激的THP-1细胞在同样的大小范围给出了扩散的信号(约5.0kb)，强度略大于组织信号。来自未刺激和DMSO刺激的HL-60细胞的RNA与αd探针杂交给出与组织样品相同强度的信号。但是，PMA似乎提高了信号强度。因为PMA和DMSO分别驱使HL-60细胞向单核/巨噬细胞和粒细胞途径分化。该结果提示，在单核/巨噬细胞类型中αd的表达增强。U937细胞表达αd信息，但此信号不因为PMA刺激而增加。在Molt、Daudi、H9、JY或Jurkat细胞中没有检测到条带。实施例7小鼠水和食物。
幽门螺杆菌攻击在第一次口服免疫后四星期，利用幽门螺杆菌攻击来自B-H组的小鼠。在攻击前4小时使小鼠在没有固体食物和没有水的情况下过夜。利用不锈钢导管给小鼠口服100微升3％碳酸氢钠，接着口服5.0×109CFU/毫升剂量的幽门螺杆菌。在攻击后，恢复小鼠的水和食物。
从小鼠收集血液和组织在第一次免疫后12个星期，使小鼠没有食物过夜，随后处死以便分析保护性和免疫应答。在颈错位处死之前，利用甲氧荧烷麻醉小鼠用于心脏末端取血。在无菌条件下，小心取出每个小鼠的脾和胃，分别置于冰上的无菌容器中直到进一步加工。获取大小肠，以便进一步分离肠液。
加工胃和测量脲酶活性通过组织中活性脲酶的存在测量小鼠胃中幽门螺杆菌的定居程度。根据供应商的说明利用Jatrox测试(Rohm-PharmaGmbH，Weiterstadt，德国)。暴露胃粘膜并利用PBS洗涤，将一半胃窦部分立即置于含有底物的Eppendorf管内以便测量脲酶活性。在将试管室温温育4小时后测量550纳米的吸光值。剩余的胃组织储藏在-20℃以便进一步处理。从天然小鼠的胃获得的脲酶活性值用于建立基线以表明没有幽门螺杆菌感染和因此的保护，天然小鼠没有经过免疫或攻击。表1表达鼠伤寒沙门氏菌疫苗菌株的UreA和UreB
反应中加入适当数量的用EcoRI和XbaI消化的载体pcDNA.3(Invitrogen)及另外1单位的连接酶。继续反应14小时。然后用十分之一的反应混合物转化XL-1 Blue感受态细胞。培养所获得的克隆，并按实施例5分离DNA。用EcoRI消化来鉴定三个该酶切位点阳性即加工信号序列阳性的克隆。将其命名为pATM.B1(CD11b/αd，来自引物ER1B)、pATM.C10(CD11c/αd，来自引物ER1C)和pATM.D2(腺苷酸/αd，来自引物ER1d)。每个克隆中适当信号序列的存在用核酸测序来证实。
上面讨论的αd质粒的表达用每种质粒与一个CD18表达质粒--pRC.CD18共转染COS细胞来进行。作为阳性对照，COS细胞也用质粒pRC.CD18和一个CD11a表达质粒--pDC.CD11A共转染。
在转染16小时前，将细胞加入培养基(DMEM/10％FBS/penstrep)，按50％汇合装入10cm的Corning tissue culture-treated培养皿中。对以下所有的方法，用不含胰蛋白酶的Versene缓冲液(含0.5mMNaEDTA的PBS)从皿中取出细胞。在转染前，板用无血清的DMEM洗涤一次。在每个板中将15微克的每种质粒加入5ml转染缓冲液中(含有20ug/ml DEAE-Dextran和0.5mM氯喹的DMEM)，在37℃温育1.5小时后，细胞用5ml DMEM/10％DMSO休克1分钟。然后用培养基按10ml/每板取代该DMSO溶液。
所获得的转染子按实施例8、9和10介绍的方法用ELISA、FACS和免疫沉淀进行分析。实施例8COS转染子的ELISA分析为确定CD18表达质粒pRC.CD18和αd表达质粒共转染的COS细胞是否在其细胞表面表达与CD18结合的αd，使用针对CD18产生的第一抗体(例如由ATCC HB203纯化的TS1/18)进行PCR。作为阳性对照，也对共转染了CD18表达质粒和一种CD11a表达质粒--pDC.CD11A的细胞进行ELISA。在此对照中，第一抗体包括CD18抗体和抗CD11a抗体(例如，由ATCC HB202纯化的TS1/18)。
为进行ELISA，来自每个板的细胞用Versene缓冲液移出，并转入一个单独的96孔平底的Corning组织培养板。在试验前将细胞在培养基中温育2天。然后将板按150ul/孔用D-PBS/0.5％硬骨鱼皮肤明胶(Sigma)溶液洗涤两次。除显色过程外，此缓冲液用于所有的步骤。所有的洗涤和温育均在室温进行。孔用明胶溶液封闭1小时，第一抗体用明胶溶液稀释至10ug/ml，然后在每孔中加入50ul。每一第一抗体做三个重复的孔。温育1小时后，板按150ul/孔用明胶溶液洗涤3次。1∶3500稀释的二抗(羊抗鼠Ig/HRP-Fc特异性(Jackson，West Grove，PA))按50ul/孔加入板中，并温育1小时。洗涤三次后，板用100ul/孔的邻苯二胺(OPD)(Sigma)溶液(柠檬酸缓冲液中的1mg/ml OPD)显色20分钟，然后加入50ul/孔的15％硫酸。
在ELISA程序中用抗CD18特异性抗体对转染子进行分析的结果显示，在仅用编码CD18的质粒转染的细胞中相对于背景没有明显的表达。用含有CD11a和CD18的质粒共转染的细胞在用CD18特异的抗体或用CD11a特异的试剂分析时，显示比背景高的表达。进一步对编码CD18和一种αd表达结构(pATM.C10或pATM.D12)共转染的细胞进行分析表明，CD18的表达被αd同时表达所恢复。在转染了pATM.C10或pATM.D12的COS细胞中，检测到的CD18表达的提高可与在共转染CD11a/CD18阳性对照细胞中观察到的提高相比。实施例9COS转染子的FACS分析为进行FACS分析，培养皿中的细胞在转染的第二天用新鲜的培养基饲养，并在进行试验前温育2天。转染细胞用3ml Versene从板中移取，用5ml FACS缓冲液(DMEM/2％FBS/0.2％叠氮化钠)洗涤一次，并用稀释至500,000细胞/0.1mlFACS缓冲液样品。在每个样品中加入10微升1mg/ml FITC接合的CD18、CD11a或CD11b特异的抗体(Becton Dickinson)或800ug/ml的CFSE接合的鼠23F2G(抗-CD18)(ATCC HB11081)。然后将样品在冰上温育45分钟，用FACS缓冲液按每次5ml洗涤3次。并重新悬浮于0.2ml FACS缓冲液中。然后将样品上Becton Dickinson FACscan，并用Lysys II软件(BectonDickinson)分析数据。
转染了CD18序列的COS细胞仅不被CD18、CD11a或CD11b染色。用CD11a/CD18共转染时，大约15％的细胞被针对CD11a或CD18的抗体染色。所有转染了CD18和任何一种αd结构物的细胞不会产生对CD11a和CD11b可以检测到的染色。pATM.B1、pATM.C10和pATM.D12组能对CD18分别染出4％、13％和8％的阳性。CD11a/CD18组中的阳性群体的荧光比背景高四倍。与其相比，用αd结构物和CD18结构物共转染产生的群体显示比背景增加4-7倍的荧光强度。实施例10共转染的COS细胞的人αd/CD18复合物的生物素标记的免疫沉淀设法对共转染了CD18和每种实施例7中分别介绍的αd表达质粒的细胞进行免疫沉淀，来确定αd是否能作为整合素特征性的αβ异源二聚体复合物的部分来分离。
转染细胞(1-3×108细胞/组)用Versene缓冲液从培养皿中移取，在50ml/组D-PBS中洗涤3次。每个样品用2mg的Sulpho-NHS生物素(Pierce，Rockford，IL)在室温标记15分钟。反应用在50ml/样品的冷D-PBS中洗涤3次进行淬灭。洗涤的细胞重新悬浮于1ml裂解缓冲液(1％NP40、50mM Tris-HCl、pH8.0、0.2M NaCl、2mM Ca++、2mM Mg++和蛋白酶抑制剂)中，并在冰上温育15分钟。在100,000离心5分钟使不溶性物质沉淀，将上清移入一个新管。为去除与鼠免疫球蛋白非特异性反应的物质，先进行一个预清除步骤。将25微克的鼠免疫球蛋白(Cappel，West chester，PA)与上清在4℃温育。2.5小时后，在每个样品中加入100ul(25ug)的兔抗鼠Ig接合的Sepharose(由蛋白A Sepharose 4B和兔抗鼠IgG制备，均来自Zymed，San Francisco，CA)，继续在4℃旋转温育16小时。离心从上清中移出Sepharose珠。预清除后，随后将上清用20ug抗CD18抗体(TS1.18)在4℃处理2小时。通过与100ul/样品的上面介绍的兔抗鼠/蛋白A-Sepharose制备物一起温育来从上清中分离抗体/抗原复合物。珠用10mM HEPES、0.2M NaCl和1％Triton-X 100洗涤4次。将洗涤的珠沉淀，并在20ul含2％巯基乙醇的2 X Laemmli样品缓冲液中煮沸10分钟。将样品离心，并上8％预先倒好的Novex聚丙烯酰胺凝胶(Novex)，用100V电泳30分钟。蛋白在TBS-T缓冲液中在200mAmps转移1小时，转移到硝酸纤维膜上(Schleicher &Schuell)。膜用1∶6000稀释的链亲和素辣根过氧化物酶(BOD)(Boehringer Mannheim)处理1小时，接着在TBS-T中洗涤3次。然后用Amersham增强化学发光试剂盒根据厂商的指示显示印迹。然后将膜在Hyperfilm MP(Amersham)上曝光0.5至2分钟。
来自用pRC.CD18与pATM.B1、pATM.C10或pATM.D12转染的细胞的CD18复合物的免疫沉淀显示了一种异源二聚体的表面表达，该异源二聚体含有约100kD的、与预测的CD18的大小一致的β链和对应于αd的、约150kD的α链。实施例11人αd在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定转染为确定αd是否与CD18结合成异源二聚体表达于细胞表面，编码每条链的cDNA都瞬时和稳定地转染到缺乏αd和CD18两者的细胞系中。
为进行这些试验，将αdcDNA用如实施例7介绍的额外的前导序列和一个Kozak共有序列扩增，并亚克隆到表达载体pcDNA3中。最后的结构命名为pATM.D12，将其与一个修饰的编码人CD18的商业载体--pDC1.CD18共转染到二氢叶酸还原酶(DHFR)-的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中。质粒pDC1.CD18编码一个DHFR+标记，转染子可用适当的核苷酸缺乏的培养基进行选择，产生pDC1.CD18的修饰如下质粒pRC/CMV(Invitrogen)是一个带有巨细胞病毒启动子和氨苄青霉素抗性标记基因的哺乳动物表达载体。将来自质粒pSC1190-DHFR的DHFR基因插入到pRC/CMV SV40复制起始位点的5’端。此外，将来自质粒pHF2G-DHF的5’区域的多接头连接到pRC/CMV/DHFR结构物中DHFR基因的3’端。接着将CD18编码序列克隆到产生的质粒的5’侧翼多接头区域和牛生长激素poly A编码区域之间。
CD18的表面表达使用单克隆抗体TS1/18用流式细胞仪进行分析。在此细胞系中检测到的αd和CD18之间的异源二聚体的形成与实施例10中用COS细胞中的瞬时表达所做的免疫沉淀一致。实施例12人αd以CD18依赖的方式与ICAM-R结合借鉴证明能介导细胞细胞接触的白细胞整合素与细胞间黏附分子(ICAMs)的相互作用的报道(Hynes，《细胞》69卷，11-25页(1992))，CHO细胞表达的αd/CD18与ICAM-1、ICAM-R或VCAM-1结合的能力用两种方法进行评价。
在同样的试验中，将可溶性的ICAM-1、ICAM-R或VCAM-1 IgG1融合蛋白固化在塑料上，并测定αd/CD18 CHO转染细胞与固化的配体结合的能力。转染细胞用calcein内部标记，用结合缓冲液(含1％BSA的RPMI)洗涤，并仅在缓冲液(含有或不含10ng/ml的PMA)或含有10ug/ml的抗CD18单克隆抗体的缓冲液中温育。将转染细胞加入用可溶性的ICAM-1/IgG1、ICAM-R/IgG1或VCAM-1/IgG1融合蛋白预先包被的96孔Immulon 4微滴定板中，或以牛血清白蛋白包被作为阴性对照。这些黏附分子的可溶性形式的设计已在共同提交和共同拥有的1993年8月5日提交的系列号为No.08/102,852的美国专利申请中介绍和充分公开。在加入标记的细胞前，孔用含1％BSA的PBS封闭。将板浸入含0.1％BSA的PBS中20分钟进行洗涤后，使用Cytofluor2300(Millipore，Milford，MA)测量每孔中剩余的总荧光。
在使用固化的ICAMs的试验中，αd/CD18共转染的细胞都显示比BSA包被的孔增加3-5倍的与ICAM-R/IgG1孔的结合。这种结合的特异性和CD18依赖性用抗CD18抗体TS1/18的抑制作用进行证明。CD11a/CD18转染的细胞与ICAM-1/IgG1孔的结合与观察到的其与BSA包被的孔的结合相当，CD11a/CD18转染细胞仅在用PMA预先处理后才显示与ICAM-1/IgG1孔的结合有2-3倍的提高，αd/CD18转染的细胞用PMA处理不影响其与ICAM-1/IgG1孔的结合。没有检测到αd/CD18转染细胞与VCAM-1/IgG1孔的结合。αd/CD18转染细胞与可溶性的ICAM-1/IgG1、ICAM-R/IgG1或VCAM-1/IgG1融合蛋白的结合用流式细胞仪进行测定。在每个测量中，将约1百万αd/CD18转染CHO细胞(生长于摇瓶中进行高表达)悬浮于含有或不含10ug/ml抗CD18抗体的100ul结合缓冲液(RPMI和1％BSA)中。在室温温育20分钟后，细胞在结合缓冲液中洗涤，并加入ICAM-1/IgG1或ICAM-R/IgG1融合蛋白至终浓度5ug/ml。结合在37℃进行30分钟，然后将细胞洗涤3次，并重新悬浮于100ul含1∶100稀释的FITC接合的羊抗人IgG1的结合缓冲液。温育30分钟后，将样品洗涤3次，并悬浮于200ul结合缓冲液，用Becton DickinsonFACScan进行分析。约40-50％的αd/CD18转染细胞显示与ICAM-R/IgG1结合，但不与ICAM-R/IgG1或VCAM-1/IgG1蛋白结合。用PMA预先处理转染细胞不影响其与ICAM-1/IgG1、ICAM-1/IgG1或VCAM-1/IgG1的结合，这与固化黏附试验一致。与ICAM-R的结合在用抗CD18抗体TS1/18处理αd/CD18转染细胞后降低到背景水平。
由这些双结合试验收集的数据说明，αd/CD18与ICAM-R结合，并且与ICAM-1和VCAM-1的结合相比更优先。αd/CD18与ICAM-R的结合比与ICAM-1的结合更优先，与用CD11a/CD18和CD11b/CD18观察到的结果相反。因此，αd/CD18结合的修饰有希望选择性地影响ICAM-R起主要作用的正常和病理的免疫功能。而且，在检测针对ICAM-R的不同胞外结构域的免疫特异性抗体抑制ICAM-R与αd/CD18转染细胞结合的能力的相似试验中，结果表明，αd/CD18和CD11a/CD18与ICAM-R的不同结构域相互作用。
CD11a/CD18不能与溶液中的ICAM-1/IgG1或ICAM-R/IgG1结合说明，CD11a/CD18与ICAM1或ICAM-R之间的结合亲和性太低，不能在溶液中结合。而检测到αd/CD18与ICAM-R/IgG1的结合则表明非常高的结合亲和性。
在上述介绍的试验中，VCAM-1/Ig融合蛋白含有7个细胞外免疫球蛋白样结构域。融合蛋白在转染的CHO细胞中制备，蛋白产量用ELISA测定。来自CHO细胞上清的7结构域VCAM-1融合蛋白不经纯化直接使用，蛋白产量被发现极低。由于VCAM-1制备物中的低蛋白产量，使用一种商业化的VCAM-1制备物(R & Systems，Minneapolis，MN)来重新检测αd/CD18与VCAM-1的结合，以确定是否是低浓度的VCAM-1导致了没有检测到αd的结合。
与前面一样，CHO细胞表达的αd和CD18用于采用固化的重组黏附分子的黏附试验中。使用流式细胞仪，结果显示，αd转染的CHO细胞表达αd和CD18两者，并且不表达其他β2整合素。同时还发现，转染的CHO细胞不表达两种已知的VCAM-1结合的配体蛋白--α4β1和α4β7。亲本CHO细胞系显示不表达α4或β2整合素。结合试验基本上按上面的介绍进行。
结果表明，αd转染的CHO细胞与固化的VCAM-1以约14.2％的比例结合，与之比较，其与固化的BSA以7.5％的比例结合，与固化的E-选择素以2.8％的比例结合。此外，在存在针对VCAM-1的第一个结构域的单克隆抗体时，与固化VCAM-1的结合基本上被阻断(3.0％结合)。亲本CHO细胞不与VCAM-1、E-选择素或BSA结合(结合比例均低与2％)。转染的CHO细胞的结合经过细胞的系列传代后也会降低，这与经过同一时间后观察到的αd表面表达降低相一致。
为确定自然表达αd/CD18的细胞是否以VCAM-1作为结合伙伴，分离外周血的嗜酸性粒细胞，在存在10ng/ml IL-5的条件下培养5-7天以提高αd的表达。流式细胞仪检测显示，IL-5使αd的表达提高2-4倍，但对α4的表达没有作用。
结果表明，培养的嗜酸性粒细胞与固化的VCAM-1以28.8％的比例结合，并且结合被一种抗CD18单克隆抗体(结合率为17.1％)和一种针对α4的单克隆抗体(结合率为18.1％)部分抑制。与前面用低水平和/或不纯的VCAM-1的初步结果相反，这些数据表明αdβ2是VCAM-1的一种配体。
上面介绍的FACS黏附试验被用来检测一种ICAM-R突变体E37A/Ig与表达αd/CD18的CHO细胞的结合。E37A/Ig已经显示排除了与LFA-1/Ig嵌合体结合(Sadhu等《细胞黏附与通信》2卷，429-440页(1994))。来自稳定转染的CHO细胞系的突变蛋白以可溶性形式表达，并按Sadhu等，上文的介绍，用ProsepA柱纯化。
在重复的试验中，没有检测到E37A/Ig与αd/CD18转染细胞结合。用FITC接合的抗人抗体检测到的E37A/Ig嵌合体的平均荧光强度(MFI)与单独的检测抗体的MFI相同，这说明，在试验中使用E37A/Ig没有检测到比背景高的信号。与此类似，在按实施例14的介绍进行的ELISA中，E37A/Ig突变体没有表现出与固化的αd/CD18接合。αd与iC3b接合补体成分C3可以被蛋白酶切割形成复合物iC3b，iC3b启动补体激活的替代途径，最终导致靶的细胞介导的破坏。CD11b和CD11c都参与iC3b结合，并参与随后的iC3b包被的颗粒的巨噬细胞吞噬。CD11b I结构域中的一个肽片段最近已经证实是iC3b相互作用的位点(Ueda等，《美国科学院院报》91卷，10680-10684(1994))。iC3b的结合区域在CD11b、CD11c和αd高度保守，这提示了一种αd/iC3b结合相互作用。
αd与iC3b的结合用转染细胞或自然表达αd的细胞系(例如，PMA刺激的HL60细胞)与iC3b包被的绵羊红细胞(sRBC)在一个玫瑰花环试验中进行。(Dana等《临床研究杂志》73卷，153-159(1984))。αd/CD18 CHO转染细胞、VLA4-CHO转染细胞(阴性对照)和PMA刺激的HL60细胞(阳性对照)在存在和没有抗CD18单克隆抗体(例如TS1/18.1)的情况下形成玫瑰花环的能力进行了比较。实施例13使用闪烁亲近试验筛选来鉴定αd结合的调节物本发明的αd配体与其结合伙伴(αd配体/抗αd配体对)之间的结合的特异性抑制物，可以用多种方法来确定，例如主要介绍于美国专利No.4,271,139、Hart和Greenwald，《分子免疫学》，12卷，265-267页(1979)和Hart和Greenwald，《核酸医学杂志》20卷，1062-1065页(1979))的闪烁亲近试验技术。上述文献均在此引为参考。
简而言之，将αd配体/抗αd配体对的一个成员直接或间接结合在一个固相支持物上。间接俘获涉及一种直接与支持物结合的单克隆抗体，该抗体能识别可溶性的整合素β链蛋白的C末端的一个特异性表位。该表位可以是血凝素蛋白或分枝杆菌III9表位(Anderson等，《免疫学杂志》141卷，607-613(1988)。一种荧光试剂也与支持物结合。另外，荧光试剂可按美国专利No.4,568,649的介绍整合到支持物中，该专利在此引为参考。αd配体/抗αd配体对的非支持物结合成员用放射性化合物标记，该放射性化合物发射能激发荧光试剂的射线。当配体与放射性标记的抗配体结合时，标记物与支持物结合的荧光试剂足够接近，激发荧光试剂，并产生光发射。当没有结合时，标记物一般与固相支持物太远而不能激发荧光试剂，光发射很弱。测量发射的光，该发射光与配体和抗体配体的结合相关。在样品中加入结合抑制物将减少荧光发射，因为抑制物阻止放射性标记被固相支持物俘获到近处。因此，结合抑制物可以通过它们对样品中的荧光发射的影响来进行鉴定。潜在的αd的抗配体也可以用相似的方法进行鉴定。
按如下方法使用可溶性的重组αd/CD18亮氨酸拉链结构(见实施例14)在闪烁亲近试验中筛选CAM结合的调节物。将重组整合素用预先包被在一个闪烁剂包埋板上的非阻断性抗α亚单位或抗β亚单位抗体固化。在板中同时加入化学文库化合物和一种特异性的生物素标记的CAM/Ig嵌合体。CAM/Ig嵌合体的结合用标记的链亲和素进行检测。在此试验中，ICAM-1/Ig和ICAM-R/Ig用NHS-Sulfo-生物素LC(长链，Pierce)按照厂商推荐的程序进行生物素标记。标记蛋白在ELISA反应中，在用链亲和素-HRP并接着用OPD显色进行检测时，仍能与CAM特异性抗体反应，并能显示与固化的LFA-1反应。
另外，将重组亮氨酸拉链蛋白纯化或部分纯化，直接包被在闪烁包埋板上。同时加入未标记的CAM/Ig嵌合体和化学文库化合物。结合的CAM/Ig用125I标记的抗人Ig进行检测。
另一种选择是，将纯化的CAM/Ig蛋白固化在闪烁板上。在板中加入化学文库化合物和表达重组亮氨酸拉链整合素的细胞的浓缩上清。重组整合素的结合用一种标记的、非阻断性抗α亚单位或抗β亚单位抗体进行检测。筛选小分子的调节物作为闪烁亲近试验的一种替代，相同的αd结合伙伴和抑制剂可以用下面介绍的ELISA样试验来鉴定。
可溶性的αd/CD18亮氨酸拉链(LZ)结构(见实施例14)用抗αd抗体212D(见实施例15)从组织培养上清中俘获。212D抗体用碳酸氢盐包被缓冲液(pH9.5)在4℃过夜固定于96孔ImmulonIV板(Costar)。同样的方法也用于固化抗CD11a抗体TS2/4.1，用来固化一种LFA-1亮氨酸拉链(LFA-1LZ)融合蛋白，LFA-1在试验VCAM-1结合时用作阴性对照，在试验ICAM-1结合时用作阳性对照。板用300ul/孔的3％牛血清白蛋白封闭1小时，并用D-PBS洗涤。按100ul/孔加入表达αd/CD18LZ或LFA-1LZ的稳定CHO转染细胞的组织培养上清，并在4℃温育6-8小时。板用含Tween20的Tris缓冲盐溶液(TBS-T)洗涤两次，接着用含有2mM的每种氯化钙、氯化镁和氯化锰的TBS(不含Tween)洗涤一次。后者在剩下的试验中用作试验和洗涤缓冲液。
在俘获整合素后，板用250ul/孔的TBS洗涤三次。将纯化的CAM/Ig(见实施例12)从起始浓度10至20ug/ml经过系列的2∶3稀释后加入每孔中。与CAM/Igs在室温结合2小时后，板按前述方法进行洗涤。结合的融合蛋白用辣根过氧化物酶接合的羊抗人Ig抗体(Jackson Labs)进行检测，并接着用邻苯二胺(OPD)进行显色。
结果显示，ICAM-1/Ig与LFA-1LZ接合时，信号增加5至7倍，但不与αd/CD18LZ接合。相反，VCAM-1/Ig在含有αd/CD18LZ的孔中显示比背景高5倍的信号。一种ICAM-R突变体E37A/Ig(见实施例12)不与两种整合素接合。
检测了αd特异性单克隆抗体212D、217L、217I、217H、217G、217K和217M抑制VCAM-1与固化的αd/CD18接合的能力。此外，使用抗VCAM-1单克隆抗体130K、130P和IG11B1(Caltag)来确定反应的特异性。抗αd单克隆抗体的使用浓度为5ug/ml，抗VCAM-1抗体的使用浓度是25ug/ml，考虑到本试验系统中的VCAM-1处于溶液中，因此使用较高的抗VCAM-1抗体浓度。
在用217I或130K与130P一起处理的孔中产生了部分阻断(50％)。130K/130P的组合还完全抑制了VLA-4与VCAM-1的相互反应，这说明αd和VLA-4与VCAM-1的不同位点结合，并有可能发展选择性地干预αd/VCAM-1结合的拮抗剂。
本试验可按如下所述来进行高通量的筛选试验，筛选αd结合的抑制物。将VCAM-1/Ig生物素化并按上述方法在存在预先溶于DMSO中的混合化合物时进行使用，然后用一种链亲和素-铕(Eu)复合物检测结合的VCAM-1/Ig。链亲和素-Eu复合物螯合后被激活，产生可以测量的光发射。光发射的改变，或更具体的说降低，就表明VCAM-1/αd结合的抑制，这很可能是小分子混合物中的一种或多种化合物作用的结果，然后就可以对它们进行单独分析或分成小的组别进行分析。实施例14可溶性人αd表达结构全长、可溶的人αd/CD18异源二聚体蛋白的表达能方便地为免疫和结合试验提供纯化的材料。制备可溶性蛋白的优势在于其能够从上清中而不是从细胞裂解物中纯化(如用全长的膜结合αd/CD18)，此时，收率提高且杂质减少。
可溶性αd表达质粒按如下进行构建。克隆在质粒pATM.D12中的、相当于SEQ ID NO1中的0-3161碱基区域的核苷酸片段，用HindIII和AatII消化的方法进行分离。使用分别列于SEQ ID NO30和SEQ IDNO31的引物sHAD.5和sHAD.3从质粒pATM.D12扩增了一个相当于SEQ ID NO1的碱基3130-3390的、与HindIII/AatII片段重叠并在3’末端含有一个额外的MluI限制位点的PCR片段。5’-TTGCTGACTGCCTGCAGTTC-3’ (SEQ ID NO30 )5’-GTTCTGACGCGTAATGGCATTGTAGACCTCGTCTTC-3’(SEQ ID NO31)PCR产物用AatII和MluI消化，并与HindIII/AatII片段连接。所获得的产物连接到HindIII/MluI消化的质粒pDC1.s中。
将该结构与CD18在稳定转染的CHO细胞中共表达，表达用来自35S-甲硫氨酸标记的细胞中免疫沉淀的CD18复合物的放射性自显影来检测。同时还将该结构与CD18在293细胞中共表达(Berman等，《细胞生物化学杂质》，52卷，183-195页(1993))。可溶性全长αd结构本发明还包括其他的αd表达结构，为便于表达和纯化一种完整的αd/CD18异源二聚体，可溶性αd和CD18表达质粒被构建为包括一种“亮氨酸拉链”融合序列，该序列使异源二聚体在纯化过程中稳定(Chang等《美国科学院院报》91卷，11408-11412(1994))。简而言之，编码拉链的酸性和碱性氨基酸链的DNA用Chang等介绍的寡核苷酸进行引物退火来制备。该DNA序列被进一步修饰来分别在5’和3’末端包括额外的MluI和XbaI限制位点，使该DNA序列便于亚克隆到前面所述的αd或CD18表达结构中。此外，在XbaI位点后面加入代表血凝素蛋白或一个聚组氨酸序列的序列以及一个终止密码子。整合血凝素或聚组氨酸是为了便于表达蛋白的纯化。编码拉链的碱性链的序列整合到表达CD18的质粒载体上，酸性链插入到αd链结构上。修饰的αd和CD18蛋白在宿主细胞中表达时，推测拉链结构的酸性链和碱性链之间的相互作用将使异源二聚体稳定，并使完整的αd/CD18分子能够用上面介绍的亲和纯化进行分离。
构建带有酸性和碱性“亮氨酸拉链”序列的表达可溶性的αd和CD18的质粒，按照实施例7介绍的DEAE/Dextran方法转染COS细胞。所获得的蛋白被称为“αd/CD18LZ”。血凝素和聚组氨酸标记没有整合到αd/CD18LZ中。转染细胞在还原血清(2％)条件下生长14天。用实施例8介绍的ELISA方法每隔5天从转染细胞中收集上清检测蛋白的产生。简而言之，将αd/CD18LZ固化在用抗αd单克隆抗体169B(见实施例15)包被的板上。加入生物素化抗CD18单克隆抗体TS1/18.1(见实施例8)，接着加入链亲和素/辣根过氧化物酶(HRP)接合物和邻苯二胺(OPD)，检测αd/CD18LZ复合物。上清中的蛋白可清楚地检出。使用可溶性全长αd表达产物的接合试验使用上面介绍的可溶性全长αd/CD18LZ异源二聚体的功能性结合试验通过将异源二聚体固化在单克隆抗体169B或一种非阻断性抗CD18单克隆抗体(见实施例15)包被的板上来进行。孔在加入起始浓度为10ug/ml的CAM/Ig嵌合体前(见实施例12)用鱼皮明胶封闭以防止非特异性结合。嵌合体与αd/CD18的结合用羊抗人Ig HRP接合物(Jackson Labs)进行检测，并接着用OPD显色。
VCAM-1/Ig被观察到与俘获的αd/CD18LZ的结合比与俘获的CD11a/CD18高3-5倍。ICAM-1/Ig和ICAM-2/Ig与可溶性的CD11a/CD18异源二聚体的结合比背景分别高大约15和10倍，但不与αd/CD18结合。VCAM-1的结合在存在VCAM-1特异性抗体130K和130P联用时减低大约50％。
使用固化在96孔板上的ICAM/Ig蛋白并随后加入细胞上清中的重组可溶性整合素也进行了结合试验。可溶性整合素的结合用非标记的非阻断性α和β亚单位特异的鼠抗体，接着与HRP接合的羊抗鼠抗体温育，并用OPD显色，进行检测。
结果显示，非阻断性抗体检测到的αd/CD18LZ与ICAM-R/Ig的结合，比在不含抗体的对照孔中检测到的结合，高10倍。没有检测到可溶性αd/CD18与固化的ICAM-1/Ig的结合，但在αd/CD18与固化的CD11b/CD18和CD11a/CD18之间观察到的结合，分别比背景结合高15和5倍。
因为以前的研究已经证明，CD11b和CD11c与脂多糖(LPS)结合(Wright，《Curr.Opin.Immunol.》3卷，83-90页(1991)，Ingalls和Golenbock，《实验医学杂志》181卷，1473-1479页(1995))，LPS与αd/CD18的结合也用流式细胞仪和板基试验进行了评价。结果表明，从明尼苏达沙门氏菌和伤寒沙门氏菌分离的FITC标记的LPS(均获自Sigma)在20ug/ml时能够微弱地与αd/CD18转染的CHO细胞结合。在未转染的对照CHO细胞中没有发现结合。在ELISA型试验中，生物素化的LPS(Luk等，《Alan.Biochem》232卷，217-224页(1995))在0.5-3.0ug时结合所获得的αd/CD18LZ信号比单独的俘获抗体和阻断试剂高4倍。LPS与CD11a/CD18的表观结合在排除了每个试验背景与抗CD11a抗体TS2/4结合后降低。
为鉴定αd/CD18的其他配体，在一个两层次研究中使用了重组αd/CD18LZ蛋白。不同细胞类型与固化蛋白的结合用来确定何种细胞在细胞表面表达αd配体。然后用抗体抑制来确定所观察到的细胞结合是否是已知的表面黏附分子引起的。如果没有抑制结果，使用αd/CD18LZ与来自能与αd结合的细胞的裂解物蛋白的免疫共沉淀来设法鉴定配体。可溶性人αdI结构域表达结构已经有报道CD11a中的I结构域能作为一个独立的结构单位进行表达，并能保持其配体结合能力和抗体识别特性(Randi和Hogg《生物化学杂志》269卷，12395-12398(1994)，Zhout等，《生物化学杂志》269卷，17075-17079(1994)，Michishita等《细胞》72卷，857-867页(1993))。为制备一种包含αdI结构域和人IgG4的可溶性融合蛋白，用PCR扩增αdI结构域，使用设计在两翼添加BamHI和XhoI限制位点以便于亚克隆的引物。引物列于SEQ ID NO32和33，并在酶切位点下划线。5’-ACGTATGCAGGATCCCATCAAGAGATGGACATCGCT-3’(SEQ ID NO32)5’-ACTGCATGTCTCGAGGCTGAAGCCTTCTTGGGACATC-3’(SEQ ID NO33)SEQ ID NO32中紧接着BamHI位点3’端的C核苷酸相当于SEQ ID NO1的435核苷酸，SEQ IN NO33中紧接着XhoI位点3’端的G核苷酸互补于SEQ ID NO1中的1067核苷酸。扩增的I结构域用适当的酶消化，将纯化的片段连接到哺乳动物表达载体pDCs和原核表达载体pGEX-4T-3(Pharmacia)，并对I结构域序列进行测序。然后用合适的表达结构转染或转化的COS、CHO或大肠杆菌细胞表达融合蛋白。
已知αd对ICAM-R具有亲和性，αdI结构域的表达可能具有足够的亲和性来用作αd参与的细胞黏附的抑制剂。人αdI结构域/IgG4融合蛋白的分析蛋白质用在还原和非还原条件下SDS-PAGE进行分析，并用银染或考马斯染色进行显示。然后将蛋白转移到Immobilon PVDF膜上，并用抗人IgG单克隆抗体或抗牛Ig单克隆抗体进行Western印迹分析。
检测到的蛋白被测定在非还原条件下以约120kD迁移，在还原条件下以45kD迁移。在非还原条件下还检测到弱带，它能够与抗人抗体反应但不与抗牛抗体反应。一个200kD的弱带被Western印迹确定为牛Ig。使用I结构域表达产物的结合试验在一个ELISA试验中检测了I结构域特异性识别ICAM-R/IgG嵌合蛋白的能力。在TBS中系列稀释的αdI结构域IgG4融合蛋白(Iαd/IgG4)与固化于Immulon IV RIA/EIA板的ICAM-1/IgG、ICAM-R/IgG、VCAM-1/IgG或一种无关的IgG1骨髓瘤蛋白一起温育。CD11aI结构域/IgG嵌合蛋白和人IgG4/κ骨髓瘤蛋白用作阴性对照。结合的IgG4用生物素化的抗IgG4单克隆抗体HP6023，并接着加入链亲和素-辣根过氧化物酶接合物，用底物邻苯二胺显色，进行检测。
在重复的试验中，用任何一种固化蛋白没有检测到CD11a/IgG4蛋白或IgG4骨髓瘤蛋白的结合。Iαd/CIgG4蛋白不与鱼皮明胶或牛血清白蛋白封闭试剂、人IgG1或ICAM-1/IgG结合。使用1-5ug/ml浓度的Iαd/IgG4蛋白在ICAM-R/IgG蛋白包被的孔中检测到了比背景高2-3倍的结合信号。VCAM-1/IgG蛋白包被的孔中的信号比背景高7-10倍。在前面的试验中，αd/CD18转染的CHO细胞不能结合VCAM-1/IgG蛋白，这表明VCAM-1结合可能是分离的I结构域氨基酸序列的特征。另外的αdI结构域结构另外的αdI结构域结构用与前面的结构相同的方式制备，但围绕αdI结构域整合更多的氨基酸。具体结构包括i)来自外显子5(SEQID NO2的127-353氨基酸)，在当前结构的前面；ii)在I结构域之后的EF手性重复(SEQ ID NO2的17-603氨基酸)；iii)在转膜区域截短的α链(SEQ ID NO2的17-1029氨基酸)，带有一个用于纯化和检测的IgG4尾巴。将这些结构连接到哺乳动物表达载体pDCS1或原核表达载体pGEX-4T-3(Pharmacia)中，并对I结构域测序。然后在用适当表达结构转化或转染的COS、CHO或大肠杆菌细胞中表达融合蛋白。蛋白用ProSepA(Bioprocessing Limited，Durham，England)柱进行纯化，并用抗IgG4单克隆抗体HP6023检测反应性，在聚丙烯酰胺凝胶上用考马斯染色进行显示。
为构建用于表达完整的αd多肽的表达质粒，按下面的方法对上文介绍的pATM.D12进行修饰来表达一种αd-IgG4融合蛋白。编码IgG4的DNA用PCR的方法从载体pDCS1中分离，使用分别整合了5’AatII限制位点(SEQ ID NO89)和3’XbaI限制位点(SEQ ID NO90)的引物。5’-CGCTGTGACGTCAGAGTTGAGTCCAAATATGG-3’(SEQ ID NO89)5’-GGTGACACTATAGAATAGGGC-3’ (SEQ ID NO90)质粒pATM.D12用AatII和XbaI消化，并将适当消化和纯化的IgG4 PCR产物连接到一个线性的载体中。实施例15制备人αd特异的单克隆抗体1.将来自实施例7的瞬时转染细胞在Dulbecco’s磷酸缓冲盐水(D-PBS)中洗涤三次，按5×106细胞/鼠与50ug/鼠的胞壁酰二肽(Sigma)一起注射到Balb/c小鼠中。小鼠用同一方式间隔2周再注射两次。小鼠的放血前和免疫血清用实施例9介绍的方法进行筛选，将与表达αd/CD18的转染细胞有最高反应的小鼠的脾脏融合。然后分别筛选缺乏与CD11a/CD18转染的COS细胞反应的细胞和筛选与αd表达质粒和CD18共转染的细胞反应的杂交瘤上清。
用此方法没有获得单克隆抗体。
2.另一种制备单克隆抗体的方法是，从稳定转染的CHO细胞的上清中亲和纯化可溶性的αdI结构域/IgG4融合蛋白，并按上述方法免疫Balb/c小鼠。建立杂交瘤，并用ELISA筛选能与αdI结构域融合蛋白反应的来自这些杂交瘤的上清。然后分析阳性培养物与CHO转染细胞上表达的全长αd/CD18复合物的反应性。
小鼠1908接受三次αd/CD18转染的CHO细胞的初次免疫和两次可溶性αd/CD18异源二聚体的加强免疫。最后两次免疫包括50ug/鼠的αdI结构域/IgG4融合蛋白。融合产生了270个产生IgG的孔。45个孔的上清在ELISA中显示与Iαd/IgG4融合蛋白的结合比与人IgG4的结合至少高7倍。FACS分析确定，没有上清能与αd/CD18转染的CHO细胞反应。
为确定上清是否能在另一种环境下识别整合素α亚单位，新鲜的冷冻脾切片用45孔中的24孔上清进行染色，三个上清被确定为阳性。一个染上了红髓中的大量细胞，而另外两个染上了红髓及小梁中的分散细胞。
进一步分析了这些上清免疫沉淀来自αd/CD18转染的CHO细胞或PMA刺激的HL60细胞的生物素化CD18的能力。选择其上清能识别去污剂裂解物中的蛋白(这种蛋白结构上不局限于以异源二聚体形式表达的蛋白)的融合孔进行进一步的亚克隆。能识别去污剂中蛋白的单克隆抗体可能在免疫沉淀来自转染细胞、组织和细胞系的异源二聚体复合物时更有用。
3.另一种制备单克隆抗体的替代方法是，CD18复合物用抗CD18单克隆抗体23F2G在预先清除了CD11a/CD18(使用单克隆抗体TS2/4)和CD11b/CD18(用单克隆抗体Mo-1)后从人脾裂解物中免疫沉淀。5只10-12周龄的Balb/c小鼠用皮下注射的方法用约30ug在福氏完全佐剂中的所获蛋白在第0天进行免疫，接着在第28和第43天按30ug/鼠并用福氏不完全佐剂进行两次加强免疫。在最后一次加强免疫后10天抽取试验血清。在Western印迹中用1∶500稀释的每种血清检测1ug/条免疫原的方法对反应性进行评价。来自三只小鼠的血清能检测到约95和150kD的带，在用1∶50稀释的免疫前血清处理的条中没有发现信号。推测150kD代表一种体内糖基化状态的αd。此外，所有经过免疫的血清都能免疫沉淀来自生物素化αd/CD18CHO细胞的裂解物的蛋白，这种蛋白在SDS-PAGE上以适当的分子量迁移，并代表异源二聚体。由这些结果，选择小鼠#2212，在64天用PBS中的30ug免疫原，使用腹膜内注射的方法，进一步免疫。在4天后处死小鼠，无菌取出脾脏。
将脾脏在浸没在补加有2mM L-谷氨酸、1mM丙酮酸钠、100单位/ml青霉素和100ug/ml链霉素的无血清RPMI 1640中的两个显微镜载玻片的磨沙端研磨，形成单个细胞的悬液(RPMI)(Gibco，Canada)。细胞悬液滤过一个无菌的70筛Nitex细胞滤过器(Becton，Dickinson，Parsippany，New Jersey)。滤过物在200×g离心5分钟洗涤2次。所获得的沉淀重新悬浮于20ml无血清RPMI。从三只Balb/c幼鼠取出的胸腺细胞也用同样的方法进行制备。
在融合前，将在融合前三天用含10％Fetalclone血清(FCS)(Hyclone Laboratories，Logan，Utah)的RPMI维持在对数生长期的NS-1骨髓瘤细胞，在200×g离心5分钟进行沉淀。用上一段介绍的方法洗涤两次，并计数。将大约2×108脾细胞与4×107NS-1细胞混合，将所获得的混合物用200×g离心沉淀。上清弃去。敲击试管取出细胞沉淀，并在1分钟内加入2ml 75mM Hepes(pH8.0、37℃)(BoehringerMannheim)中的50％ PEG1500，并搅动。在接着的7分钟内加入另外14ml无血清RPMI，接着立即加入16ml的RPMI。所获得的混合物在200×g离心10分钟，弃去上清。沉淀重新悬浮于200ml含有15％FBS、100mM次黄嘌呤钠、0.4mM氨基蝶呤、16mM胸腺嘧啶(HAT)(Gibco)、25单位/ml IL-6(Boehringer Mannheim)和1.5×106胸腺细胞/ml的RPMI，并按200ul/孔分于96孔平底组织培养板(Corning，联合王国)上。在融合后的第2、4和6天饲喂细胞，方法是用一只18G针(Becton Dickinson)从每孔中吸出约100ul，并按100ul/孔加入上面介绍的铺板培养基，但含有10单位/ml的IL-6和不含胸腺细胞外。
在融合后的第7-10天，用抗体俘获ELISA对每孔中的上清进行筛选，检测鼠IgG的存在。Immulon 4板(Dynatech，Cambridge，Massachusetts)用50ul/孔的1∶5000稀释于50mM碳酸钠缓冲液、pH9.6的羊抗鼠IgA、IgG或IgM(Organon Teknika)在4℃进行包被。板用含有0.5％Tween20的PBS(PBST)洗涤三次，并加入来自每个孔的培养上清50ul。在37℃温育30分钟后，孔用PBST按上述方法洗涤。然后在每孔中加入50ul的按1∶3500稀释于PBST的辣根过氧化物酶接合的羊抗鼠IgG(Fc)(Jackson ImmunoRsesearch，WestGrove，Pennsylvania)。板按上述方法进行温育，用PBST洗涤四次，然后加入在100mM柠檬酸、pH4.5中含有1mg/ml邻苯二胺(Sigma)和0.1ul/ml 30％ H2O2的底物。在5分钟后加入50ul 15％的硫酸终止颜色反应。用读板机(Dynatech)确定每孔的490nm吸收。
杂交瘤进一步用下面的方法进行鉴定。来自产生IgG培养物的上清用流式细胞仪分析其与αd/CD18转化的CHO细胞而不是与JY细胞(在前面的原位染色试验中发现的，一种LFA-1阳性，但其他β2整合素阴性的B细胞系)的反应性。简而言之，将5×105αd/CD18转化的CHO细胞或αd/CD18-JY细胞悬浮于50ul含有2％FBS和10mM NaN3(FACS缓冲液)的RPMI中，分别将各细胞悬液加入96孔圆底板(Corning)中的50ul IgG阳性杂交瘤培养物上清中，在冰上温育30分钟后，细胞用医用离心机沉淀洗涤两次。将每孔的上清弃去，并将沉淀重新悬浮于200-300ul FACS缓冲液。最后一次洗涤用50ul/孔的1∶100稀释的在FACS缓冲液中制备的羊抗鼠IgG(H+L)-FITC接合物的F(ab’)2代替。按上述方法温育后，细胞用补加了10mM NaN3的Dulbecco’s PBS(D-PBS)洗涤两次。并最后悬浮于含有1％低聚甲醛的D-PBS。然后将样品转移到聚丙烯试管中，用Becton DickinsonFACsan分析仪进行流式细胞仪分析(FACs)。
融合产生了四个按两种标准判断似乎是阳性的培养物。在大约4天后用扩大的上清进行第二次重复筛选时，四个培养物中有三个保持阳性。这三个孔命名为169A、169B、169D，将这三个孔通过在15％FBS、100mM次黄嘌呤钠、16mM胸腺嘧啶和10单位/ml IL-6的RPMI中两倍稀释连续克隆2至3次。克隆板上的孔在四天后目测计数，记录最少密度孔中的克隆数。每一克隆的选择孔在7-10天后用FACS进行分析。在两个培养物169A和169B中发现活性。在最后一次克隆中，含有单个克隆的阳性孔在含有11％FBS的RPMI中扩大。169A和169B克隆上清中的抗体用IsoStrip试剂盒(Boehringer Mannheim)按照厂商指示进行分型，发现它们属于IgG1同种型。
与来自CHO转染细胞和PMA刺激的HL-60细胞的αd/CD18复合物的免疫沉淀被用作特异性的第四轮筛选。杂交瘤169A和169B能沉淀来自CHO细胞系的适当带以及来自HL-60细胞的一条单一α链类型，这个结果被SDS-PAGE所确定。杂交瘤169A和169B在1995年5月31日在美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852进行了保藏，其保藏号分别为HB11907和HB11906。
为分析169A和169B更完全的结合特性，检测了每种抗体抑制另一种抗体或抗CD18抗体TS1/18.1与可溶性αd/CD18结合的能力。可溶性全长的αd/CD18被96孔板中的每种未标记的抗体分别固化，用生物素化抗体来检测相同或不同非标记抗体与蛋白的结合。使用一种羊抗鼠Ig/HRP接合物并接着加入OPD底物来检测结合。结果显示，抗体169A能够阻断生物素化169A和TS1/18.1的结合，而抗体169B仅阻断其自身的结合。4.选择另一只小鼠(#2214)，用与小鼠#2212相同的方法进行初始免疫，并在70天进行融合前的加强免疫，免疫使用PBS中的来自脾裂解物的30ug纯化αd。4天后处死小鼠，无菌取出脾脏。阳性细胞的融合和克隆如上所述进行。融合产生了5个抗αd单克隆杂交瘤，命名为170D、170F、170E、170X和170H，使用IsoStrip试剂盒(Boehringer Mannheim)按照厂商指示进行分型，发现它们属于IgG1同种型。
5.选择另一只小鼠(#2211)，用与小鼠#2212和小鼠#2214相同的方法进行初始免疫，在88天用30ug免疫原进行加强免疫，在203天用30ug免疫原进行融合前的加强免疫。小鼠在4天后处死，按照前述的方法取出脾脏并融合。杂交瘤按照上面段落的详细介绍，通过抗体俘获ELISA和流式细胞仪筛选杂交瘤上清。
鉴定了15个阳性的杂交瘤，命名为188A、188B、188C、188E、188F、188G、188I、188J、188K、188L、188M、188N、188P、188R和188T，并用ELISA进行分型。简而言之，Immmulon 4板(Dynatech，Cambridge，Massachusetts)按50ul/孔用在50mM碳酸钠缓冲液、pH9.6按1∶5000稀释的羊抗鼠IgA、G、M(Organ Teknika)在4℃包被。板用含1％BSA的PBS在37℃封闭30分钟，用PBS/0.5％Tween20(PBST)洗涤三次，加入50ul的培养物上清(用PBST1∶10稀释)。如前所述进行温育和洗涤后，加入50ul用含1％正常羊血清的PBST按1∶1000稀释的辣根过氧化物酶接合的兔抗鼠IgG1、G2a或G3(Zymed，San Francisco，California)。板按前述进行温育，用PBST洗涤四次，然后加入100ul底物，底物为含有1mg/ml邻苯二胺(Sigma)和0.1ul/ml 30％ H2O2的100mM柠檬酸、pH4.5。在5分钟后加入50ul 15％的硫酸终止颜色反应。用读板机(Dynatech)读A490nm。所有15个抗体被确定为IgG1。
将来自小鼠#2211的剩余脾细胞在一个冷冻小管中冷冻，并贮存于液氮。将冷冻小管置于37℃水浴箱内迅速解冻，并使其以圆周方式移动，直至内容物融解。将细胞转至一个15ml离心管，同时缓慢加入1ml含有11％FBS的预热RPMI，加入过程为3至5分钟。等待5分钟后，再加入5ml预热的RPMI，试管在200×g离心5分钟，吸出上清。将细胞重新悬浮于RPMI，按前述方法进行融合。按前述方法用抗体俘获法和流式细胞仪对杂交瘤上清进行筛选。
融合产生了5个克隆，命名为195A、195C、195D、195E和195H。用ELISA程序按前述方法对这些克隆进行分型，单克隆抗体195A、195C、195D和195E被确定为IgG1，195H被确定为IgG2a。
6.在制备抗αd单克隆抗体的另一个努力中，小鼠#2213用与小鼠2214、2211和2212同样的方法进行免疫，但在第414天和441天用与琼脂糖珠接合的30ug人αd/CD18亮氨酸拉链(LZ)进行进一步的免疫。用于小鼠#2213的免疫原通过将人αd/CD18LZ(实施例14)与抗CD18单克隆抗体和蛋白A琼脂糖免疫沉淀来制备。沉淀的复合物按1∶1的比例重悬于PBS成为淤浆。在加强免疫后4天处死小鼠。取出脾脏，按前述方法进行融合。
阳性的杂交瘤用ELISA方法进行鉴定，使用用非阻断性抗CD18抗体的F(ab)’2片段固化的人αd/CD18LZ。简而言之，F(ab)’2片段在4℃按100ng/孔包被于Immulon 4 ELISA板。吸出缓冲液后，孔用0.5％鱼皮明胶(Sigma)在37℃封闭30分钟。在PBST中洗涤三次后，加入50ul/孔来自先前用编码可溶性αd/CD18LZ的质粒转化的CHO细胞的上清。板在37℃温育30分钟。重复洗涤步骤，并加入50ul/孔的杂交瘤上清。单克隆抗体的检测按前述方法进行。阳性细胞按前述方法用流式细胞仪进行分析，使用用αd/CD18LZ编码DNA转化的CHO细胞，两个被命名为212A和212D的阳性杂交瘤得到鉴定。杂交瘤分泌的抗体使用前面介绍的分型ELISA分型为IgG1。
7.在另一个制备抗人αd单克隆抗体的方法中。小鼠用按前述方法制备的αd/CD18LZ琼脂糖珠进行免疫，每只小鼠在第0天、36天和66天接受30ug的免疫原。在用前面介绍的重组蛋白ELISA程序对小鼠血清进行筛选后，选择小鼠#2477进行融合。融合、选择和克隆程序使用上面212融合中介绍的方法进行。鉴定了7个阳性杂交瘤---217F、217G、217H、217I、217K、217L和217M，但在最后一轮克隆中杂交瘤丧失了反应性，这一点被流式细胞仪确定。来自剩余6个杂交瘤系的抗体按前述方法进行分型，均被发现为IgG1。
8.在另一个制备αd单克隆抗体的方法中，小鼠#2480用小鼠#2477同样的方法进行免疫，但在第217天和218天用30ug的αd/CD18LZ经腹膜内注射进行进一步的免疫。小鼠在第221天处死，取出脾脏，并按前述方法进行融合。杂交瘤上清按介绍的ELISA方法进行筛选，并用流式细胞仪确定其与先前用编码αd/CD18的DNA转染的JY细胞的反应性。筛选过程按上面的介绍进行。融合产生了3个阳性的杂交瘤，240F、240G和240H，三种杂交瘤分泌的抗体用ELISA法均分型为IgG1。
9.为鉴定能抑制功能性αd接合的抗体，使用可溶性αd/CD18LZ(见实施例14)进行免疫。蛋白在一种亲和层析树脂上从瞬时转染的COS细胞的上清中分离，将树脂结合的αd用作免疫原。一只被选小鼠按上面介绍的方法进行免疫，并在初次免疫后两周给予最后的加强。用这种技术免疫可以防止经常与细胞的去污剂裂解相关的蛋白构象的可能改变。另外的小鼠用也与树脂结合的重组蛋白进行免疫，但不用从细胞裂解物中纯化的蛋白进行初次免疫。
按前述方法制备的、由免疫产生的杂交瘤细胞用ELISA在用一种非阻断性抗体的Fab片段从细胞上清中固化的重组蛋白上进行筛选。此外，使用流式细胞仪分析其与先前用αdcDNA转染的JY细胞的反应性。
10.另一种选用方法，单克隆抗体按如下进行制备。使用来自稳定转染的CHO细胞的去污剂裂解物的亲和纯化的αd/CD18和50ug/ml胞壁酰二肽按前述方法免疫Balb/c小鼠。通过用CHO转染细胞中的生物素化复合物免疫沉淀确定其对αd/CD18的血清反应性之前，小鼠接受三次免疫。阳性动物的杂交瘤按标准程序建立。然后使用αd/CD18转染细胞用流式细胞仪对杂交瘤培养物进行选择。CD11a/CD18转染细胞用作仅与CD18反应的对照。
11.另一种单克隆抗体制备的选用方法是，Balb/c小鼠接受一种免疫/免疫抑制程序，这种免疫/免疫抑制程序被设计来减少与免疫中使用的转染细胞上的CHO细胞决定子的反应。该程序包括用未转染的CHO细胞进行免疫，并接着用环磷酰胺处理来杀死与CHO细胞反应的B细胞前体。在经过三轮的免疫和环磷酰胺处理后，小鼠按前述方法用αd/CD18 CHO转染细胞进行免疫。
12.另一种选用方法是，按前述的预清除方法富集来自PMA刺激的HL60细胞的去污剂裂解物的CD18复合物。其他的β2整合素在同一柱上被清除。用所获得的复合物进行免疫、杂交瘤制备和筛选过程均按上文所述方法进行。多克隆血清的制备使用纯化的αdI结构域/IgG4嵌合体(实施例14)来在兔中制备多克隆抗血清。用福氏完全佐剂中的αdI结构域/IgG4抗原按100ug/兔进行初次免疫，接着用福氏不完全佐剂中的相同数量的蛋白进行三次加强免疫。在第三和第四次注射后测试待测血液。兔免疫球蛋白(Ig)在一个蛋白A-琼脂糖柱上从血清中纯化，并在一个人IgG/Affigel 10柱上预清除抗人IgG反应性。用在ELISA中与I结构域嵌合体反应但不与人IgG反应来证明完全的清除。
预清除的多克隆血清被用来从先前用αd和CD18表达载体转染的表面生物素化的CHO细胞的去污剂裂解物中免疫沉淀蛋白。免疫沉淀按前面实施例10中介绍的方法进行。预清除的血清识别一种蛋白复合物，该蛋白复合物与用抗CD18单克隆抗体TS1.18沉淀的蛋白分子量相同。此外，血清在与来自αd/CD18转染的CHO细胞的CD18复合物进行Western印迹时，识别一个适当大小的单一条带。由人脾脏亲和纯化的整合素CD11a/CD18、CD11b/CD18和VLA4不被兔多克隆血清识别。流式细胞仪测定发现，该血清不能与溶液中的αd转染的CHO细胞反应。因此结论是，兔多克隆血清仅能识别变性的αdI结构域/IgG4蛋白。
在一个制备抗αd/CD18多克隆抗血清的努力中，一只小鼠用αd转染的CHO细胞(D6.CHO，αd/CD18)和辅助肽免疫3次，用纯化的αd/CD18异源二聚体免疫一次。最后一次加强免疫仅包括αd/CD18异源二聚体。大约100ul免疫血清通过加入大约108LFA-1转染的CHO细胞在4℃预清除2小时。检测所获得的血清在1/5000、1/10000、1/20000和1/40000稀释时与正常人脾上的αd的反应性。多克隆抗体在1/20000的稀释度时具有反应性，而在1/40000时染色非常弱。实施例16使用抗αd单克隆抗体的流式细胞仪分析在用抗αd单克隆抗体212D、217K和217L进行的研究中使用几种原代和永生化细胞系。细胞染色按实施例7中介绍的方法进行和分析。MAGE-3(黑色素瘤相关蛋白)肽特异的原代CD8+/CD56-和CD4-/CD8-/CD56+原代细胞系对CD11b和CD11c显示强阳性，但不被任何一种αd抗体染色。MAGE-3肽特异细胞使用荷肽抗原递呈细胞(APCs，树突细胞或单核细胞)从外周血单个核细胞群体中扩大。经过在限制稀释条件下重复刺激结合表型选择，产生了能够特异性地杀伤携带肽来源的原始蛋白的靶细胞的克隆化裂解细胞系。
来自外周血的树突细胞，在存在细胞因子IL-4和GM-CSF时培养7天后，能被针对CD11a、CD11b和CD11c的抗体以及217L抗αd抗体强染色。在重复的试验中，抗体217D、217K、217I、217H和217M不与这些细胞和来自不同供体的树突细胞反应。培养的第14天后，217L抗原的表面表达减弱，染色在第21天完全消失。在培养过程中，CD11b和CD11c的表达保持在高水平(比背景高2-3个数量级)。实施例17人单核细胞αd的表达从外周血中纯化人单核细胞从一个志愿供者抽取约300ml血加入3.8％柠檬酸钠缓冲液中(Sigma)。血液用无内毒素的PBS(Sigma)稀释至480ml，将30ml稀释的血小心铺在50ml离心管中的17ml Histopaque上。在BeckmanTabletop离心机中用1500rpm离心30分钟进行分层。代表单个核细胞的细胞层从每层中收集，并转到一个新的50ml管。用无内毒素的PBS、0.1％BSA(无内毒素)将体积增加至50ml，在Beckman Tabletop离心机中用1500rpm离心15分钟。弃去上清，将细胞重悬于一个小体积的PBS/BSA中，随后混合。
从按上述方法获得的细胞混合群体中纯化单核细胞需要第二次分层(按Percoll(Denholm和Wolber，《免疫学方法杂志》144卷，247-251页(1991))。简而言之，将10ml 10X的Hanks缓冲液(Gibco)与600ul的1N HCL混合。在此混合物中，加入60ml的Percoll(Pharmacia，Piscataway NJ)，将混合物缓慢搅拌使所有的Percoll进入溶液。将Percoll溶液的pH调为7.0，然后将8.0ml的分级混合物加入6个15ml的圆底聚丙烯试管。在每个分级中精确加入4ml细胞悬液，并将试管颠倒几次使其充分混合。分级物用一个固定角转头在室温下在1690rpm离心25分钟。单核细胞级份在分层物中显示为一层薄的白带，将其收集并转至一个新的50ml离心管中。用PBS/0.1％BSA将体积调为50ml，离心沉淀细胞。将细胞沉淀重新悬浮于小体积中，并混合，用血细胞计数器测定细胞数量。将细胞重悬于FACS缓冲液(RPI 1640，0.2％FBS、0.2％叠氮化钠)中并调整为1.0×106/条件，即在每种FACS染色条件下使用1.0×106细胞，来分析不同的细胞标记。FACS染色和分析单抗体细胞染色使用对αd或细胞标记具有免疫特异性并与一种可用荧光检测的标记物直接接合的抗体来进行。将鼠抗人αd抗体212D或217L按10ug/ml加入细胞，然后在冰上温育30分钟，并洗涤3次。在另外的细胞样品中加入10微升直接接合的细胞标记CD3-FITC(Becton-Dickinson)(T细胞特异)或CD33-FITC(Becton-Dickinson)(单核细胞特异)，同时将10ul二抗--抗鼠FITC(Sigma)加入到212D和217L染色的细胞中。所有的样品在冰上在暗处温育30分钟，洗涤3次，重悬于300ul 2％的低聚甲醛中。将样品上BectonDickinson FACScan，并用LysysII软件(Becton Dickinson)分析数据。
在第一个实验中，在用双分级法纯化的全体细胞中，单核细胞占68％，T细胞占18％。有相当数量的两种细胞类型在212D和217L进行αd染色时被染上，分别为细胞的55％和65％。基于后一个实验，在对新鲜分离的人单核细胞进行αd染色时，似乎在相对数量上存在供体与供体之间的差异，虽然分离的单核细胞总是染色阳性。当在细胞中加入人IgG(在加入第一抗体前以1mg/ml在冰上10分钟进行使用)来阻断任何可能的Fc受体结合问题时，αd染色没有改变。当这些细胞在使用Hydron包被的培养皿(Interferon Sciences)在10％FBS/RPM-1640中悬浮培养并分析αd表达时，在24小时内表面表达就有丧失，并且该减少过程持续一个7天的时间过程。相对于其他整合素包括CD11a、CD11b和CD11c在新鲜分离的人单核细胞上的表达，αd染色较低。人单核细胞的αd2色FACS染色为进行2-色FACS染色，212D和217L抗体均用NHS-LC-生物素(Pierce)按照厂商的指示进行生物素化。在一个单独的实验中，细胞按上述方法分离，并用生物素标记的212D和217L抗体和一种生物素标记的对照IgG1抗体10ug/ml在冰上染色30分钟。细胞在FACS缓冲液(修饰为含有D-PBS、2％FBS和0.2％叠氮化钠)中洗涤三次，并重新悬浮于1.0ml的FACS缓冲液中。将10ul FITC-接合的CD33(单核细胞特异)和5ul链亲和素PE(PharMingen)一起加入细胞悬液中。样品于暗处在冰上温育30分钟，在FACS缓冲液中洗涤三次，重悬于300ul 1％低聚甲醛中。样品按上述方法进行FACS。
在两种抗体中，217L显示相比于对照明显地与CD33+细胞结合。抗体也能与这种细胞类型结合，但染色的CD33+细胞的数量明显低于在抗体217L中观察到的数量。这个结果在两个单独的实验中一致。在使用生物素化的抗体212D和217L的相关实验中，217L-生物素总是比212D-生物素染更多的细胞。
代表淋巴细胞混合物的单个核细胞和用Percoll梯度分离前获得的单核细胞也用上面介绍的2色分析进行了检测，检测采用212D和217L-生物素以及FITC接合的对CD3(T细胞)、CD4(辅助T细胞)、CD5(胸腺细胞、成熟T细胞、B细胞亚群)、CD8(细胞毒/抑制T细胞)、CD14(单核细胞、中性粒细胞、小节树突网状细胞)、CD20(B细胞)和CD56(NK细胞、T细胞亚群)(Becton Dickinson)免疫特异性的抗体进行双染色。没有发现与这些细胞标记共表达的αd阳性群体。实施例18αd分布的分析αd/CD18的组织分布用按实施例15介绍的方法制备的多克隆抗血清进行测定。
纯化的兔多克隆抗体在对冷冻的人脾切片进行免疫细胞化学分析时使用的浓度范围为120ng/ml到60ug/ml。将6微米厚的切片放置在Superfrost Plus Slides(VWR)上并贮存于-70℃。使用前，将载玻片从-70℃中取出，在55℃放置5分钟。然后将切片在冰冷的丙酮中固定2分钟，空气中干燥。将切片在室温在含有1％BSA、30％正常人血清和5％正常兔血清的溶液中封闭30分钟。将第一抗体加入每个切片在室温处理1小时。未结合的抗体通过在TBS缓冲液中洗涤载玻片三次去除，每次洗涤5分钟。接着，将在同一TBS缓冲液中的兔抗鼠IgG连接抗体加入到每个切片中。一种鼠碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶(APAAP)抗体，在室温温育30分钟，用来检测二抗。然后将载玻片在TBS缓冲液中洗涤3次。加入Fast Blue底物(Vector Labs)，显色反应通过浸入水中予以终止。载玻片在Nuclear Fast Red(Sigma)中负染，并在水中漂洗，然后用Aqua Mount(Baxter)计数。用这种试剂在脾红髓中检测到染色，但用无关的兔多克隆Ig制备物或来自同一动物的未纯化的免疫前血清没有检测到染色。
一旦鼠血清被确定具有特异性的αd活性，就用它来对不同的淋巴样或非淋巴样组织进行染色。识别CD18、CD11a、CD11b和CD11c的单克隆抗体也在同一实验中用作对照。用αd多克隆抗血清以及针对CD11c、CD11a、CD11b和CD18的单克隆抗体对正常的脾切片的染色得到了下列结果。用αd多克隆抗血清观察到的图谱不显示以CD11a、CD11b、CD11c或CD18作为标记的相同图谱。发现了某些位于白髓的边缘区的细胞的清楚标记图谱和边缘区外周的细胞的清楚标记。该图谱用其他抗体没有观察到。分散于红髓的单个细胞也被标记，它们可能是或不是与用CD11a和CD18所见的相同细胞群体或亚群。
用CD11c标记的确显示了边缘区中的一些染色细胞，但与αd多克隆抗血清相比，抗体并没有显示围绕白髓的清晰环状图谱，在红髓中的标记也没有给出与αd多克隆血清相同的染色图谱。
因此，用αd多克隆血清所见的标记图谱与用针对其他β2(CD11a、CD11b、CD11c和CD18)的抗体所见的图谱相比是独特的。这说明，αd在人体内的分布不同于其他β2整合素。用单克隆抗体分析人αd表达的特性使用杂交瘤169A和169B分泌的抗体，用免疫沉淀法分析冷冻组织切片中的人αd表达，用流式细胞仪分析细胞系和外周血白细胞中人αd的表达。在两组实验中使用的杂交瘤上清都不稀释。组织染色所有的染色均按上面的介绍进行，除了肝切片按下面的方法进行。在丙酮固定后，切片在含1％的H2O2和1％叠氮化钠的TBS中在室温冷却15分钟。用第一抗体染色后，加入一种直接与过氧化物酶接合的兔抗鼠抗体，在室温处理30分钟。载玻片在TBS缓冲液中洗涤3次。用一种与过氧化物酶直接接合的猪抗兔抗体在室温温育30分钟来检测二抗。然后将载玻片在TBS缓冲液中洗涤三次，加入AEC底物(VectorLabs)，进行显色。载玻片用Hematoxylin Gill’s No.2(Sigma)进行负染，接着在水中漂洗，然后脱水和计数。
在脾切片中，大多数表达位于脾红髓中形态鉴定为粒细胞和巨噬细胞的细胞上。大量的粒细胞被染色，而巨噬细胞只有一个亚群产生信号。白髓中的一小部分小节树突细胞也被αd抗体微弱地染色。在整个红髓和白髓都检测到CD11a和CD18染色。CD11c染色主要见于脾白髓和围绕白髓的边缘区中的推测为巨噬细胞的大细胞，同时还发现在红髓中的分散的染色。CD11b与αd染色在红髓中的分布似乎重叠但不相同，并且没有白髓参与。
对正常和(类风湿)关节炎滑膜组织中的整合素表达也进行了比较。在正常组织中用所有抗整合素抗体(包括能与CD11a、CD11b、CD11c、CD18以及αd特异性免疫反应的抗体)发现了最少的染色，其中静止细胞(推测是巨噬细胞)广泛分布。在炎症的滑膜中，所有的整合素的表达多位于淋巴小管周围的成束的细胞。αd和CD11b的表达图谱是相似的，CD11c似乎表达不强，并且限于白细胞的一个亚群。
在狗中，CD11b而不是αd的表达见于肝巨噬细胞或枯否氏细胞。正常人肝切片的染色(与前面的狗肝切片染色的介绍一样，上文)证明了在人中这一染色图谱是保守的。此外，检测到了低水平的CD11c。在来自一个肝炎病人的切片中，所有白细胞整合素的染色都高于在正常肝中所观察到的染色，而在这些样品中αd的表达在巨噬细胞和粒细胞上被检测到。
用抗αd抗体在人结肠切片中观察到了最少的染色，并观察到微弱的平滑肌染色和白细胞染色。在来自Crohn’s病患者的切片中检测到了高水平的所有白细胞整合素。
正常的肺显示了有限数量的弱αd阳性细胞，通过形态它们被确定为巨噬细胞和中性粒细胞。在一个肺气肿病人的肺组织中，在中性粒细胞和含有血铁黄蛋白(一种含铁色素)的巨噬细胞上检测到了αd染色，这说明红细胞被这些细胞吞噬。
检测了正常脑切片和来自多发性硬化(MS)病人的斑损的整合素表达。在正常脑中，αd染色比CD11a、CD11b和CD11c的强度低，并局限于用形态学和CD68染色分型为小胶质细胞的细胞。CD11b阳性细胞位于小管周围，并分布于整个组织。CD11c+细胞似乎位于小管内，而αd+细胞围绕小管。在MS组织切片中，αd表达在小胶质细胞和非巨噬细胞的白细胞亚群上均被发现。αd+细胞位于斑损内以及整个皮层。αd信号的强度与CD11c相同，但低于CD11b的强度。
用抗白细胞整合素和抗CAM抗体对来自PDAY(青年人的动脉粥样硬化病理生理决定子，LSU医学中心)组织样品的胸主动脉和腹主动脉切片均进行了分析。检查的病灶与主动脉脂肪性条纹一致，主动脉脂肪性条纹由大的泡沫细胞(主要是带有摄入的脂的巨噬细胞)的内膜下集聚和较小的白细胞浸润组成。使用αd和其他β2整合素α链(CD11a、CD11b和CD11c)加上一个巨噬细胞标记(CD68)特异的单克隆抗体进行的单标记研究显示，多数装满脂的巨噬细胞分别表达中等水平的αd和CD18，而表达低水平或比中等水平低的CD11a和CD11c。仅微弱表达CD11b，且仅由巨噬细胞的一个亚群表达。
进行双标记研究来确定αd和ICAM-R抗原在主动脉切片中的相对定位。因为这些切片中的泡沫细胞能被对巨噬细胞标记特异的抗体Ham56染色，而不能被对平滑肌肌动蛋白特异的抗体染色，因此能够确定泡沫细胞不是由内膜平滑肌细胞衍生的。表达αd的CD68阳性的巨噬细胞被小的ICAM-R阳性白细胞包围和分开。CD68阴性但能被αd和ICAM-R抗体染色的小白细胞的数量似乎有限。
αd在正常组织中的分布似乎在静止的白细胞，其分布图谱与CD11b和CD11c的图谱重叠但不相同。CD11b和CD11c是前面已经鉴定为具有有限的白细胞分布的另外两种白细胞整合素α链。细胞形态表明，αd染色大量限于巨噬细胞和粒细胞，而淋巴细胞染色有限。一般来说，组织炎症表现为增加特定组织中观察到的白细胞数量和种类，并伴随有白细胞整合素包括αd染色的增加。因为在病理组织中白细胞整合素的细胞和空间分布是不同的，因此可以推知，在不同的情况下，对每个家族成员包括αd存在不同的功能和配体。
有趣的是，αd在早期粥样硬化病灶中的表达显示比CD11a、CD11b和CD11c要更强，这表明αd在这些病灶的建立中可能起着核心作用。αd和ICAM-R阳性细胞的并列分布，这一点被表明αd和ICAM-R之间相互作用的证据所支持，说明αd可能在这些病灶中参与早期的白细胞的募集或激活。细胞系和外周血白细胞染色抗体169A和169B在FACS中能够对前髓单核细胞细胞系HL60染色。αd在这些细胞中的表面表达受到PMA刺激的负面影响，有报道说PMA刺激诱导巨噬细胞分化途径，但不被DMSO影响，DMSO诱导粒细胞分化(Collins等，《血液》70卷，1233-1244(1987))。169A和169B与PMA刺激的FACS图谱与用抗CD11b和抗CD11c单克隆抗体中所观察到的图谱相对立。一种单核细胞系THP-1也显示能被169A和169B弱染色。此外，在FACS中，外周血白细胞中淋巴细胞和单核细胞门(gates)的一个细胞亚群显示弱阳性，而B淋巴细胞被发现没有αd的表面表达。T淋巴细胞的CD8+亚群是αd+。此外，抗体169A和169B不能在下面的细胞系中检测到抗原B细胞系JY、Ramos；嗜碱性粒细胞系KU813和T细胞系Jurkat、SKW和Molt 16。
根据HL60细胞的结果，粒细胞用ficoll/hypaque梯度离心并接着裂解血红细胞的方法从外周血中分离。通过在乙酸中观察核形态，发现所有的制备物＞90％为PMNs。单独的制备物用50ng/ml的PMA或10-8M甲酰化肽(fMLP)刺激30分钟，使可能的细胞内整合素贮存释放。相对于一种IgG1对照，未刺激的群体显示低但却明显的169A和169B抗原的表达，在刺激后观察到可以察觉的提高。在PMNs中，αd和CD11c的表面表达比在HL60细胞中更相似。随后抗体169B被用来沉淀来自生物素化的PMNs的一种去污剂裂解物的异源二聚体分子，该分子含有分别约150和95kD相当于αd和CD18大小的亚单位。
αd在PMNs上的存在不能由已知的有关犬αd表达的信息进行预测。犬中性粒细胞不象其人对应物，它表达T辅助细胞标记CD4，还表达整合素VLA-4，因此在狗中可能有与在人中不同的配体和功能。PBL亚族的染色本研究用来确定这种β2整合素在人外周血白细胞中的分布。此外，还对αd的细胞表面密度相对于其他β2整合素进行了比较。最后，还对纯化的人嗜酸性粒细胞中αd表达的急性调节进行了评价。
人外周血白细胞用密度梯度分离成单个核细胞级份(含单核细胞、淋巴细胞和嗜碱性粒细胞)和粒细胞(中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)(Warner等，《免疫学方法杂志》105卷，107-110页(1987))。对于某些实验，嗜酸性粒细胞用CD16免疫磁选择纯化至纯度大于95％(Hansel等，《免疫学方法杂志》122卷，97-103页(1989))。皮肤肥大细胞用酶解的方法从人皮肤中分离，并按前述方法进行富集(Lawrence等，《免疫学杂志》139卷，3062-3069页(1987))。
细胞用适当稀释的CD11a(MHM24)、CD11b(H5A4)、CD11c(BU-15)或αd(169A)特异的单克隆抗体进行标记。还使用一种鼠对照抗体。洗涤细胞，然后与藻红蛋白接合羊抗鼠IgG一起温育。在一些实验中，细胞与过量的鼠IgG和FITC-标记的鼠单克隆抗体或羊多克隆抗体一起温育，上述抗体特异于特定细胞(例如，CD3、CD4或CD8对T细胞特异；CD16+淋巴细胞对NK细胞特异；抗-IgE对嗜碱性粒细胞特异(Bochner等，《免疫学方法杂志》125卷，265-271页(1989))。然后用流式细胞仪(Coulter EPICS Profile)检测样品，使用不同的选通(gating)来鉴定细胞亚群。
为进行使用嗜酸性粒细胞的研究(在该研究中检测了αd表达的急性上调)，在用不同的单克隆抗体按前述方法进行标记前，细胞用佛波酯(10ng/ml)、RANTES(100ng/ml)(Schall，《细胞因子》3卷，165-183页(1991))或IL-5(10ng/ml)刺激15分钟。
结果显示，αd在所有的外周血嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、单核细胞和NK细胞上出现。一小类(约30％)CD8+淋巴细胞也被发现表达αd。皮肤肥大细胞和CD4+淋巴细胞不表达αd。一般来说，CD11a和CD11b以比αd高的密度出现在淋巴细胞上，后者以相对低的类似于CD11c的水平表达。在白细胞中，单核细胞和CD8+细胞具有最高密度的αd，而嗜酸性粒细胞具有最低水平的αd表达。在中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和NK细胞中的表达处于中间。
用CC趋化因子RANTES刺激外周嗜酸性粒细胞没有导致任何一种β2整合素表达的改变。然而用佛波酯处理在CD11b和αd的表达中产生了2至3倍的增加，但不影响CD11a或CD11c的表达。IL-5处理导致CD11b表达的选择性上调，而不影响其他整合素亚单位的水平。
综合起来，这些结果表明，在外周血白细胞中，αd一般以与CD11c相当的水平表达。最高的表达水平被发现于单核细胞和CD8+淋巴细胞的一个亚群。人皮肤肥大细胞不表达αd。纯化的嗜酸性粒细胞似乎具有CD11b和αd的前体的细胞质内贮存库。但IL-5相对PMA显示的不同上调说明，这些贮存库各不相同。
还使用组合的选通和表面标记用流式细胞仪按前面的介绍对外周血白细胞(PBL)亚群的染色图谱进行了测定，来更精确地确定169A/B阴性的淋巴细胞群体。PBL按前述方法在Ficoll上分离，并分别用169A、169B和针对CD14(单核细胞/巨噬细胞标记)、CD20(B细胞)、CD56(NK细胞)、T细胞受体α/β(T细胞)、CD16(中性粒细胞、NK细胞)和α4(中性粒细胞的一个阴性标记)的抗体染色。门用大小和标记分布来确定。
结果显示，在CD14+单核细胞门中的细胞显示低水平的169A和169B染色。在淋巴细胞门中的早期实验中观察到的双峰表达图谱用增加向前散射进行了解决。混合的TCR+/CD20+群体显示具有较低但一致水平的169A/B表达，而一个对CD56有50％染色阳性、定位在略高侧向散射(细胞复杂性)的细胞群体，显示具有不同的169A/B阴性群体。该阴性群体也不为TCR、CD20、CD14或CD16抗体识别。αd的滑膜分布为确定αd、其他β2整合素及其反受体在炎症和非炎症滑膜中的细胞分布，针对不同β2整合素和免疫球蛋白超基因家族的单克隆抗体被用于免疫组织学研究。在正常、骨关节炎和类风湿关节炎滑膜组织样品中的蛋白表达得到了测定。
结果显示，滑膜衬细胞层表达高水平的VCAM-1、CD11b/CD18和αd/CD18。在这些细胞中，CD11c/CD18表达受到限制，CD11a/CD18一般检测不到。在类风湿关节炎滑膜炎中，滑膜细胞层中β2整合素的表达的增加与增生的程度成比例。表达CD11c的细胞比例显著增加，接近CD11b和αd的比例，但CD11a的表达没有增加。
在组织的衬下区域，CD3/CD11a/ICAM-R+淋巴细胞的集聚和扩散浸润，散布于CD68/CD11b/αd+巨噬细胞中。集聚的显著数量证明特别是在T细胞富含区域的强烈αd表达。
滑膜内皮细胞不同地表达ICAM-1和ICAM-2，极少有ICAM-R表达的证据。
综合起来，这些结果显示，滑膜巨噬细胞和巨噬细胞样的滑膜细胞组成地表达高水平的β2整合素CD11b和αd。在滑膜炎中，在衬区域和衬下区域都有该亚群细胞的扩增，并伴随着CD11c表达的明显增加。类风湿滑膜T淋巴细胞的特殊群体除了表达CD11a和ICAM-R，还表达高水平的αd，后一分子已在前面显示在外周血淋巴细胞中以低水平表达。αd在患病的肺和肝组织中的表达将来自一个结节病个体的肺组织和来自两个硬化个体的肝组织制成6um厚的切片，并在Superfrost Plus(VWR Scientific)载玻片上在室温中空气干燥15分钟。在使用前，载玻片在50℃温育大约5分钟。切片在室温下在冷冻的(4℃)丙酮(EM Science)中固定2分钟，并在室温下空气干燥。将切片置于100ml 1X TBS、1.1ml 30％H2O2(Sigma)、1.0 NaN3(Sigma)的溶液中，在室温放置15分钟，以除去内源性的过氧化物酶活性。每个切片用150ul含有20％正常人血清(Boston Biomedica)、5％正常大鼠血清(Harlan)和2％BSA(Sigma)的1X TBS溶液在室温下封闭30分钟。温育后，轻轻地从切片上吸干溶液。第一抗体按10ug/ml的蛋白浓度在封闭溶液中制备，并在每个组织切片上加入75ul，在室温处理1小时。温育后，切片在1X TBS中洗涤三次，每次5分钟，以除去未结合的抗体。在最后一次洗涤后，吸去组织周围多余的TBS。生物素化的大鼠抗小鼠抗体(Jackson Laboratories)在封闭溶液中稀释至1∶400，并在每个切片中加入75ul，在室温处理30分钟。载玻片用1X TBS洗涤2次，每次5分钟。过氧化物酶接合的羊抗生物素抗体(VectorLaboratories)在封闭溶液中稀释至1∶200，并在每个切片中加入75ul，室温处理30分钟。载玻片用1X TBS洗涤2次，每次洗涤5分钟。加入底物3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)(Vector Laboratories)或二氨基联苯胺(DAB)底物(Vector Laboratories)，浸入水中使显色过程终止，载玻片在Gill’s苏木精#2(Sigma)中负染，在水中漂洗，然后用Aquamount(Baxter)或Cytoseal(VWR)进行计数。
在结节病肺中，只有217L单克隆抗体染上细胞，多数217L表位表达位于肉牙肿。肉牙肿中的巨大细胞显示为217L抗原阴性。217L表位的表达位于形态学显示为上皮组织细胞的细胞上，这种细胞是巨噬细胞系的高度分化的吞噬细胞型细胞。在结节病肺中其他整合素的分布被观察到与217L表位的分布重叠，但表达图谱不同。例如，对所有其他整合素免疫特异的抗体能够标记217L染色阴性的肉牙肿中的细胞以及巨大细胞。
来自第二个被诊断为结节病的病人的切片为217L表位表达阴性。但从病理报告中看不出该病人是否接受过类固醇免疫抑制剂，这是最常见形式的治疗。
在来自硬化的肝组织的切片中，抗αd抗体标记肝小节之间的结缔组织中的泡沫细胞以及淋巴细胞的一个亚群。CD11c的分布与αd表达重叠但不一样，抗CD11c抗体也标记一个泡沫细胞亚群，但比抗αd抗体标记更多的巨噬细胞和淋巴细胞。CD11a和CD11b表达的分布与αd表达没有明显的重叠。
抗体217L也能染上束状的并从212D和217L鉴定的群体中分离出来的吞噬细胞型细胞。针对CD11b和CD11c的抗体以不同的方式染上217L+束。
在相关的实验中，用抗体212D和217L对人脾组织切片以及来自非人的灵长动物M.nemestrina的系列切片进行染色。还用流式细胞仪评价来自新鲜的人和猴脾组织的脾细胞中αd的表达。抗体212D和217L都能识别人和猴脾细胞。用ICC和FACS，αd+群体均占总细胞的约20％，不像在啮齿动物中显示更大百分比的αd+细胞。阳性细胞显示与巨噬细胞形态相同。人骨髓染色人骨髓样品按照标准方法获自正常骨髓供体的髂骨。原始样品在Iscove’s培养基中按1∶3稀释，在2000 RPM离心20分钟。小心收集浅黄衣层，洗涤一次，在溶血缓冲液(0.83％氯化铵、0.1％碳酸钠、无EDTA)中溶血。细胞重悬于含15％FBS的PBS中，分成100ul中的100,000细胞/管，置于冰上。按前述方法进行免疫染色。简而言之，在每孔中分别加入单克隆的鼠抗αd抗体212D或217L或鼠抗人CD18或鼠抗人CD50(ICAM-R特异)抗体至终浓度10ug/ml，混合物在冰上温育20分钟。将细胞洗涤两次，并与羊抗鼠FITC再另外保温20分钟。细胞洗涤两次，并重悬于1％低聚甲醛中。用荧光激活细胞分选仪FACSCAN(Becton Dickinson)测量荧光。
四个实验的结果显示，αd表达用212D抗体测定时见于13至43％的细胞上(中间值27％)、用217L时见于6-55％的细胞上(中间值21％)，CD18表达见于60-96％的细胞上(中间值71％)，CD50见于86-99％细胞上(中间值94％)。αd在乳腺癌病人外周血单个核细胞上的表达使用Ficoll分离法从经过了骨髓移植的高危乳腺癌病人的血液样品中分离外周血单个核细胞。高危乳腺癌病人即预后不良的乳腺癌病人。按上述方法用免疫染色来筛选表达αd的细胞。
结果显示，αd表达用212D抗体测定时发现在20％的细胞上，用217L时在13％的细胞上。抗体212D还染上了显示很可能是淋巴细胞的小细胞的一个亚群。表达αd的细胞的百分比与在正常血液供体中一般观察到的百分比相当。
此外，抗体212D显示不仅染上为CD14+的大细胞，还能染上实验鉴定为CD3+的小得多的细胞。在血液和骨髓中都观察到这个结果。
表达αd细胞的数量的变化可以用从不同供体抽取的骨髓细胞组成的变化来解释(例如骨髓数量与循环血数量相比)。实施例19αd表达的上调因为白细胞整合素在血液透析中和慢性肾衰竭中观察到的免疫改变中一般上调(Rabb等，《 J.Am.Soc.Nephrol.》，6卷，1445-1450页(1995)和Rabb等《Am.J.Kidnet Dis.》23卷，155-166页(1994))，我们检测了在血液透析和慢性肾衰竭中αd/CD18的表面表达。此外，还研究了在PKC刺激后αd/CD18在体外的表达。
全血样品获自5个随机选择的没有肾病的住院病人。在表面染色和流式细胞仪分析前，血液样品与50ng/ml的PMA在37℃温育30分钟。同时也从患有慢性肾衰竭的病人中收集血液样品。病人情况稳定，没有糖尿病，每周三次进行血液透析。基线样品在开始透析前获取，接着在用一个cuprophane膜透析中15分钟和180分钟抽取样品。使用来自不患有已知疾病的正常个体的血液样品作为对照。
为进行细胞染色，将5ug的抗体169A和169B(和一个阴性对照1B7)与100ul全血在暗处温育15分钟。在每个混合物中加入BectonDickinson裂解试剂(2ml)，在暗处继续温育10分钟。然后沉淀细胞，重悬于PBS。离心再次沉淀细胞，并与FITC接合的二抗混合，在暗处温育30分钟。然后将细胞用PBS洗涤、离心、弃去上清、重悬于1.0％福尔马林。
使用Rabb等《J.Am.Soc.Nephrol.》6卷，1445-450页(1995))的方法进行流式细胞术。样品用Simulset软件(Becton Dickinson)在FACscan流式细胞仪(Becton Dickinson)上进行分析。每个样品最少分析22,000个细胞。粒细胞、单核细胞和淋巴细胞亚群用前向光散射和侧向光散射进行分门。细胞亚群的纯度用CD45染色和CD14染色进行评价。
结果显示，αd/CD18的表达可在从正常人供体抽取的血液中检测到，表达在单核细胞上最高，在淋巴细胞上最低。在中性粒细胞上的表达介于单核细胞和淋巴细胞之间。用抗体169B染色弱于用抗体169A染色。PMA处理上调αd/CD18表达，特别是在中性粒细胞和单核细胞上。
在来自肾衰竭病人的样品中，在开始透析前，αd/CD18的表达在中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞上检测到。在使用白细胞激活膜透析15分钟后，检测到αd/CD18表达的少量增加。在处理的后期，单核细胞和淋巴细胞上的表达实际上减少。这个结果表明，αd/CD18表达与观察到的透析后CD11a/CD18、CD11b/CD18和L-选择素的表达不同。实施例20大鼠cDNA的分离因为犬和人αd亚单位都存在，我们设法在其他物种包括大鼠(本实施例)、小鼠(实施例20，上文)中分离同源性基因。
从一个大鼠脾λgt10文库(Clontech)中获得了显示与人αd基因同源的大鼠cDNA的部分序列。将该文库按2×104pfu/板铺于150mmLBM/琼脂平板。按标准方法(Sambrook等《分子克隆实验室手册》2.110页)的介绍，将文库提呈到Hybond膜上(Amersham)，变性3分钟，中和3分钟，用缓冲液洗涤5分钟。立即将膜置于一个Stratalinker(Stratagene)上，用自动交联装置使DNA交联。将膜分别在低度和高度严格条件下，在30％或50％甲醛中进行预杂交和杂交。先用一种32P标记的探针对膜进行筛选，该探针从人αdcDNA中制备，并相当于克隆19A2(SEQ ID NO1)的碱基500至2100。探针使用Boehringer Mannheim’s随机引物试剂盒按照厂商推荐的程序进行标记。滤膜用2X SSC在55℃进行洗涤。
鉴定了两个克隆，它们被命名为684.3和705.1，它们显示与人αd、人CD11b、和人CD11c序列同源。两个克隆都在基因的3’区域与人αd基因匹配，对684.3来说，起始于碱基1871而延伸至碱基3012，对克隆705.1，为碱基1551至3367。
为分离包含5’区域的更完整的大鼠序列，使用初次筛选中同样的程序，但使用由克隆A1160制备的一种鼠探针(见实施例20，上文)，对相同的文库进行再次筛选。从第二次筛选选择单个、分离的噬菌斑，在LBM/琼脂平板上维持为单个克隆。在一个标准的PCR程序中使用测序引物434FL和434FR(分别为SEQ ID NO34和35)来制备用于测序的DNA。5’-TATAGACTGCTGGGTAGTCCCCAC-3’ (SEQ ID NO34)5’-TGAAGATTGGGGGTAAATAACAGA-3’ (SEQ ID NO35)PCR产生的DNA用Quick自旋柱(Qiagen)按照厂商推荐的程序进行纯化。
鉴定了两个克隆，它们被命名为741.4和741.11，它们与克隆684.3和705.1重叠，在重叠区域，克隆741.4和741.1与克隆684.3和705.1 100％同源。一个合并的与人αd基因具有同源性的大鼠cDNA列于SEQ ID NO36，预测的氨基酸序列列于SEQ ID NO37。大鼠αd5’端的克隆使用一个Clontech大鼠脾RACE克隆试剂盒，按照厂商推荐的程序，获得了一个大鼠αd基因5’cDNA片段。使用的基因特异的寡核苷酸被命名为741.11#2R和741.11#1R(分别为SEQ ID NO59和58)。5’-CCAAAGCTGGCTGCATCCTCTC-3’ (SEQ ID NO59)5’-GGCCTTGCAGCTGGACAATG-3’ (SEQ IN NO58)寡核苷酸741.11#2R包含SEQ ID NO36中的131-152碱基对，但方向相反；741.11#1R包含SEQ IN NO36中的696-715碱基对，方向也相反。使用3’-多数寡核苷酸741.11#1R进行初次PCR。接着用寡核苷酸741.11#2R和初次反应产生的DNA进行第二次PCR。在1％琼脂糖凝胶上检测到了大约300碱基对的一条带。
将第二次PCR的产物按照厂商推荐的程序连接到质粒pCRTAII(Invitrogen)中。挑取白色(阳性)克隆，并加入到100ul含有1ul的50mg/ml羧苄青霉素贮存液和1ul的M13 K07噬菌体培养物的LBM中，并分别加入到一个圆底96孔组织培养板的单个孔中。混合物在37℃温育30分钟至1小时。初次温育期之后，加入100ul的LBM(含有1ul的50mg/ml羧苄青霉素贮存液和10mg/ml卡那霉素贮存液的1∶250稀释物)，继续在37℃温育过夜。
使用无菌的96孔金属转移吸头，将96孔板的上清转移到4张Amersham Hybond尼龙滤膜上。按照标准程序将滤膜变性、中和和交联。滤膜在20ml预杂交缓冲液(5X SSPE，5X Denhardts、1％ SDS、50ug/ml变性鲑精DNA)在50℃预杂交数小时并摇动。
寡核苷酸探针741.11#1和741.11#1R(分别为SEQ ID NO56和57)包含碱基对86-105(SEQ ID NO36)，分别为正向和反向，它们按下面方法进行标记。5’-CCTGTCATGGGTCTAACCTG-3’ (SEQ ID NO56)5’-AGGTTAGACCCATGACAGG-3’ (SEQ ID NO57)将12ul dH2O中的大约65WP寡核苷酸DNA加热至65℃两分钟。在试管中加入3ul的10mCi/mlγ-32P-ATP，并加入4ul 5X激酶缓冲液(Gibco)和1ul T4 DNA激酶(Gibco)。混合物在37℃温育30分钟。温育之后，将16ul的每种标记的寡核苷酸探针加入预杂交缓冲液中和滤膜上，并在42℃继续杂交过夜。滤纸在5X SSPE、0.1％ SDS中在室温下洗涤三次，每次5分钟，并放射性自显影6小时。将阳性克隆扩增，并使用Magic Mini Prep Kit(Promega)按照厂商推荐的程序纯化DNA。克隆2F7被选择来进行测序，并在重叠区域显示与克隆741.11有100％的同源性。完整的大鼠αd核酸序列列于SEQ ID NO54，其氨基酸序列列于SEQ ID NO55。大鼠cDNA和氨基酸序列的特征大鼠β2整合素α亚单位的核酸和氨基酸序列在以前都没有报道。但与已报道的人β2整合素α亚单位的序列比较表明，分离到的大鼠克隆和其预测的氨基酸序列与αd核苷酸和氨基酸序列最密切相关。
在核酸水平，分离的大鼠cDNA克隆与人αdcDNA比较时显示80％的同一性，与人CD11b比较时显示68％的同一性，与人CD11c比较时显示70％的同一性，与鼠CD11b比较时显示65％的同一性。在与人CD11a和鼠CD11a比较时，没有明显的同一性。
在氨基酸水平，由分离cDNA编码的预测大鼠多肽在与人αd多肽比较时显示70％的同一性，在与人CD11a比较时显示28％的同一性，在与人CD11b比较时显示58％的同一性，在与人CD11c比较时显示61％的同一性，在与鼠CD11a比较时显示28％的同一性，在与鼠CD11b比较时显示55％的同一性。实施例21大鼠组织αd表达的Northern分析从一组Lewis大鼠组织中提取RNA来用一种大鼠αd探针进行Northern分析。样品包括来自正常的脾、肾、肝、肺和骨髓的总RNA，加上来自正常脾、脑、脊髓、胸腺、皮肤、小肠、大鼠抗原激活的T细胞、患EAE病(实验性过敏性脑脊髓炎)的脾和淋巴结的poly(A+)RNA。实验使用实施例6介绍的技术进行。
αd探针选自大鼠cDNA的一个区域，包括SEQ ID NO54中的1184-3008核苷酸，该区域代表与大鼠CD11c和CD11b具有最低程度的同源性的区域。该1124 bp探针通过用EcoRI内切酶消化10ug大鼠αdcDNA克隆684.3来制备。该片段用凝胶纯化，并按实施例6中的介绍用于一个随机引物标记反应。Northern印迹按实施例6中介绍的预杂交、杂交和洗涤来进行，除了探针按5.5×105cpm/ml加入到杂交缓冲液中。
放射性自显影5天后，在含有脾总RNA以及来自正常鼠及来自患有活跃的EAE大鼠的脾的poly(A+)RNA泳道中检测到条带，在患有活跃的EAE的大鼠中，RNA的量明显大于来自正常鼠的RNA量。检测到的转录物的大小与全长大鼠cDNA克隆的大小一致。实施例22啮齿动物αd特异性抗体-针对大鼠αdI结构域/Hu IgG4融合蛋白的抗体的制备和特征分析由于已经证明人β2整合素的I结构域参与配体结合，可以推测对大鼠αd蛋白也是同样。因此对大鼠αdI结构域免疫特异的单克隆抗体有αd结合参与的人疾病的大鼠模型中是有用的。
寡核苷酸“大鼠α-DI5”(SEQ ID NO87)和“大鼠α-DI3(SEQIN NO88)从大鼠αd序列中制备，它们分别相当于SEQ ID NO54中的碱基对469-493和碱基对1101-1125(相反方向)。将寡核苷酸用于一个标准的PCR反应，来制备一个含有跨越相当于SEQ ID NO54中碱基对459-1125的I结构域的大鼠αdDNA片段。将PCR产物按照厂商推荐的程序连接到载体pCRTAII(Invitrogen)中，选择一个阳性克隆并扩增，用一个Qiagen(Chatswoth，GA)Midi Prep试剂盒按照厂商推荐的程序纯化DNA。DNA用XhoI和BglII在一个标准的反应中酶消化，用凝胶纯化一个600碱基对的带，并随后将其连接到pDCS1/HuIgG4表达载体中。选择一个阳性克隆扩增，用一个QiagenMaxi Prep试剂盒纯化DNA。
将COS按半汇合铺于100mm培养皿，在37℃在7％CO2中生长过夜。细胞用5ml的DMEM漂洗一次。在5ml DMEM中，加入50ul DEAE-葡聚糖、2ul氯喹和15ug前面介绍的大鼠αdI结构域/HuIgG4DNA。将混合物加入COS细胞，在37℃温育3小时。然后移出培养基，在精确的1分钟内加入5ml CMF-PBS中的10％DMSO。细胞用DMEM温和地洗涤一次。在细胞中加入10ml含有10％FBS的DMEM，继续在37℃在7％CO2中温育过夜。第二天，用新鲜的培养基代替培养基，并继续再培养另外3天。收集培养基，并在板中加入新鲜的培养基。三天后，再收集培养基，弃去板。重复上述过程，直到收集到2升培养上清。
将按前述方法收集的上清上一个Prosep-A柱(Bioprocessing)并按下面的介绍纯化蛋白。
先用15倍体积的含35mM Tris、150mM NaCl、pH7.5的洗涤缓冲液洗涤柱，将上清以低于60柱体积/小时的低速率上柱。上柱后，用15倍体积的洗涤缓冲液、15倍体积的0.55M二乙醇胺、pH8.5和15倍体积的50mM柠檬酸、pH5.0洗柱。蛋白用50mM柠檬酸、pH3.0洗脱。蛋白用1.0M Tris、pH8.0中和，并在无菌PBS中透析。
大鼠αdI结构域蛋白用实施例14介绍的方法进行分析。检测到的蛋白以与人I结构域蛋白观察到的相同方式迁移。制备针对大鼠αdI结构域/HuIgG4融合蛋白的单克隆抗体小鼠分别用预先在等体积的福氏完全佐剂(FCA)(Sigma)中乳化的50ug纯化的大鼠αdI结构域/HuIgG4融合蛋白进行免疫。将大约200ul抗原/佐剂制备物注射到每只小鼠背部和侧部的4个位点。两周后，小鼠通过注射100ul预先在等体积的福氏不完全佐剂(FIA)中乳化的大鼠αdI结构域/HuIgG4抗原(50ug/鼠)进行加强免疫。另外两周后，小鼠用200ul PBS中的50ug抗原经静脉进行加强免疫。
为评价免疫小鼠中的血清滴度，在第三次免疫后10天对动物进行眼窝后取血，使眼窝后血凝集，并离心分离血清。将血清用于生物素(BIP)标记的大鼠脾细胞的免疫沉淀。来自每只小鼠的血清都能免疫沉淀大鼠αd和大鼠CD18的预期分子量的蛋白条带。选择一只小鼠进行融合，并按第三次加强免疫中介绍的方法进行第四次加强。
杂交瘤上清按下面的介绍用抗体俘获法进行筛选。Immulon 4板(Dynatech，Cambridge，Massachusetts)在4℃按50ul/孔用在50mM碳酸钠缓冲液、pH9.6中1∶5000稀释的羊抗鼠IgA、IgG或IgM(Organon Teknika)进行包被。板用含有0.05％ Tween20的PBS(PBST)洗涤三次，并加入50ul培养上清。在37℃温育30分钟后，按前述方法洗涤。加入在PBST中1∶3500稀释的辣根过氧化物酶接合的羊抗鼠IgG9(Fc)(Jackson ImmunoResearch，West Grove，Pennsylvania)。板按前述方法进行温育，并用PBST洗涤四次。紧接着，加入含有1mg/ml邻苯二胺(Sigma)和0.1ul/ml 30％ H2O2的100mM柠檬酸、pH4.5的底物。5分钟后加入50ul的15％硫酸终止颜色反应。在Dynatech读板仪上读出490nm处的吸收。
来自含有抗体的孔中的上清也用固化的大鼠αdI结构域/HuIgG4融合蛋白进行ELISA分析。一个用HuIgG4抗体包被的板进行的ELISA用作针对IgG融合伙伴反应的对照。选择阳性孔用下面介绍的技术在大鼠脾细胞裂解物上用BIP进一步筛选。大鼠αdI结构域/HuIgG4融合蛋白多克隆抗血清的制备在用福氏完全佐剂(FCA)中的100ug纯化的大鼠αdI结构域/HuIgG4融合蛋白进行免疫前，对两只兔预先采血。每三周用福氏不完全佐剂(IFA)中的相同剂量重复注射。三次注射后，对兔进行实验采血，并将收集的血清用于大鼠脾细胞裂解物上的一个标准免疫沉淀。结果确定，来自两只兔的血清均能与大鼠αd免疫反应。再用IFA中的100ug抗原对兔进行加强免疫，并用免疫沉淀分析收集的血清与大鼠αd免疫反应的提高。10天后给予动物最后一次加强免疫，放血，收集血清。大鼠αd的组织学按实施例18中介绍的技术将针对大鼠αd“I”结构域制备的兔多克隆血清用于兔组织切片的染色。在冷冻和石蜡包埋的大鼠脾切片上的染色图谱与用针对人αd抗体所观察到的图谱相同，染色的单个细胞分布于整个红髓。该染色图谱与用针对大鼠CD11a、CD11b和CD18的单克隆抗体观察到的图谱不同。此外，在胸腺中观察到了单个细胞分布于整个皮层的阳性染色图谱。这些组织在用免疫前的兔血清染色时，不能产生任何信号。抗体特异性分析大鼠用CO2窒息处死，用标准的外科技术取出脾脏。将脾脏在20mlRPMI中用一个3cc注射器塞轻推过一个金属筛来收集脾细胞。将细胞收集到一个50锥型试管中，并在适当的缓冲液中洗涤。
细胞在冷D-PBS中洗涤三次，并以108至109的细胞密度重悬于40ml PBS。在细胞悬液中加入4mg的NHS-Biotin(Pierce)，反应在室温下继续精确进行15分钟。沉淀细胞，在冷D-PBS中洗涤三次。
细胞按108细胞/ml重悬于冷的裂解缓冲液中(1％NP40、50mMTris-HCl、pH8.0、150mM NaCl、2mM CaCl2、2mM MgCl、1∶100的抑胃酶肽、亮抑酶肽和抑酶肽溶液，在加入细胞前加入；0.0001克PMSF晶体，在加入细胞前加入)。将裂解物振荡旋转30秒，在室温温育5分钟，并在冰上温育15分钟。将裂解物在10,000g离心10分钟使不溶物沉淀。将上清收集到一个新管，贮存在4℃至-20℃之间。
将1ml裂解物与200ul蛋白A琼脂糖淤浆(Zymed)在4℃温育过夜进行预清除。将预清除的裂解物按50ul/管分装到Eppendorf管中用于每种检测抗体。将25ul多克隆血清或100至500ul单克隆抗体上清加入预处理的裂解物中，并将获得的混合物在4℃旋转温育2小时。然后加入与PBS中的蛋白A琼脂糖珠结合的100ul兔抗鼠IgG(Jackson)，继续在室温旋转温育30分钟。轻微离心使珠沉淀，并用冷洗涤缓冲液(10mM HEPES、0.2M NaCl、1％ Trition X-100)洗涤三次。吸出上清。加入20ul含有10％β-巯基乙醇的2X SDS样品缓冲液。样品在水浴槽内煮沸2分钟。将样品上5％SDS PAGE凝胶，分离后，将蛋白用恒定电流过夜转移至硝酸纤维膜上。硝酸纤维滤膜用含3％BSA的TBS-T在室温封闭1小时，弃去封闭缓冲液。加入在0.1％BSA TBS-T中1∶6000稀释的链亲和素-HRP接合物(Jackson)，在室温继续温育30分钟。滤膜用TBS-T洗涤三次，每次15分钟，并用Amersham’s ECL试剂盒按照厂商推荐的程序进行放射性自显影。针对全长大鼠αd蛋白的单克隆抗体的制备从大鼠脾细胞中纯化大鼠αd来制备用于产生抗大鼠αd单克隆抗体的免疫原。收集来自约50只12-20周龄的正常雌性Lewis大鼠的脾脏，并通过使其通过一个精密的金属筛从组织制备一个单细胞悬液。在含有150mM NH4CL、10mM KHCO3、0.1mM EDTA、pH7.4缓冲液裂解除去红细胞，余下的白细胞用磷酸缓冲盐(PBS)洗涤两次。离心沉淀脾细胞，并在含有50mM Tris、150mM NaCL、2mM CaCl2、2mM MgCl2、10mM PMSF、亮抑酶肽、抑胃酶肽和1％ Triton X-100的缓冲液中裂解。脾细胞裂解按每ml裂解缓冲液5×108脾细胞在冰上进行30分钟。离心除去不溶物质。
CD11a、CD11b和CD11c按下面方法用免疫沉淀从脾裂解物中除去。将体积为750ul的蛋白A-琼脂糖淤浆与2mg兔抗鼠免疫球蛋白在4℃温育30分钟。兔抗鼠-蛋白A-琼脂糖用裂解缓冲液洗涤三次，并悬浮于终体积为1.5ml的裂解缓冲液中。将大约200ug的每种大鼠β2整合素特异的单克隆抗体515F(大鼠CD11a特异)、OX-42(大鼠CD11b特异)和100g(大鼠CD11c特异)加入每个50ml的大鼠脾裂解物中。在4℃温育30分钟后，将500ul的兔抗鼠-蛋白A-琼脂糖加入到脾裂解物中，颠倒旋转在4℃混合30分钟。将裂解物在2500×g离心10分钟沉淀与兔抗鼠-蛋白A-琼脂糖结合的CD11a、CD11b和CD11c，将上清转至一个干净的50ml离心管。用抗体515F、OX-42和100g另外重复沉淀两次以保证完全清除CD11a、CD11b和CD11c。
裂解物中剩余的β2整合素用亲和纯化方法进行分离。将约250ul与CHBr-琼脂糖接合的抗大鼠CD18单克隆抗体20C5B淤浆加入到裂解物中，在4℃颠倒旋转混合30分钟。在2500×g离心10分钟使抗体/抗原复合物沉淀，沉淀用裂解缓冲液洗涤三次，然后贮存于4℃。Armenian仓鼠的免疫1.6-8周龄的Armenian仓鼠先用50ug在福氏完全佐剂中乳化的含大鼠αdI结构域与人IgG4重链融合的重组蛋白进行免疫。初次免疫之后接着在14、33和95天用在福氏不完全佐剂中乳化的大鼠αdI结构域/HuIgG4进行免疫。并接着进行两次单独的融合，它们被命名为197和199。
在融合197前4天(306天)，对一只仓鼠给予纯化自脾细胞的大鼠αd蛋白和大鼠αd转染的CHO细胞的合并物。在融合前三天(307天)用纯化的大鼠αd蛋白和αd转染的CHO细胞进行加强免疫。大鼠αd转染的CHO细胞按下面的方法制备。
将一个编码全长的大鼠αd蛋白的基因插入到pDC1载体中，并与一个人CD18-pRC结构一起电转化到CHO细胞中。转染细胞在存在次黄嘌呤的条件下生长以选择成功地转染了pRC结构的细胞，并在存在G418的条件下生长以选择转染了pDC1结构的细胞。三周后，细胞用大鼠αd特异的兔多克隆血清染色，并用FACS分类。收集表达高水平的表面αd的一小百分比的细胞(大约占总数的3％)，并进一步扩增。重复FACS选择数次来提供αd高水平表面表达的细胞群体。
αd转染的细胞也用流式细胞术使用一种大鼠αd特异的多克隆血清和一种人CD18特异的单克隆抗体TS1.18.1进行分析。结果证明，转染的CHO细胞表达高水平的大鼠αd和人CD18。
最后，细胞中αd和CD18的表达用免疫沉淀进行评价。一种大鼠αd特异的兔多克隆血清被发现免疫沉淀两种不同分子量的蛋白高分子量蛋白为约170kD，低分子量蛋白为约95kD。这些发现与转染CHO细胞表面大鼠αd/人CD18异源二聚体复合物的表达一致。
在融合那天，取出脾脏，将组织在浸入在补加有2mM L-谷氨酸、1mM丙酮酸钠、100单位/ml青霉素和100ug/ml链霉素的无血清RPMI1640中的两个显微镜载玻片的磨沙端研磨，形成单个细胞的悬液(RPMI)(Gibco，Canada)。细胞悬液滤过一个无菌的70筛Nitex细胞滤过器(Becton，Dickinson，Parsippany，New Jersey)。在200×g离心5分钟洗涤2次。所获得的沉淀重新悬浮于20ml无血清RPMI。从三只Balb/c幼鼠取出的胸腺细胞也用同样的方法进行制备。在融合前，将在融合前三天用含10％Fetalclone血清(FCS)(HycloneLaboratories，Logan，Utah)的RPMI维持在对数生长期的NS-1骨髓瘤细胞，在200×g离心5分钟，沉淀用前面介绍的方法洗涤两次。
将大约1.15×108脾细胞与5.8×107NS-1细胞混合，离心并吸出上清。敲击试管取出细胞沉淀，并在1分钟内加入7ml 37℃的PEG1500(75mM Hepes、pH8.0中50％)(Boehringer Mannheim)，并搅动。在接着的7分钟内加入另外14ml无血清RPMI。再加入8ml的RPMI。细胞在200×g离心10分钟。弃去上清。沉淀重新悬浮于200ml含有15％FBS、100mM次黄嘌呤钠、0.4mM氨基蝶呤、16mM胸腺嘧啶(HAT)(Gibco)、25单位/ml IL-6(Boehringer Mannheim)和1.5×106胸腺细胞的RPMI。悬液按200ul/孔分于10个96孔平底组织培养板(Corning，联合王国)上。在融合后的第4、5、6和7天饲喂细胞，方法是用一只18G针(Becton Dickinson)从每孔中吸出约100ul，按前面介绍的方法除了不含胸腺细胞外加入100ul/孔的铺板培养基。
在融合后的第10天，来自融合孔的上清用流式细胞仪检测其与大鼠αd/人CD18转染的CHO细胞的反应性。将约5×105大鼠αd转染的CHO细胞重悬于50ul含有2.0％FBS和0.05％叠氮化钠的RPMI中，加入96孔圆底板中的约100ul杂交瘤上清中。染色的阳性对照包括兔抗αd多克隆血清和TS1/18(抗人CD18)。细胞在冰上温育30分钟，在FACS缓冲液(RPMI，2.0％FBS、0.05％叠氮化钠)中洗涤三次，并与一种在FACS缓冲液中最终稀释为1∶200的FITC接合的羊抗仓鼠抗体(Jackson ImmunolResearch Labs)在冰上温育30分钟。细胞在FACS缓冲液中洗涤三次，重悬于200ml的FACS缓冲液。样品用BectonDickinson FACscan分析仪进行分析。为保证阳性克隆为大鼠αd特异，用非转染的CHO细胞重复筛选过程。将符合与大鼠αdCHO转染细胞反应而不与非转染的CHO细胞反应标准的孔克隆。
初次筛选后，来自阳性孔的细胞用两倍稀释法并接着在含15％FBS、100mM次黄嘌呤钠、16mM胸腺嘧啶和10单位/ml IL-6的RPMI中有限稀释进行克隆。在有限稀释步骤中，确定显示生长的孔的百分比，克隆性用泊松分布分析进行预测。10-12天后用FACS分析显示生长的孔。最后一次克隆之后，阳性孔在RPMI和11％FBS中扩增。克隆产生了一个用这些标准判断为阳性的孔，从该孔中扩增了四个单独的亚克隆，分别命名为197A-1、197A-2、197A-3和197A-4。
在进行199融合前，第二只仓鼠在307天用2.3×106大鼠αd(RAD)转染的CHO细胞进行加强免疫。在融合前4天(334天)和融合前3天(335天)进行最后两次免疫。334天的加强免疫包括2×106大鼠αd转染的CHO细胞和200ul与琼脂糖(前面介绍)结合的纯化大鼠αd经腹膜内给药。335天的加强免疫包括5×106大鼠αd转染的CHO细胞，也经腹膜内注射给药。199融合的融合和筛选过程与197融合相同。鉴定和克隆了三个上清与大鼠αd反应的杂交瘤，命名为199A、199H和199M。
2.使用197和199融合相同的过程进行第二次免疫。334天加强免疫后，在394和395天之前不进行进一步的免疫。在融合前，对仓鼠经腹膜内给予2×106RAD转染的CHO细胞及300ul纯化大鼠αd-琼脂糖。接着进行的融合205的融合和筛选过程与融合199和197相同，除了在克隆中，Armenian仓鼠ELISA试剂如羊抗Armenian仓鼠抗体(Jackson ImmunolResearch Labs)被用作初次筛选。用此方法鉴定的阳性孔接着按介绍用FACS进行筛选。融合205产生三个单独的阳性克隆，命名为205A、205C、205E。
3.在另一种制备抗大鼠αd单克隆抗体的方法中，6至12周龄的BALB/c小鼠在第1天用纯化的大鼠αd-琼脂糖在福氏完全佐剂中经皮下给药进行免疫。在第25天用福氏不完全佐剂中的相同免疫原经相同的途径进行第二次加强免疫。与第二次相同的第三次加强免疫在第42天进行。在融合前加强免疫前不再进行进一步的加强，融合前加强免疫包括400ul(融合226)和250ul(融合236)纯化的大鼠αd-琼脂糖的腹膜内注射。每体积包含约10至15ug抗原，这由考马斯染色确定。对于融合226，融合前加强在62天和63天进行，融合在66天进行；对于融合236，融合前加强在132天和133天进行，融合136天进行。两种融合过程与前面介绍的Armenian仓鼠融合所用的过程的不同之处在于，使用5∶1比例的脾细胞对NS-1细胞，与之相比，在Armenian融合中，使用2∶1的比例。融合过程的其他方面与Armenian仓鼠过程相同。
融合226和236的筛选和克隆过程与融合197、199和205的过程相同，除了用ELISA进行初级筛选外。在ELISA中，使用一种羊抗鼠全分子来从杂交瘤上清中俘获鼠抗体。并使用一种羊抗鼠辣根过氧化物酶接合物来检测鼠抗体。阳性克隆接着用FACS按照融合197至205的介绍进行筛选。
融合226产生9个阳性克隆，命名为226A、226B、226C、226D、226E、226F、226G、226H和226I。融合236产生10个阳性克隆，命名为236A、236B、236C、236F、236G、236H、236I、236K、236L和236M。从这些克隆产生的单克隆抗体用ELISA按照实施例15的介绍进行分型，发现所有的抗体均为IgG1同种型。针对大鼠αd单克隆抗体的特征分析为分析抗大鼠αd单克隆抗体的特征，生物素标记的脾裂解物按前面实施例12部分D中的介绍进行制备。裂解物在用于免疫沉淀前进行预清除。首先，将50ug/ml的正常鼠免疫球蛋白加入到裂解物中，所获得的溶液在4℃颠倒旋转混合30分钟。加入包被有兔抗鼠免疫球蛋白的蛋白A-琼脂糖淤浆75ul，继续颠倒旋转混合30分钟。在一台台式微量离心机中在4℃以15,000rpm离心5分钟，使兔抗鼠包被的蛋白A琼脂糖珠沉淀，收集上清。弃去沉淀物质。
对每个克隆的杂交瘤，将大约300ul的上清加入一个Eppendorf微量离心管，在其中加入30ul 30％的Triton X-100、30ul的抑胃酶肽、亮抑酶肽和抑酶肽100X贮存液、100ug PMSF晶体和50ul预清除的生物素化大鼠脾裂解物。将样品温和地振荡旋转，在4℃置于一个颠倒旋转转头30分钟。一个对照样品用在50ul大鼠脾裂解物中加入10mg/ml兔抗大鼠αd特异性多克隆抗体来制备。
经过30分钟温育后，在每个样品中加入75ul蛋白A-琼脂糖珠的PBS淤浆，在4℃颠倒旋转温育30分钟。蛋白A-偶联的珠在一台台式微量离心机中以15,000在4℃离心5分钟进行沉淀，收集上清。沉淀的珠用如下一系列1ml的去污剂顺序洗涤含有10mM Tris、400mM NaCl、1.0％Triton X-100、pH8.0的缓冲液#1；含有10mMTris、400mM NaCl、1.0％ Triton X-100、0.5％ Triton X-100、pH8.0的缓冲液#2；含有10mM Tris、400mM NaCl、0.1％脱氧胆酸、pH8.0的缓冲液#3；含有10mM Tris、400mM NaCl、0.5％M LiCl2、pH8.0的缓冲液#4。最后一次洗涤用缓冲液#1进行。在每次洗涤中将珠温和地旋转振荡，并用台式微量离心机沉淀。上清用转移吸液器移去。最后一次洗涤后，用Hamilton注射器将剩余的缓冲液从珠中移出。在各个沉淀中加入50ul含有溴酚蓝和派洛宁Y染料和终浓度为10％的β-巯基乙醇的SDS样品缓冲液。将混合物剧烈振荡旋转1-2分钟，并在室温温育5-10分钟。样品在4℃在台式微量离心机中以15,000rpm离心5分钟，收集释放的蛋白，转移到一个新管中。来自每个样品的小份在水浴槽中煮沸4分钟，然后上7.5％SDS-PAGE凝胶。PAGE分离后，将蛋白在200mAmps转移1小时转移到硝酸纤维膜上。并将滤膜在3.0％ BSA/TBS-T溶液中在4℃封闭过夜。向每张滤纸加入含有1∶6000稀释的链亲和素-OPD的0.1％ BSA-TBS-T溶液，在室温继续温育1小时。滤膜在TBS-T中洗涤5次，每次10分钟，用Amersham’s ECL试剂盒按照厂商推荐的程序进行显色。
克隆199M被发现能免疫沉淀一种异源二聚体蛋白。较大的蛋白亚基具有约170-175kD的分子量，与用兔抗大鼠αd多克隆对照免疫沉淀的蛋白大小一致。还沉淀了分子量约为95kD的第二种蛋白，与CD18的分子量一致。实施例23单克隆抗体199M的特异性使用接合有199M单克隆抗体的CNBr-Sepharose亲和柱来从脾细胞裂解物中亲和纯化大鼠αd。简而言之，将大约1.3×1010大鼠脾细胞在含有150mM NaCl、10mM PMSF、10mM Tris、1％ Triton X-100、pH8.0的缓冲液中裂解。缓冲液中的细胞在冰上温育30分钟并在4℃用约10,000×g离心30分钟。
将抗体199M按下述方法与CNBr-活化的Sepharose 4B(Pharmacia)接合。将1克活化的树脂悬浮于1mM HCl中15分钟，用15ml 1mM HCl洗涤三次，用15ml含有0.1mM HCO3、0.5M NaCl、pH8.0的偶联缓冲液洗涤一次。将偶联缓冲液中的抗体199M按终浓度约10-20mg/ml加入到树脂悬液中，混合物在4℃温育过夜。第二天，离心使接合的树脂沉淀，弃去上清。树脂上未处理的基团通过在室温在0.1M Tris、pH8.0中温育1小时进行封闭。接合的树脂用0.1M柠檬酸、pH3.0洗涤，并以1∶2淤浆的形式贮存于含有0.1％叠氮化钠的裂解缓冲液中。
为进行亲和纯化，将脾细胞与0.4ml的199M接合的琼脂糖树脂颠倒混合过夜进行温育。然后离心沉淀树脂，用15ml裂解缓冲液洗涤树脂4次。将每份约100ul的凝胶在含有0.1M Tris-HCl、pH6.8、2.0％SDS、20％甘油、0.0002％溴酚蓝、10％β-巯基乙醇(终浓度为5％)的还原型样品缓冲液中迅速煮沸，并上样，蛋白用6.0％聚丙烯酰胺SDS凝胶(SDS-PAGE)分辨。
SDS-PAGE分离时，亲和纯化的物质被发现含有两个主要和一个次要蛋白种类。一个具有90kD分子量的主要蛋白带与CD18的已知大小一致，未对这个条带进行测序。对160kD的第二个主要带进行了检测，该带与αd的预测分子量一致。此外，还检测了表观分子量为200kD的次要带。160kD和200kD都用蛋白氨基端测序进行了分析，并将结果与用大鼠αdcDNA预测的氨基酸序列以及已知的CD11c和CD11b的氨基酸序列进行了比较。160kD和200kD带的序列被发现均与用克隆的大鼠αd预测的氨基酸序列一致，这表明可能有两种形式的αd，它们可能是剪接变体或由糖基化差异造成的。实施例24使用大鼠表达αd的巨噬细胞的T细胞增殖试验分离自大鼠脾脏的表达αd的巨噬细胞被用作抗原递呈细胞(APC)来刺激一种名为LR-21的髓磷脂碱性蛋白特异性T细胞系。简而言之，大鼠用100ul体积的铁颗粒(BioMag，Cambridge，MA)经静脉注射。第二天，用脾脏制备单细胞悬液，用磁收集具有吞噬的铁颗粒的αd+巨噬细胞。流式细胞术和免疫沉淀显示，吞噬铁的细胞50至80％是αd+。
结果显示，表达αd的脾巨噬细胞相比于其他APC例如胸腺巨噬细胞是非常弱的APC。还在增殖试验中用αd阳性的巨噬细胞和LR-21细胞系检测了命名为205C的单克隆抗体。然后按如下方法进行增殖试验。
αd表达阳性的脾巨噬细胞按6×106细胞/ml的密度悬浮于含有5％正常大鼠血清的RPMI中，在每孔中加入100ul的巨噬细胞悬液。来自LR-21细胞系的细胞按1×106细胞/ml的密度悬浮于含有5％正常大鼠血清的RPMI中，并在每孔中加入50ul悬液。在每孔中加入50ul体积的单克隆抗体205C至终浓度为50、10和2ug/ml。板在37℃温育72小时，并加入1uCi3H-胸腺嘧啶来进行最后24小时温育。将细胞收集到玻璃纤维垫上，用直接β计数器(Packard Matrix96)测定3H整合。
实验结果显示，高浓度的抗体205C(10和50ug/ml)能以剂量依赖方式降低T细胞增殖。实施例25来自大鼠骨髓的αd的免疫沉淀用PBS冲洗股骨的方法从一只Lewis大鼠中收集骨髓细胞。细胞基本上按实施例18介绍的方法洗涤、生物素化和免疫沉淀，使用20ug纯化的单克隆抗体来从100ul预清除的细胞裂解物中免疫沉淀蛋白。免疫沉淀蛋白的检测按前面介绍的方法进行。
大鼠αd单克隆抗体205C免疫沉淀以160kD和95kD迁移的两条带，这样大小的带与在用相同抗体从脾细胞裂解物中进行蛋白质的免疫沉淀观察到的αd/CD18的α和β链的大小一致。抗大鼠CD11a、CD11b或CD11c的抗体免疫沉淀与αd不同的α链，所有的抗体都共沉淀一种分子量与CD18的已知分子量一致的蛋白。实施例26αd在动物模型中的表达初步的结果显示，大鼠αd选择性地表达于巨噬细胞的亚群，包括胸腺中的皮层巨噬细胞、肝脏中的枯否细胞、中枢神经系统中的维管细胞、腹膜巨噬细胞的亚群和静止的骨髓巨噬细胞。此外，硫葡萄糖盐巨噬细胞的一个亚群在用地塞米松刺激后显示αd的表达上调。所观察到的大鼠αd的巨噬细胞限制性表达表明需要对多种动物模型中的表达作进一步的分析。大鼠αd在苯肼模型中的表达对动物给予苯肼会导致大量血红细胞(rbc)损伤而产生暂时性贫血。受损的血红细胞被红髓巨噬细胞从循环中清除，从而导致明显的脾大。据推测表达αd的巨噬细胞可能参与受损血红细胞和其他外源物质从循环中清除。
为验证此假说，多组大鼠单独用盐水或溶解于盐水中的苯肼处理，并经腹膜内按100mg/kg体重进行给药。在一些实验中，大鼠用针对大鼠αd的“结构域I”产生的多克隆抗血清进行处理。
在苯肼给药后的不同时间点处死动物，脾重和血细胞比容用作血红细胞清除的参数。此外，收集肾、脾和肝进行组织病理学分析，包括对CD11a、CD11b、CD11c和αd进行免疫染色。
总的发现表明，用苯肼(盐水对照和αd处理)处理4天后，大鼠产生了急剧的脾大，而血细胞比容降低。用αd多克隆血清处理对苯肼诱导的脾细胞重量或血比容下降没有影响。
将来自盐水和4天苯肼处理的大鼠的组织制成4um厚的切片，并在Superfrost Plus(VWR Scientific)载玻片上在室温空气干燥15分钟。使用前，将载玻片在50℃温育约5分钟。切片在冷(4℃)丙酮(EM Science)中在室温固定2分钟，并在室温干燥。将切片置于100ml的1X TBS、1.1ml 30％的H2O2(Sigma)、1ml 10％ NaN3(Sigma)在室温放置15分钟以去除内源性的过氧化物酶活性。每个切片用150ul含有1X TBS中的30％正常大鼠血清(Harlan Bioproducts)、2％BSA(Sigma)的溶液在室温封闭30分钟，然后温和地从切片上去除溶液。每个切片用75ul在封闭液中稀释至13.3ug/ml的生物素化的仓鼠抗大鼠αd抗体205C，在室温处理1小时。温育后，切片在1X TBS中洗涤三次，每次5分钟，以去除任何未结合的抗体。在最后一次洗涤后在组织周围将多余的TBS吸出。过氧化物酶接合的羊抗生物素抗体(Vector Laboratories)在封闭液中稀释至1∶200，将75ul用于每个切片，室温下30分钟。温育后，载玻片在1X TBS中洗涤2次，每次5分钟。加入AEC(Vector Laboratories)底物，通过浸入水中使显色终止。将载玻片在Gill’s苏木精#2(Sigma)中负染，并在水中漂洗，然后在70％、95％、100％乙醇及二甲苯中依次脱水。然后切片用cytoseal(VWR)封固。
在用盐水处理的大鼠脾切片中，大多数的αd表达位于脾红髓中形态学鉴定为巨噬细胞、粒细胞和淋巴细胞的一个亚群的细胞上。而在苯肼处理的大鼠脾中，脾红髓经历了形态学改变，使得唯一鉴定的细胞型是吞噬了受损血红细胞的大巨噬细胞群体。这些巨大的巨噬细胞的大多数被观察到表达αd。在苯肼处理的大鼠中，还显示脾白髓中表达αd的巨噬细胞的数量增加。
在苯肼处理的大鼠脾脏上，还进行了双标记实验来确定αd和CD11c的表达。如前所述，αd表达在脾红髓中显示吞噬了受损的血红细胞的大巨噬细胞中检测到。CD11c表达也在脾红髓中的大巨噬细胞中检测到，而且在红髓中CD11c阳性细胞显示比αd阳性细胞多。大多数表达αd的巨噬细胞也表达CD11c，尽管观察到一小部分αd阳性巨噬细胞不表达CD11c。也有一个群体的CD11c阳性巨噬细胞不表达αd。
因此免疫学分析表明，在苯肼处理的动物的脾脏中CD11c的表达在第4天与盐水对照相比显示上调。而其他整合素CD11a、CD11b和αd的表达显示不受苯肼处理的影响。用多克隆“I”结构域αd抗体处理也显示不影响红髓巨噬细胞对血红细胞的摄取，但吞噬血红细胞的的巨噬细胞多数是αd阳性。吞噬受损的血红细胞的αd阳性巨噬细胞不存在于苯肼给药7天后收集的脾脏中。
随后使用凋亡试验和用生物素接合的抗体205C对4天苯肼处理的大鼠脾脏进行双标记实验。将来自正常大鼠和4天苯肼处理的大鼠的组织制成4微米厚的切片，在Superfrost Plus(VWR Scientific)上在室温空气干燥15分钟，并贮存于-20℃。使用前，将载玻片加热至50℃。将加温的载玻片置于含有100ml的1X TBS、1.1ml 30％的H2O2(Sigma)、1ml 10％ NaN3(Sigma)的缓冲液在室温放置15分钟以去除内源性的过氧化物酶活性。每个切片用150ul含有1X TBS中的20％正常大鼠血清(Harlan Bioproducts)、2％BSA(Sigma)的溶液在37℃封闭10分钟，然后温和地从切片上去除溶液。每个切片用75ul在封闭液中稀释至26.6ug/ml的生物素化的仓鼠抗大鼠αd抗体205C在37℃温育30分钟。然后切片在1X TBS中洗涤三次，每次5分钟，以去除未结合的抗体。在最后一次洗涤后在组织周围将多余的TBS吸出。将按照厂商的指示制备的碱性磷酸酶接合的亲和素/生物素复合物(Vector Laboratories)用于每个切片，37℃下20分钟。温育后，载玻片在1X TBS中洗涤2次，每次5分钟。切片在4℃用低聚甲醛(Sigma)固定5分钟。然后切片在1X PBS中洗涤，并置于CSK缓冲液(100mM NaCl、300mM蔗糖、10mM PIPES pH6.8、3mM MgCl2、0.5％ Triton-X-100)中4℃两分钟。将切片在1X PBS中在室温漂洗2分钟，然后切片用1X PBS洗涤三次，每次5分钟。将TUNEL反应混合物(Boehringer Mannheim)应用于每个切片，37℃下60分钟。温育后，切片在1X PBS中洗涤三次，每次5分钟。凋亡试剂盒的原理与原位杂交相似，TUNEL试剂(FITC接合的)与“切口”DNA杂交。将转变子-POD(一种识别TUNEL试剂上的FITC标志的过氧化物酶接合的抗体)用于每个切片，37℃下30分钟。切片用1X PBS洗涤三次，每次5分钟。加入AEC(Vector Laboratories)底物，浸入水中终止显色。切片用Aquamount(VWR)封固。
在模型中，脾脏的红和白髓区域中的大量细胞都产生凋亡，但红髓中已经吞噬了血红细胞的大巨噬细胞(表达αd并在模型的第7天消失)没有发现产生凋亡。正常大鼠脾上大鼠αd表达的细胞类型分析为确定哪种大鼠细胞类型表达αd，在正常大鼠脾脏上进行双标记染色。按前述方法制备正常大鼠脾脏的切片直至大鼠血清封闭步骤。加入第一细胞标记抗体后，碱性磷酸酶接合的羊抗鼠抗体(JacksonLaboratories)在用于第一抗体的相同稀释剂中稀释到1∶500，并将75ul加入到每个切片上，室温30分钟。载玻片在1X TBS中洗涤2次，每次洗涤5分钟。将碱性磷酸酶标记的驴抗羊抗体(JacksonLaboratories)在抗体稀释剂中稀释到1∶300，并将75ul加至每个切片，室温30分钟。按上述方法洗涤和封闭后，每个切片接受75ul蛋白浓度为20ug/ml的生物素化的仓鼠抗大鼠αd抗体(205C)，各1小时45分钟，然后洗涤去除未结合的抗体。最后一次洗涤后从组织周围吸去多余的TBS。将过氧化物酶接合的羊抗生物素(VectorLaboratories)在抗体稀释剂中稀释至1∶200。并将75ul加入每个切片，室温下45分钟。载玻片用1X TBS洗涤2次，每次洗涤5分钟。加入AEC底物(Vector Laboratories)，浸入水中终止显色。然后加入Fast Blue底物(Vector Laboratories)，浸入水中终止显色。然后载玻片用Aquamount(Baxter)封固。
双抗体免疫细胞化学用针对CD5、CD2、CD4、CD8、NK标记、或HIS45(一种T细胞标记)结合一种抗αd抗体来进行，以设法确定表达αd的细胞的表型。用CD2/αd或HIS45/αd没有检测到双标记细胞。在正常大鼠的脾红髓中，αd能够标记被发现也能表达CD5的小细胞束。还没有确定这种CD5阳性细胞是否是T细胞或B细胞。在红髓中一小群αd表达细胞被测定也表达CD4。此外，NK细胞和CD8阳性细胞的一个亚群也被鉴定为表达αd。因此，脾脏中的αd表达发现于T细胞、可能的B细胞的一个亚群、NK细胞的一个亚群和巨噬细胞的一个亚群。αd在来自F344大鼠模型的巨大粒细胞性白细胞(LGL)肿瘤细胞上的表达在F344大鼠中使用获自国立癌症研究所的肿瘤细胞建立了一个LGL白血病大鼠模型，该肿瘤细胞被静脉注射到3只雄性F344大鼠中(每只一百万细胞)。疾病显示需要三个月，在此时，将几只动物处死，用FACS和组织化学分析检查组织。
为进行FACS分析，取出部分脾脏，按下面的实施例的介绍制备单细胞悬液。简而言之，脾组织用剪刀切成小片，并在存在D-PBS的条件下通过一个金属筛。离心沉淀细胞，并重悬于30ml D-PBS。在一个15ml离心管中将5.0ml细胞悬液铺于5.0ml Histopaque制备Histopaque梯度(Sigma)。将该梯度用Beckman台式离心机在1500rpm离心30分钟，并收集细胞层，在D-PBS中洗涤一次，用血细胞计数器计数。将细胞重悬于FACS缓冲液(RPMI-1640/2％FBS、0.2％叠氮化钠)，使其密度为1×106细胞/样品。
细胞通过与生物素接合的仓鼠抗大鼠αd抗体205C(10ug/ml)和一系列FITC标记的抗大鼠细胞标记的抗体温育来进行双色染色。这些第二种抗体包括抗巨噬细胞-FITC、抗CD3-FITC和抗IgM(B细胞)-FITC抗体(均获自PharMingen)，加上一种FITC接合的具有NK细胞特异性的抗体(Harlan)。FITC接合的抗体均按10ul/样品使用。
样品先在冰上与205C-生物素抗体温育30分钟，在FACS缓冲液中洗涤三次，重悬于1.0ml的FACS缓冲液。将FITC接合物与5ul链亲和素-PE(Pharmigen)一起加入，并将样品置于冰上30分钟。温育后，样品在FACS缓冲液中洗涤三次，重悬于200ul FACS缓冲液。用Becton Dickinson FACscan检测样品，并用LysisII软件(Becton Dickinson)分析数据。
结果压倒性地证明了αd在NK或LGL细胞表面的表达。B细胞和T细胞标记染色阳性的细胞没有显示αd表达，用巨噬细胞标记染色的细胞显示仅有轻微程度的αd表达。据信在疾病的这一点上，脾脏主要由NK肿瘤细胞组成，这与观察到的大群脾细胞被NK标记和αd表达染色的结果一致。
这些观察也与使用从同一动物收集的外周血细胞并按上面方法进行FACS的平行实验的结果一致。使用外周血细胞的结果表明，循环的NK细胞也表达αd，而血液中表达其他细胞标记的细胞不显示αd表达。但使用外周血细胞的结果并不像推测是由于脾脏和外周血中存在不同的细胞类型的百分比差异产生的脾细胞结果那样变化剧烈。
在用来自这些模型动物的大鼠脾细胞接着进行FACS时，获得了相同的结果。在使用上面的细胞制备物进行进一步的分析时，LGL肿瘤细胞也显示CD18以及CD11a、CD11b和CD11c表达的染色。
使用上面介绍的ICC程序，对正常和NK F344疾病组织进行了组织化学分析。初步的数据表明，αd在NK F344肿瘤肺和肝组织中表达，但在相应的正常组织中没有检测到或以极低水平表达。疾病肺组织显示αd在小和大的细胞束以及分散于整个肺的单个细胞上表达。NK F344肝显示小管周围以及散布整个组织的其他细胞上的弱标记。针对其他β2整合素的抗体显示，这些分子在正常组织和疾病组织中以相似水平表达，虽然标记图谱不同。
在平行的分析中，正常大鼠胸腺在皮质的分散细胞中显示轻微的αd表达，而F344NK胸腺显示αd表达水平增加。正常脾显示红髓中的表达，NK脾脏具有分布整个组织的束状标记。
然后自疾病发作开始每周检测NK脾脏，结果显示αd的表达水平提高，直到第三周，然后在第四周下降。实施例27使用抗αd单克隆抗体抑制NK肿瘤细胞诱导的靶细胞裂解的分析NK细胞的一个特殊功能是靶向和杀伤病毒感染细胞和外源细胞。为分析NK细胞裂解特定靶细胞的能力。靶细胞用51铬标记，当裂解发生时，在培养基中可检测到升高的放射性。先前已经证明在NK细胞上表达的αd，据推测其可能参与NK细胞靶向的细胞杀伤。为评价这一假说，肿瘤细胞与αd抗体预温育，来分析αd在一个功能分析中的作用。αd阳性NK-肿瘤效应细胞的制备用从国立癌症研究所获得的NK肿瘤细胞注射F344大鼠，并在取出脾脏前在动物中传代3至4周。取出脾脏，切成小片，在D-PBS存在下通过一个金属筛。将所获得的细胞悬液在Beckman台式离心机上在室温以1500rpm离心10分钟。吸出上清，将细胞重悬于30mlD-PBS。
然后按下述方法进行来自血液的单个核细胞的Histopaque分离。在6个15ml离心管中加入5ml Histopaque(Sigma)，在其上铺一层上面介绍的细胞悬液5ml。细胞在Beckman台式离心机上在室温以1500rpm离心30分钟。收集细胞层，合并，并用血细胞计数器计数。在D-PBS中制备几种分离的肿瘤细胞的稀释物，并随后在存在或不存在浓度为50ug/ml的抗大鼠αd抗体的条件下温育。对照抗体包括一种抗大鼠CD18抗体和一种抗大鼠ICAM-1抗体，这两种抗体也以50ug/ml的浓度与细胞温育。在试验前，肿瘤细胞与抗体在37℃预温育约30分钟。Yak-1靶细胞的铬标记Yak-1细胞(ATCC)是一种小鼠淋巴瘤细胞系，将该种细胞培养于10％FBS/RPMI 1640。离心收集细胞，在1.5至4.0ml RPMI“测试培养基”中按约1×107的细胞密度重悬。测试培养基用500ml RPMI1640、5ml Pen-Strep抗生素溶液和10ml FBS制备。在Yak-1细胞悬液中加入约200至300uCi的51铬，然后在37℃轻微混合温育45至60分钟。温育后，用测试培养基将体积增加至50ml，并离心沉淀细胞。弃去上清，将细胞悬浮于1至3ml测试培养基，并将密度调为5×104。还制备浓度为1×107细胞/ml的非标记Yak-1细胞用作自身对照。
通过用γ计数器测试三个重复中100ul的标记细胞悬液来测定标记细胞的活性。短期铬释放试验将NK效应细胞的各个稀释物按三个重复铺于96孔微量板中的100ul体积测试培养基中，在每孔中加入100ul标记的Yak-1细胞。自身即自发或背景的释放用100ul标记细胞和非标记Yak细胞在每个效应细胞稀释度温育来获得。总51铬释放用在一系列孔的靶细胞中加入1.0％Triton来获得。自发释放用仅有靶细胞的孔中发现的51铬量进行测量。效应细胞/靶细胞的温育在37℃进行4小时，然后将板离心，从每孔收集100ul上清，测量放射活性。
细胞裂解活性用下面的公式进行计算
结果显示，仓鼠抗大鼠αd抗体(包括199M和205C)和小鼠抗大鼠αd抗体(226A、226B、226C、226D、226F、226G、226H和226I)都不能影响NK肿瘤细胞杀伤或裂解标记的靶细胞的能力。实施例28小鼠cDNA克隆的分离设法分离小鼠αd同源物使用两种PCR制备的探针进行种间交叉杂交相当于人克隆19A2(SEQ ID NO1)的碱基522至2047的一个1.5kb片段；和一个相当于人克隆19A2(SEQ ID NO1)的碱基1900至2900碱基的1.0kb大鼠片段。人探针使用分别列于SEQ ID NO38和39称为ATM-2和9-10.1的引物对用PCR进行制备；大鼠探针使用分别列于SEQ ID NO34和35的引物对434L和434R来制备。样品在94℃温育4分钟，然后进行30个循环的温度步骤顺序94℃；50℃ 2分钟；72℃ 4分钟。5’-GTCCAAGCTGTCATGGGCCAG-3’ (SEQ ID NO38)5’-GTCCAGCAGACTGAAGAGCACGG-3’(SEQ ID NO39)PCR产物用Qiagen Quick Spin试剂盒按照厂商推荐的程序纯化，约180DNA使用Boehringer Mannheim随机引物标记试剂盒按照厂商推荐的程序用200 uCi[32P]-dCTP进行标记。未掺入的同位素使用Centri-sep自旋柱(Princeton Separation，Adelphia，NJ)按照厂商推荐的程序除去。使用前，探针用0.2N NaOH变性，用0.4MTris-HCl、pH8.0中和。
将一个λZAPII中的小鼠胸腺寡聚dT-引物cDNA文库(Stratagene)按约30,000噬菌斑每15cm平板进行铺板。硝酸纤维膜(Schleicher & Schuell，Keene，NH)上的噬菌斑提呈物在含有30％甲酰胺的预杂交溶液(8ml/提呈物)中在50℃搅动温育1小时。将标记的人和大鼠探针加入预杂交溶液中，继续在50℃温育过夜。将滤膜在室温在2X SSC/0.1％SDS中洗涤两次，在37℃在2XSSC/0.1％SDS中洗涤一次，在42℃在2X SSC/0.1％SDS中洗涤一次。滤膜在Kodak X-Omat AR胶片上在-80℃用增感屏曝光27小时。
将在复制的提呈物中显示阳性信号的4个噬菌斑重新划线于含镁(LBM)/羧苄青霉素(100mg/ml)的LB培养基平板上，并在37℃温育过夜。将噬菌斑用Hybond滤膜(AmershaM)提呈，按初次筛选的方法探针检测，并在Kodak X-Omat AR胶片上在-80℃用增感屏曝光24小时。
将12个给出阳性信号的噬菌斑转至含有10mM Tris-HCl和1mMMgCl2的低Mg++噬菌体稀释剂中。使用T3和T7引物(分别为SEQ IN NO13和14)和下面的反应条件用PCR测定插入子的大小。样品在94℃温育4分钟，然后进行30个循环的温度步骤顺序94℃ 15秒；50℃30秒；72℃ 1分钟。
6个样品产生大小范围为300碱基至1kb的不同带。通过与辅助噬菌体共感染来释放噬菌粒，并重新环化制备Bluescript SK-(Stratagene)。所获得的克隆在LBM/羧苄青霉素(100mg/ml)中培养过夜。DNA用Promega Wizard miniprep试剂盒(Madison，WI)按照厂商推荐的程序进行分离。纯化DNA的EcoRI限制酶分析证明了用PCR检测的分子量。插入DNA用分别列于SEQ ID NO40和41的引物M13和M13反向.1进行测序。5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’ (SEQ ID NO40)5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’(SEQ ID NO41)测序按实施例4中的介绍进行。
在6个克隆中，只有被称为10.3-1和10.5-2的两个克隆提供了序列信息，并且是相同的600bp片段。该600bp序列与人αd的相应区域有68％的同一性，与人CD11a有40％的同一性，与人CD11c有58％的同一性，与小鼠CD11b有54％的同一性。然后将该600bp片段用来分离编码可能的小鼠αd同源物的更完整的cDNA。
将一个λZAPII(Stratagene)中的小鼠脾cDNA文库(寡聚dT和随机引物)按约2.5×104噬菌斑/15cmLBM平板进行铺板。将噬菌斑提呈到Hybond尼龙转移膜上(Amersham)，用0.5M NaOH/1.5M NaCl变性，用0.5M Tris碱/1.5M NaCl/11.6 HCl中和，并用2X SSC洗涤。用紫外线照射的方法将DNA交联到滤膜上。
使用按上文所述方法预先标记的探针10.3-1和10.5-2对约500,000个噬菌斑进行了筛选。将探针加入预杂交溶液中并在50℃温育过夜。滤膜在室温在2X SSC/0.1％SDS中洗涤两次，在37℃在2XSSC/0.1％SDS中洗涤一次，在42℃在2X SSC/0.1％SDS中洗涤一次。滤膜在Kodak X-Omat AR胶片上在-80℃用增感屏曝光24小时。将14个在复制提呈物上给出阳性信号的噬菌斑用于第二轮筛选，第二轮筛选与第一轮筛选基本相同，除了增加最后的高严格条件的洗涤，高严格条件的洗涤为，在50℃在2X SSC/0.1％SDS中，在50℃在0.5XSSC/0.1％SDS中，在55℃在0.2X SSC/0.1％SDS中。滤膜在Kodak X-OmatAR胶片上在-80℃用增感屏曝光13小时。
将18个阳性噬菌斑转移到低Mg++噬菌体稀释剂中，并按上面的介绍用PCR扩增来测定插入子的大小。7个样品给出范围为600bp至4kb的阳性带。纯化DNA的EcoRI限制酶分析证明了用PCR观察到的大小，DNA用引物M13和M13反向.1(分别为SEQ ID NO40和41)进行测序。
一个被命名为B3800的克隆含有一个相当于人αd19A2克隆的5’端下游200bp的区域的4kb插入子，并包括3’非翻译区的553碱基。克隆B3800显示与人αd的相应区域有77％的同一性，与人CD11a的相应区域有44％的同一性，与人CD11c的相应区域有59％的同一性，与小鼠CD11b的相应区域有51％的同一性。第二个克隆A1160是一个1.2kb的插入子，该插入子与人αd编码区的5’端起始甲硫氨酸下游约12核酸处并列。克隆A1160显示与人αd的相应区域有75％的同一性，与人CD11a的相应区域有46％的同一性，与人CD11c的相应区域有62％的同一性，与小鼠CD11b的相应区域有66％的同一性。
片段更接近人克隆19A2的5’端的克隆A1160，长度为1160碱基，与克隆B3800共有一段起始于碱基205并延续到碱基1134的重叠区域。克隆A1160具有一个在B3800的重叠区域中不存在的110碱基的插入(克隆A1160的碱基704-814)。该插入可能位于外显子-内含子连接区域(Fleming等，《免疫学杂志》150卷，480-490页(1993))，在克隆A1160和B3800的随后连接前移去。推定的小鼠αd克隆的5’cDNA端的快速扩增使用RACE PCR(Frohman，《PCR方法，方法和应用指南》中的“RACE，cDNA末端的快速扩增”，Innis，等(编辑)，28-38页，Academic Press，New York(1990))来获得丢失的推定小鼠αd克隆的5’端序列，包括5’非翻译序列和起始甲硫氨酸。按照厂商推荐的程序使用一个小鼠脾RACE-Ready试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)。设计两个反义的、基因特异的引物---A1160 RACE1-初级和A1160RACE2-巢式(SEQ ID NO42和43)来进行初级和巢式PCR。5’-GGACATGTTCACTGCCTCTAGG-3’ (SEQ ID NO42)5’-GGCGGACAGTCAGACGACTGTCCTG-3’ (SEQ ID NO43)引物SEQ ID NO42和43分别对应于从5’端302和247碱基起始的区域。使用5’锚引物(SEQ ID NO44)和试剂盒提供的小鼠脾cDNA按上文所述方法进行PCR。5’-CTGGTTCGGCCCACCTCTGAAGGTTCCAGAATCGATAG-3’(SEQ ID NO44)PCR产物电泳显示了一条大小约280碱基的带，将其用TA克隆试剂盒(Invitrogen)按照厂商推荐的程序亚克隆。培养10个所获得的克隆，分离DNA并测序。用这种方法鉴定了5’序列的一个另外60碱基，它对应于SEQ ID NO45的碱基1至60。小鼠cDNA和预测的氨基酸序列的特征编码人αd的推定同源物的小鼠cDNA的一个合并序列示于SEQ IDNO45。虽然人和小鼠克隆的外部结构域之间的同源性很高，但胞质结构域的同源性仅为30％。所观察到的差异可能表明人和小鼠蛋白之间的C末端功能差异。另外胞质结构域的差异也可能由剪接差异引起，或表明另外的β2整合素基因的存在。
在氨基酸水平，由小鼠cDNA可预测一种蛋白(SEQ ID NO46)，该蛋白与小鼠CD11a有28％的同一性，与小鼠CD11b有53％的同一性，与人CD11a有28％的同一性，与人CD11b有55％的同一性，与人CD11c有59％的相，与人αd有70％的同一性。将人αd的胞质结构域的氨基酸序列与同样长度的其推定的小鼠同源物进行比较，结果显示这些区域具有相同的长度但却有不同的一级结构。这些区域的序列长度相似表明是种间变化而不是剪接变体形式。当与上文实施例20中的预测大鼠多肽进行比较时发现，小鼠和大鼠胞质结构域显示大于60％的同一性。实施例29分离另外的小鼠αdcDNA克隆用于序列验证为验证实施例28中介绍的小鼠αd的核酸和氨基酸序列，分离另外的小鼠序列用于证明。
使用一个小鼠脾随机引物文库和一个λZAPII中的小鼠胸腺寡聚dT-引物cDNA文库(Stratagene)，用两种同源性αd探针杂交的方法来进行小鼠cDNA的分离。文库按约5×105噬菌斑每15cmLBM平板进行铺板。将噬菌斑提呈到Hybond尼龙膜上(Amersham)，将膜变性(0.5M NaOH/1.5M NaCl)、中和(0.5M Tris碱/1.5M NaCl/11.6 HCl)、洗涤(2X SSC盐溶液)。用紫外线照射的方法将DNA交联到滤膜上。
探针使用下面介绍的引物在如下条件下的PCR反应中制备。样品在94℃保温4分钟，然后进行30个循环的温度步骤顺序(94℃ 15秒、50℃ 30秒、72℃ 1分钟，使用Perkin-Elmer 9600热循环仪。
3’探针长约900碱基并跨越从核苷酸2752至3651的区域(SEQ IDNO1中)(5’→3’)，并用分别示于SEQ ID NO69和74的引物11.b-1/2FOR11和11.b-1/1REV1来制备。该探针用于第一套提呈。
5’探针长约800碱基并跨越从核苷酸149至946的区域(SEQ IDNO1中)(5’→3’)，并用分别示于SEQ ID NO50和85的引物11.b-1/2FOR1和11.a-1/2REV2来制备。该探针用于第二套提呈。
在第三套提呈中，上面介绍的两种探针一起用于相同的平板。
使用上面介绍的两种探针对约500,000个噬菌斑进行筛选，探针按实施例20种介绍的相同方法进行标记。将标记探针加入含有45％甲酰胺的预杂交溶液中并在50℃温育过夜。滤膜在室温(22℃)在2XSSC/0.1％SDS中洗涤两次，最后一次洗涤在50℃在2X SSC/0.1％SDS中进行，在Kodak X-Omat AR胶片上在-80℃用增感屏放射性自显影19小时。
对至少在复制的提呈物上给出阳性信号的13个噬菌斑进行第二轮筛选，第二轮筛选按初次筛选的介绍进行，除了以下变化，3’和5’标记引物都用于杂交，并加上另外一次使用2X SSC/0.1％SDS在65℃的最后洗涤。按上面的介绍进行2.5小时的放射性自显影。
将给出阳性信号的13个噬菌斑(命名为MS2P1至MS2P13)转入低Mg++噬菌体稀释剂中。在上面所述相同条件下，使用能与ZAP II中Bluescript噬菌粒退火的T3和T7引物(序列已在前面介绍)，用PCR扩增(Perkin-Elmer 9600 thermocycler)来测定插入子的大小。条带大小在500碱基至4 kb的范围内。噬菌粒用M13和M13反向.1(分别为SEQ ID NO40和41)分离、制备和测序。对13个克隆中的5个MS2P-3、MS2P-6、MS2P9、MS2P-12、MS2P-13进行了测序，而且它们一起，表示了从5’端的约碱基200到3’末端的第一个终止密码子后约300碱基的区域。
自动测序按实施例4中的介绍进行。首先使用M13和M13反向.1引物(分别为SEQ ID NO40和41)来测定每个克隆的末端序列，并确定其相对于结构#17(SEQ ID NO45)的位置。然后每个克隆用对特定区域适当的引物(列于下面)进行完全测序。11.b-1/2FOR1 5’-GCAGCCAGCTTCGGACAGAC-3’(SEQ ID N050)l1.a-1/1FOR2 5’-CCGCCTGCCACTGGCGTGTGC-3’(SEQ ID NO60)11.a-1/1FOR3 5’-CCCAGATGAAGGACTTCGTCAA-3’(SEQ ID NO61)11.b-1/2FOR4 5’-GCTGGGATCATTCGCTATGC-3’(SEQ ID NO62)11.b-1/2FOR5 5’-CAATGGATGGACCAGTTCTGG-3’(SEQ ID NO63)11.b-1/2FOR6 5’-CAGATCGGCTCCTACTTTGG-3’(SEQ ID NO64)11.b-1/2FOR7 5’-CATGGAGCCTCGAGACAGG-3’(SEQ ID NO65)11.b-1/2FOR8 5’-CCACTGTCCTCGAAGCTGGAG-3’(SEQ ID NO66)11.b-1/2FOR9 5’-CTTCGTCCTGTGCTGGCTGTGGGCTC-3’(SEQ ID NO67)11.b-1/2FOR10 5’-CGCCTGGCATGTGAGGCTGAG-3’(SEQ ID NO68)11.b-1/2FOR11 5’-CCGTGATCAGTAGGCAGGAAG-3’(SEQ ID NO69)11.b-1/2FOR12 5’-GTCACAGAGGGAACCTCC-3’(SEQ ID NO70)11.b-1/2FOR13 5’-GCTCCTGAGTGAGGCTGAAATCA-3’(SEQ ID NO71)11.b-1/2FOR14 5’-GAGATGCTGGATCTACCATCTGC-3’(SEQ ID NO72)11.b-1/2FOR15 5’-CTGAGCTGGGAGATTTTTATGG-3’(SEQ ID NO73)11.b-1/2REV2 5’-GTGGATCAGCACTGAAATCTG-3’(SEQ ID NO74)11.b-1/2REV3 5’-CGTTTGAAGAAGCCAAGCTTG-3’(SEQ ID NO75)11.b-1/2REV4 5’-CACAGCGGAGGTGCAGGCAG-3’(SEQ ID NO76)11.b-1/2REV5 5’-CTCACTGCTTGCGCTGGC-3’(SEQ ID NO77)11.b-1/2REV6 5’-CGGTAAGATAGCTCTGCTGG-3’(SEQ ID NO78)11.b-1/2REV7 5’-GAGCCCACAGCCAGCACAGG-3’(SEQ ID NO79)11.b-1/2REV8 5’-GATCCAACGCCAGATCATACC-3’(SEQ ID NO80)11.b-1/2REV9 5’-CACGGCCAGGTCCACCAGGC-3’(SEQ ID NO81)11.b-1/2REV10 5’-CACGTCCCCTAGCAGTGTCAG-3’(SEQ ID NO82)11.b-1/2REV11 5’-CCATGTCCACAGAACAGAGAG-3’(SEQ ID NO51)11.b-1/2REV12 5’-TTGACGAAGTCCTTCATCTGGG-3’(SEQ ID NO83)11.b-1/2REV13 5’-GAACTGCAAGCTGGAGCCCAG-3’(SEQ ID NO84)11.a-1/1REV1 5’-CTGGATGCTGCGAAGTGCTAC-3’(SEQ ID NO85)11.a-1/1REV2 5’-GCCTTGGAGCTGGACGATGGC-3’(SEQ ID NO86)将序列编辑、并列，并与以前分离的小鼠αd序列(结构物#17，SEQ IDNO45)进行比较。
新序列排列揭示，在结构#17中有一个始于核苷酸2308的18碱基删除，该删除没有造成阅读框移动。按上面的介绍测序的克隆MS2P-9也显示相同的18碱基删除。该删除被发现在50％的含有该区域的小鼠克隆中发生，但在大鼠或人的αd克隆中却没有检测到。18碱基删除的特征是一个12碱基的回文序列AAGCAGGAGCTCCTGTGT(SEQ IDNO91)。这个核酸序列中的反向重复序列是自身互补的，并可能形成一个向外的环，在逆转录过程中导致切除。含有该额外的18碱基的小鼠αd序列列于SEQ ID NO52，其推导的氨基酸序列列于SEQ ID NO53。实施例30小鼠中原位杂交接着确定小鼠αd的组织分布，来提供与实施例6中介绍的人αd分布的比较。
采用体外RNA转录并整合32S-UTP(Amersham)的方法，从一个DNA模板中制备了一个单链的200bp的mRNA探针，该探针对应于小鼠cDNA胞质尾区域的核苷酸3460至3707。
使用放射性标记的单链mRNA探针对小鼠全胚胎(受精后11-18天收集)和不同的小鼠组织包括脾脏、肾脏、肝脏、小肠和胸腺进行原位杂交。
将组织切成6um厚，并黏附在Vectabond(VectorLaboratories，Inc，Burlingame，CA)包被的载玻片上，贮存于-70℃。在使用前，将载玻片从-70℃中取出，在50℃放置约5分钟。将切片在4％低聚甲醛中4℃固定20分钟，用不断提高的乙醇梯度(75-95-100％)在4℃进行脱水，每个浓度1分钟，在室温下空气干燥30分钟。将切片在70％甲酰胺/2X SSC中在70℃变性2分钟，在2X SSC中漂洗2次，用上面介绍的乙醇梯度脱水并空气干燥30分钟。杂交在55℃在含有6×105cpm/切片的35S标记核酸探针和在焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水中终浓度为50％的甲酰胺、0.3M NaCl、20mM Tris-HCl、pH7.5、10％硫酸葡聚糖、1X Denhardts溶液、100mM二硫苏糖醇(DTT)和5mM EDTA的溶液中过夜(12-16小时)进行。杂交后，切片在室温在4X SSC/10mM DTT中洗涤1小时，在60℃在50％甲酰胺/2X SSC/10mM DTT中洗涤40分钟，在室温在2X SSC中洗涤30分钟，在室温在0.1X SSC中洗涤30分钟。将切片脱水，空气干燥2小时，用Kodak NTB2照相乳胶包被，空气干燥2小时，显色(在完全黑暗中在4℃保存后)，并用苏木精/伊红负染。
脾组织显示主要在红髓的强信号。这一图谱与脾脏中组织巨噬细胞的分布一致，但不排除其他的细胞类型。实施例31小鼠表达结构的制备为构建包含与人αd显示同源性的小鼠cDNA序列的表达质粒，将来自克隆A1160和B3800的插入子连接。但在该连接前，将一段含有一个起始甲硫氨酸的5’前导序列加入到克隆A1160。设计命名为“5’PCR前导”(SEQ ID NO47)的引物，该引物含有(1)在位置1-6为相同的便于消化的非特异性碱基；(2)便于亚克隆到表达载体中的位置7-12的BamI位点(SEQ ID NO47中下划线)；(3)位置13-18的一个共有的Kozak序列；(4)含有一个起始甲硫氨酸密码子(SEQ IDNO47中粗体)的信号序列；和(5)特异性地与克隆A1160的5’序列重叠以便于引物退火的另外31个碱基。使用第二个称为“3’endfrag″(SEQ ID NO48)的引物和引物“5’PCR前导”来从克隆A1160中扩增插入子。5’-AGTTACGGATCCGGCACCATGACCTTCGGCACTGTGATCCTCCTGTGTG-3’(SEQ ID NO47)5’-GCTGGACGATGGCATCCAC-3’(SEQ ID NO48)所获得的PCR产物不能被BamHI消化，说明限制酶切位点前的碱基数目不足，抑制了酶的识别。增加5’引物(SEQ ID NO47)中BamHI位点前“尾”序列的长度，在第一次PCR扩增产物上重复PCR。设计了一个称为mAD.5’.2(SEQ ID NO49)的5’引物，它在位置1-4带有额外的非特异性碱基，并含有特异性地与前面所用的“5’PCR前导”引物序列重叠的另外20个碱基。5’-GTAGAGTTACGGATCCGGCACCAT-3’ (SEQ ID NO49)将引物“mAD.5’.2”和“3’end frag″同时用于以第一次扩增的产物为模板的PCR反应中。将获得的第二次PCR产物按照厂商推荐的程序亚克隆到质粒pCRtmII(Invitrogen)中，并转化到One shot感受态细胞中(Invitrogen)。用BamHI和EcoRI限制酶切分析了一个含有PCR产物的克隆，并进行测序。证实了序列之后，用BamHI和EeoRI消化和凝胶纯化分离插入子。
用EcoRI和NotI消化、凝胶纯化从克隆B3800中分离插入子，并加入一个含有扩大的A1160 BamHI/EcoRI片段的连接反应中。连接在14℃进行14小时。在连接反应中加入用BamHI和NotI消化的载体pcDNA.3(Invitrogen)及额外的连接酶，继续反应12小时。将一小份反应混合物转化到大肠杆菌感受态细胞中，培养所获得的克隆，使用引物11.b-1/2FOR1和11.b-1/2REV11(分别为SEQ ID NO50和51)用PCR分析来对一个阳性克隆进行鉴定。这些引物跨越了A1160和B3800片段，因此检测到扩增产物就表明两个片段已经连上。阳性克隆的序列用列于SEQ ID NO50和51的引物进行验证，这对引物能够扩增起始甲硫氨酸后从碱基100至1405。实施例32一种敲除小鼠的构建为更精确地评价推定的小鼠αdcDNA编码的蛋白的免疫学作用，设计了一种“敲除”小鼠，在这种小鼠中，编码推定αd同源物的基因组DNA序列用同源重组破坏。这样由被破坏的基因编码的蛋白的意义就可以用编码蛋白的缺乏来评价。“敲除”小鼠的制备在Deng等，《分子细胞生物学》13卷，2134-2140(1993)中介绍。
设计这样的小鼠从构建含有准备用同源重组事件“敲除”的基因的质粒开始。使用小鼠cDNA的一个750碱基对片段(相当于SEQ IDNO45中核苷酸1985至2733)从一个λFIXII基因组文库中鉴定一个编码推定的小鼠αd同源物的小鼠基因组序列。初次的筛选产生了14个阳性克隆，其中7个用第二次筛选来证实。从两个给出最强信号的噬菌斑获得液体裂解物，并用传统的方法分离λDNA。限制酶切图谱和Southern分析证明了其中一个命名为14-1的克隆的正确性。用NotI消化分离插入DNA。将该片段克隆到Bluescript SKII+。
为鉴定一个约为9-14kb的限制酶切片段(据称此长度为使同源重组事件的可能性最大)，用750bp cDNA探针进行Southern杂交。在杂交前，对克隆14-1建立限制酶切图谱。一个12kb的片段被鉴定为可能的候选物，并将该片段亚克隆到pBluescript SKII+中一个位置，使小鼠DNA的侧翼为胸苷激酶编码盒。用一种I结构域探针(相当于SEQ ID NO45中核苷酸454-1064)对该克隆进一步分析表明，该克隆不含I结构域编码序列。
使用相同的I结构域探针，对λFIXII基因组文库进行再次筛选。开始，检测到了6个阳性克隆，其中一个在第二次筛选时保持阳性。由此克隆分离的DNA在Southern分析中与一种I结构域探针反应强烈。但用原来的750bp探针没有检测到任何反应，这说明此克隆包括SEQ ID NO45的核苷酸1985-2773的5’区域。
另外，不能与750bp探针杂交可能表明，此克隆是整合素蛋白家族的另一种成员。为确定这种解释是否正确，将13kb的插入子亚克隆到pBluescript SKII+。纯化的DNA用相当于SEQ ID NO52中的αdI结构域核酸序列441-461、591-612、717-739和反向的898-918的引物进行测序。仅在使用第一个4441-4461引物时获得了序列信息，并且仅有I结构域的5’-most外显子被有效扩增。I结构域的剩余部分没有被扩增。因此，所获得的克隆含有小鼠αd基因的外显子6和该外显子的5’和3’端的内含子序列。外显子7不在克隆中。测序后，制备了一个含有新霉素抗性和胸苷激酶基因的结构。
将新霉素抗性(neor)基因以打断基因组小鼠DNA的蛋白编码序列的方式插入到所获得的质粒中。因此所获得的质粒在小鼠基因组DNA序列中含有一个neor基因，所有这些都位于一个胸腺激酶编码区域。需要用这种方式构建的质粒来使同源重组优于随机重组(Chisaka等，《自然》，355卷，516-520页(1992)。
另一种策略被用来制备适用于产生αd敲除小鼠的结构。将两套寡核苷酸引物交给Genome Systems，Inc.(St.Louis，MO)来对由胚胎干细胞基因组DNA制备的大插入文库进行高严格PCR分析。引物对应于αd中I结构域的第一个和最后一个外显子。鉴定了三个克隆，其中两个(命名为1117和1118)能与两种引物反应，另一个(命名为1119)只能用来自最后一个外显子的引物扩增。一个小鼠基因组αdDNA的鉴定从克隆1117和1118的细菌裂解物中按照厂商的指示(GenomeSystems，Inc.)制备质粒DNA。αd插入子使用寡核苷酸madk.f1(SEQID NO104)和madk.r1(SEQ ID NO105)和madk.r2(SEQ ID NO106)用PCR进行验证。madk.f1SEQ ID NO104TGT CCA GGA CAA GAG ATG GAC ATT GCmadk.r1SEQ ID NO105GAG CTA TTT CAT AGC AAG AAT GGGmadk.r2SEQ ID NO106TAT AGC ATA GCA AAT GAT CC两种质粒分成小份用限制内切酶BamHI、PstI、SacI、SalI、SmaI、XbaI和XhoI(Boehringer Mannheim)消化。将每个消化样品在0.8％琼脂糖凝胶上分开，并将多核苷酸转移到Hybond-N+核酸转移膜上(Amersham)进行分析。印迹用32P随机标记引物DNA为探针进行检测，32P随机标记引物用1.6kb模板制备，该模板以寡核苷酸madfor1(SEQ ID NO107)和madrev1(SEQ ID NO108)为引物用PCR产生。madfor1 SEQ ID NO107ATG GTC CGT GGA GTT GTG ATCmadrev1 SEQ ID NO108TCG AGA TCC ACC AAA CTG CAD杂交在含有50％甲酰胺的SSPE中在42℃过夜进行。标记的印迹在2XSSPE中在室温洗涤5次。放射性标记的带用将印迹在KodakX-Omat放射性自显影胶片上在-70℃曝光2小时来显示。
从克隆1118鉴定了两个感兴趣的片段一个4.1kb的SacI片段和一个8.3kb的XbaI片段。将克隆1118的SacI和XbaI消化的全部样品内容物不经进一步纯化连接到载体pBluescript KS+中，连接后，将全部反应内容物转化到大肠杆菌TG1/λ SmR菌株的钙-感受态细胞中。分离产生的克隆，在含有辅助病毒M13K07的200ul选择培养基中培养过夜来复制单链DNA。然后将取自每个孔的上清10ul点样到Hybond+转移膜上，用上面介绍的相同探针和程序进行杂交。由9个阳性克隆扩大培养，并用Wizard Plus Miniprep DNA纯化系统(Progema)从每个培养物中分离质粒DNA。用限制酶消化和PCR证实分离的质粒中插入子的存在和大小。使用载体引物T3和T7以及对应于小鼠αd序列的寡核苷酸引物对三个克隆进行序列测定。这三个克隆与小鼠cDNA用Geneworks软件进行的序列比较表明，所有这三个克隆都同时含有小鼠αd的外显子1和外显子2。被称为A的最长克隆是一个8280kb长的XbaI克隆。另两个较短的克隆被称为E和H，它们是相同的4112kb长的SacI克隆。选择8280kb克隆进行进一步的发展。实施例33兔αd的克隆兔cDNA文库的构建和筛选大鼠和小鼠中人αd同源物的鉴定促进了对兔同源物的研究，兔同源物在上文介绍的人类疾病的兔模型中将十分有用。
使用Invitrogen FastTrack试剂盒(San Diego，CA)以及试剂盒提供的试剂按照厂商推荐的程序从一个全兔脾脏中制备Poly A+RNA。从1.65克组织中，分离了73ug的Poly A+RNA。使用一个来自Stratagene(La Jolla，CA)的试剂盒来用兔脾RNA构建一个ZAP表达cDNA文库。将获得的cDNA直接克隆到pBK-CMV噬菌粒载体的λ臂的EcoRI和XhoI位点。用Gigapack II Gold(Stratagene)将λ臂包装到噬菌体颗粒中。所获得的文库的滴度估计为8×105颗粒，平均插入大小为1.2kb。
通过铺板噬菌斑连片生长将文库扩增一次，收集细胞裂解物。将扩增后的文库按约30,000噬菌斑形成单位(pfu)每150mm大肠杆菌平板进行铺板，将产生的混合物在37℃温育12-16小时使噬菌斑形成。将噬菌体DNA转移到Hybond N+尼龙膜上(Amersham，ArlingtonHeights，Illinois)。膜用两种随机引物放射性标记的小鼠αdPCR DNA探针的混合物进行杂交。第一个探针用一个跨越SEQ ID NO52的核苷酸149-946的PCR产物制备。第二个探针来自跨越SEQ ID NO52的核苷酸2752-3651的PCR产物。探针用随机引物标记法(BoehringerMannheim Random Primed DNA Labeling Kit)进行标记，反应混合物通过一个Sephadex G-50柱来去除未掺入的核苷酸。杂交溶液由5XSSPE、5X Denhardts、1％SDS、40％甲酰胺和1×106dpm/ml标记探针组成。杂交在42℃进行16-18小时。滤膜在2X SSPE/0.1％ SDS中在室温下充分洗涤，并在X-射线胶片上曝光来显示任何杂交的噬菌斑。
鉴定了两个明显与人αd序列同源的克隆。克隆#2长约800bp，并与人αd的5’末端匹配。克隆#2包括一个起始甲硫氨酸和完整的前导序列。克隆#7长约1.5kb并包括一个起始甲硫氨酸。克隆#7的5’末端与克隆#2的5’末端重叠，而3’末端序列在I结构域序列之后的一个位点终止。用引物步行法对克隆#7进行完整的测序。克隆#7的核苷酸和推导的氨基酸序列分别列于SEQ ID NO100和101。
由克隆#2和克隆#7确定的兔αd的预测N末端氨基酸序列表明，该蛋白与人αd有73％的同一性，与小鼠αd有65％的同一性，与小鼠CD11b、人CD11b和人CD11c有58％的同一性。克隆#2的核酸序列列于SEQ IDNO92，其预测的氨基酸序列列于SEQ ID NO93。
使用标记的兔克隆#7并对获取该片段的cDNA文库再次进行筛选，来设法分离全长的兔αdcDNA。鉴定了25个另外的克隆，其中一个称为克隆49的被确定为最大。用巢氏删除技术对克隆49进行完整的测序。克隆49的核苷酸和氨基酸序列分别列于SEQ ID No102和103。因为克隆#7和#49不重叠，设计寡核苷酸作为使用第一链兔脾cDNA的PCR中的引物，来分离丢失的序列。
这两个部分克隆的推导氨基酸序列与其他白细胞整合素的氨基酸序列的关系介绍于表1。表1β2整合素家族成员在氨基酸水平的同一性百分比人αd兔#7 兔#49人αd1007480小鼠αd70 6774大鼠αd70 6673小鼠CD11a 随机 2828小鼠CD11b 55 5953人CD11a 36 2828人CD11b 60 5855人CD11c 66 5962*如果＜25％同一性，仅为随机排列，没有意义。
分离了兔αd克隆，就可以表达该蛋白，既可以表达于转染细胞的表面，也可以以可溶性的全长或截短形式表达。然后将该蛋白用作免疫原来制备单克隆抗体，来用于人疾病状态的兔模型。实施例34猴αd的分离制备亲和柱为制备一种能从猴脾脏中分离αd的亲和柱，将抗人αd抗体212D和217L各10mg对含有0.1M NaHCO3、0.5M NaCl、pH8.3的偶联缓冲液透析过夜。按照厂商推荐的程序制备约1.0g的CNBr Sepharose4B(Pharmacia，Piscataway NJ)，将1.0mL树脂与每种透析的抗体混合。所产生的淤浆在4℃旋转过夜进行混合。在Beckman台式离心机中在1000rpm离心5分钟，获取偶联的树脂。收集未吸附的上清部分，用分光光度计分析未偶联蛋白的存在。结果显示，所有可用的抗体都已与凝胶基质结合。树脂上的未偶联的活性基团用1M乙醇胺在室温封闭2小时，树脂在偶联缓冲液中经一系列高和低pH改变进行洗涤，然后用含有0.1M NaC2H3·3H2O和0.5M NaCl、pH4.0的乙酸缓冲液进行最后洗涤。所有的树脂都在偶联缓冲液中贮存于4℃。猴脾脏的制备雌性猕猴脾脏获自华盛顿大学的Regional Primate Center。用100U/ml的胶原酶D(Sigma)注射脾组织，并将其切成小片。然后将组织片悬浮于小体积的含有50mM Tris、150mM NaCl、2mM CaCl2、2mM MgCl2、pH8.0和1.0％Triton X-100的裂解缓冲液，并贮存于-70℃。加入蛋白酶抑制剂PLA(抑胃酶肽A、亮抑酶肽和抑酶肽的混合物，均来自Sigma)和4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟盐酸(AEBSF)(NovaBiochem)以防止贮存过程中的蛋白酶解。贮存组织直到获得6个猕猴脾脏。
将6个猴的脾脏混合，在一个Waring搅拌器中在含有25mMTris、0.15M NaCl、002％ NaN3。1.0％ Triton、1X PLA和0.1mM AEBSF的TSA裂解缓冲液中匀浆，共进行三个循环，每次10秒钟。收集裂解物，并在一个旋转平台上4℃放置1小时。然后在Beckman台式离心机中以3000rpm离心15分钟。收集上清，并弃去沉淀的细胞残渣。共收集了总体积为550ml的裂解物，将裂解物在4℃与预先在1M乙醇胺中处理以封闭反应位点的CNBr Sepharose温育2小时。温育后，离心移去树脂，收集上清。亲和纯化和测序将按上述方法制备的脾裂解物分成两半，分别与212D和217L制备的CNBr Sepharose凝胶混合。将产生的淤浆在4℃旋转混合3天，然后在Beckman台式离心机上以1500rpm离心10分钟收集未吸附的部分，并保存。将凝胶转移到一个15ml离心管中，在几个体积的D-PBS中顺序洗涤。将每种凝胶的100ul的小份在含有0.1M Tris-HCl、pH6.8、2％ SDS、20％甘油和0.002％溴酚蓝、10％β-巯基乙醇(终浓度5％)的还原型样品缓冲液中迅速煮沸，并上6.0％聚丙烯酰胺SDS凝胶(SDS-PAGE)，分析蛋白。凝胶用考马斯染色，检测到伴随大量背景蛋白的、与αd和CD18分子量一致的蛋白。
为提高具有与αd相似分子量的蛋白的纯化，将每种结合了蛋白的凝胶的两个100ul小份用不同的方法进行洗涤。在一种方法中，凝胶在含有150mM NaCl、10mM Tris、1.0％ Triton X100、pH8.0的缓冲液中洗涤数次。在第二种方法中，凝胶用相同方法进行洗涤，但结合的蛋白在最后一次洗涤中用0.05M甘氨酸、pH2.4进行洗脱。与前面一样，洗脱蛋白在还原型样品缓冲液中迅速煮沸，并在6.0％SDS-PAGE上分析。从在低pH甘氨酸缓冲液中洗涤的树脂中，考马斯染色仅检测到与αd和CD18一致的蛋白，因此选择这种方法。为分离用于测序的蛋白，剩余的CNBr Sepharose树脂按前面的介绍洗涤四次，将约四分之三的树脂悬浮于2ml的0.05M甘氨酸、pH2.4中，剧烈摇匀。离心3分钟使树脂沉淀，并收集未吸附的部分。然后将凝胶在甘氨酸缓冲液中再洗涤一次，将此次的洗涤物与前面的未结合部分混合。将此混合部分在4℃对D-PBS透析过夜，中间换液两次。透析后，将样品干燥使体积减少为1ml。
为进行测序，将洗脱物在7.0％的分离胶上分开，按实施例2介绍的方法将蛋白转移到Immobilon(PVDF)膜(Millipore Bedford，MA)上。简而言之，将凝胶在去离子水中洗涤一次，并在含有10％甲醇的10mM环己胺-丙磺酸缓冲液pH10.5(CAPS)中平衡15至45分钟。将PDVF膜在甲醇和去离子水中洗涤，然后在CAPS转移缓冲液中平衡15至30分钟。将蛋白在70伏转移3小时转移到PDVF膜上，然后将其在经过过滤的0.1％ R250考马斯染料中染色10分钟。膜在50％甲醇/10％乙酸中洗涤脱色三次，每次洗涤10分钟，在过滤水中再洗涤一次，并干燥。
从212D和217L偶联的树脂中都检测到约150kD和95kD的主要蛋白带，这两条蛋白带与前面在分析级凝胶上检测到的蛋白一致。在来自217L偶联树脂的膜上观察到了位于紧靠150kD蛋白下方的一条清晰度稍差的带，但在膜干燥后检测不到该带。从每张膜上切下150kd带，用Applied Biosystems(Foster City，CA)473型蛋白测序仪按照厂商推荐的程序直接测序。
结果显示，用212D偶联树脂分离的猴蛋白的氨基端序列具有列于SEQ ID NO109的氨基酸序列。而用217L偶联树脂分离的蛋白的氨基端具有列于SEQ ID NO110的序列。SEQ ID NO110中的“X”表示一个未确定的残基。212D-偶联蛋白SEQ ID NO109NLDVEEPTIFQEDA217L偶联蛋白 SEQ ID NO110NLDVEEPTIFXEDA猴序列与人αd及β2整合素家族中的的其他α链的氨基端序列的比较示于表2表2猴αd氨基端序列与人β2整合素α亚单位的比较蛋白SEQ ID NO 氨基端序列猴αd111 F N L D V E E P T I F Q E D A人αd112 F N L D V E E P T I F Q E D A G G人CD11c 113 F N L D T E E L T A F V D S A G人CD11h 114 F N L D T E N A M T F Q E N A R G基于序列同一性，结论为，212D和217L都能识别猴和人的αd。实施例35217L抗原的特征分析基于前面实施例中从猴脾脏中沉淀的蛋白的N末端序列，可以得出结论，212D和217L能识别猴和人的αd。但免疫细胞化学(ICC)分析和免疫沉淀实验表明，217L具有212D没有的额外反应特性。使用针对所有α链的抗体的FACS和ICC实验检测到217L与CD11c(最密切相关的白细胞整合素α链)和CD11b的交叉反应性。因此，可能217L还识别αd的构象、糖基化或剪接变体或与αd有序列同源性的新α链。
结节病肺组织(见实施例18)中抗体217L识别的抗原具有独特的分布，与CD11c的染色图谱不重叠，这表明该抗原可能具有生物学意义。因此，为进一步理解217L抗原的意义，需要对该蛋白和编码该蛋白的DNA进行分析，并采用不同的途径来进行。
使用抗体217L来从人树突细胞或外周血中免疫沉淀一种蛋白复合物，接着对沉淀的蛋白进行N末端测序。序列分析将揭示，在外周血细胞上识别的蛋白是否与αd具有氨基端同一性。然后将从树突细胞或外周血细胞沉淀的蛋白用去糖基化酶处理，并与从其他来源沉淀的CD11c和αd进行比较，来提供一级氨基酸序列的分子量比较。
此外，用整个αdcDNA在低严格条件下对由树突细胞RNA制备的cDNA文库进行探针杂交。反应克隆用对整个克隆长度核酸测序进行分析，来确定克隆中是否存在非αd序列。实施例36测定αd治疗用途的动物模型犬中的免疫组织学数据和大鼠与小鼠中的原位杂交已经确定，在脾脏中，αd主要由红髓和淋巴结中的巨噬细胞表达，αd在髓索和窦中被发现。其表达图谱非常类似于已经报道的、用两种单克隆抗体F4/80和SK39确定的两种鼠抗原的表达图谱。而这些小鼠抗原的生化特征已经证明，它们不同于αd，αd很可能确定了与小鼠抗原F4/80和SK39所确定的相同巨噬细胞亚群。
在小鼠中，SK-39阳性巨噬细胞已在脾红髓和淋巴结索中被鉴别，在脾红髓中，它们可能参与从循环中清除外源物质。(Jutila等，《白细胞生物学杂志》，54卷，30-39页)。SK-39阳性巨噬细胞也被报道位于急性和慢性炎症的部位。而且，聚集在巯基乙酸诱发炎症的腹膜腔中的单核细胞也表达SK39抗原。总结来说，这些发现表明，如果SK39+细胞也是αd+，那么这些细胞在脾中将负责清除外源物质，并参与巨噬细胞起重要作用的炎症。
虽然αd的功能还不清楚，特征研究得更清楚的其他β2整合素已被显示参与非常广泛的黏附事件，包括能促进细胞迁移、加强吞噬、促进细胞-细胞相互作用的事件，以及导致炎症过程上调的所有事件。因此，很有可能，干预正常的αd功能也能干预巨噬细胞在其中起重要作用的炎症。这样的抗炎症作用由下列因素产生i)阻止巨噬细胞在炎症位点聚集，ii)阻止巨噬细胞在炎症位点激活或iii)干扰巨噬细胞的效应功能，这些效应功能通过特异性的自身免疫应答或作为细胞损伤的旁观者而损伤正常细胞。
有证据表明巨噬细胞在疾病过程中起重要作用的疾病状态包括多发性硬化、关节炎、移植动脉粥样硬化、某些类型的糖尿病和肠道炎症疾病。下面将要讨论的动物模型已经显示能复制这些人类疾病的许多方面。αd抑制剂的功能在这些模型系统中进行了测试，以确定治疗相应人类疾病的可能性是否存在。移植动脉粥样硬化心脏移植目前是治疗性干预某些类型的晚期心脏疾病的一种可接受形式。由于使用环孢菌素A已经使一年存活率提高到80％，产生渐进性的移植动脉粥样硬化已成为心脏移植存活一年后死亡的主要原因。最近的研究发现，心脏移植3年后明显的动脉粥样硬化的发生范围为36-44％(Adams等《移植》53卷，1115-1119(1992)；Adams等《移植》56卷，794-799(1993))。
移植动脉粥样硬化一般包括能影响整个冠状血管壁的弥漫性、闭塞性、内膜损害，并通常伴随着脂沉积。虽然移植动脉粥样硬化的病理仍不清楚，但它很可能与供体和受体的组织相容性差异相关，并且在本质上是免疫性的。从组织学上讲，变厚的内膜区域主要是巨噬细胞组成，虽然偶尔也能见到T细胞。因此很可能表达αd的巨噬细胞在移植动脉粥样硬化的诱导和/或发展中起重要的作用。在这种情况下，αd功能的单克隆抗体或小分子抑制剂(例如，可溶性的ICAM-R)可以为接受了心脏移植并有产生移植动脉粥样硬化风险的个体提供预防。
虽然心脏移植中的动脉粥样硬化对生命造成了最大威胁，移植动脉粥样硬化也见于其他的实体器官移植，包括肾脏和肝脏。αd阻断试剂的治疗性应用能防止其他器官移植中的动脉粥样硬化，减少移植失败产生的并发症。
大鼠移植动脉粥样硬化的一个模型涉及越过最小组织相容性障碍的异体心脏同种移植。在Lewis心脏同种移植物移植到MHCI和II型匹配的F344受体时，80％的同种移植物至少存活3周，而25％的移植物无限存活。在此低级移植排斥过程中，在供体心脏内形成动脉粥样硬化。120天的同种移植物中的动脉损害一般有弥漫性的纤维状内膜增厚，与在排斥的人心脏同种移植物中发现的移植物动脉粥样硬化损害的表现没有区别。
大鼠用最小组织相容性抗原不匹配的心脏进行移植，例如Lewis至F-344。向移植受体定期给予大鼠αd特异的单克隆抗体或αd的小分子抑制剂。处理被希望来减少在非排斥供体心脏中移植物动脉粥样硬化的的发生。用αd单克隆抗体或小分子抑制剂处理大鼠可以不限于预防性处理。阻断αd功能也可希望来减少巨噬细胞介导的炎症和使移植物中动脉损害回复。甾醇饲养兔中的动脉粥样硬化用一种含有甾醇补加物的致动脉粥样硬化食物饲养约12-16周的兔会产生覆盖大部分上行主动脉的腔表面的内膜损害(Rosenfeld等《动脉粥样硬化》7卷，9-23页(1987)；Rosenfeld等《动脉粥样硬化》7卷，24-34页(1987))。在这些兔中见到的动脉粥样硬化损害与在人中见到的相似。损害中含有大量的T细胞，这些T细胞多数表达CD45RO，这是一种与记忆T细胞有关的标记。约一半的浸润T细胞也表达MHC II类抗原，而且有一些表达IL-2受体，这说明这些细胞大多处于活性状态。
动脉粥样硬化损害的一个方面在甾醇饲养的兔中发现，但在啮齿动物模型中明显没有，这就是富含泡沫细胞的损害集聚。泡沫细胞型巨噬细胞据信是通过特异性受体摄取了氧化的低密度脂蛋白(LDL)而造成的。氧化的LDL颗粒被发现对某些细胞类型包括内皮细胞和平滑肌细胞是有毒的。巨噬细胞摄取的可能有毒的、氧化的LDL颗粒作为一种激发物，驱使巨噬细胞活化，从而对动脉粥样硬化损害有关的炎症起作用。
已经对兔αd制备了一种单克隆抗体，并用它处理了甾醇饲养的兔。处理包括预防性给予αd单克隆抗体或小分子抑制剂，来证明αd+的巨噬细胞参与疾病的进程。另外的研究将证明针对αd的单克隆抗体或小分子抑制剂能够使用一种致动脉粥样硬化食物饲养的兔中检测到的血管损害回复。胰岛素依赖型糖尿病BB大鼠在鼠龄70-150天时会自发产生胰岛素依赖型糖尿病。使用免疫组化技术，在疾病的早期可以检测到MHC II+类ED1+巨噬细胞对胰岛的浸润。多数巨噬细胞表现为参与细胞残渣或正常细胞的吞噬。在疾病发展时，更多的巨噬细胞被发现浸润到胰岛中，虽然有相当数量的T细胞以及后来的B细胞也被发现聚集在该位点(Hanenberg等，《糖尿病》32卷，126-134页(1989))。
BB大鼠中糖尿病的发展似乎依赖于早期的巨噬细胞浸润和随后的T细胞聚集。用对巨噬细胞有毒的二氧化硅颗粒处理BB大鼠能够有效地阻断早期巨噬细胞对胰岛的浸润。在没有了早期巨噬细胞浸润时，接着的由淋巴细胞群体自身攻击造成的组织损害就不会发生。用能阻断T细胞相关的疾病期的单克隆抗体OX-19(大鼠CD5特异)或单克隆抗体OX-8(CD8特异)进行给药也能有效地抑制糖尿病的发展。
巨噬细胞在该模型的病理中所起的核心作用，使得用它来测试αd功能的抑制剂很有吸引力。遗传上预定能产生胰岛素依赖型糖尿病的大鼠用针对αd的单克隆抗体或小分子抑制剂处理，并评价疾病的发展。防止或延迟临床症状开始就证明αd在巨噬细胞对胰岛细胞的损害中起关键作用。炎症性肠道疾病(Crohn’s病、溃疡性结肠炎)用来研究炎症性肠道疾病(IBD)的动物模型一般用有毒的刺激物(例如乙酸或三硝基苯磺酸/乙醇)经直肠给药来诱导。这些试剂诱导的结肠炎症是化学或代谢损伤的结果，缺乏与人LBD相关的慢性或自发性复发炎症。但一种最近介绍的使用浆膜下层注射由A型或D型链球菌纯化的肤聚糖-多糖(PG-PS)聚合物的动物模型，似乎是更与人LBD生理相关的模型(Yamada等，《胃肠学》104卷，759-771页(1993))。
在这个模型中，PG-PS注射到远结肠的浆膜下层。所产生的炎症应答分两个时期，最初是注射三天后的急性发作，接着3至4周后的自发性的慢性期。后期应答在本质上是肉牙肿性的，导致结肠增厚、黏附、结肠节和黏膜损伤。除了黏膜损伤，PG-PS结肠炎经常导致关节炎、贫血和肉牙肿肝炎。该疾病的肠外症状使该模型能用来研究Crohn’s病，因为很多患有活动性Crohn’s病的病人受到关节疾病和肝胆管炎症的折磨。
肉牙肿损害是慢性炎症的结果，慢性炎症导致单核细胞/巨噬细胞系细胞的聚集和随后激活。在Crohn’s病和上述动物模型中存在肉牙肿损害，使其成为αd的单克隆抗体或αd功能的其他抑制剂的有吸引力的临床靶。αd功能的抑制剂被希望来阻止与IBD相关的损害的形成或甚至逆转疾病中所见的组织损害。关节炎关节炎似乎是一种多因素的疾病过程，涉及多种炎症细胞类型包括中性粒细胞、T淋巴细胞和吞噬性巨噬细胞。虽然已存在多种关节炎模型，链球菌细胞壁肽聚糖制备物能产生与人类疾病最相似的疾病。
在大鼠中，链球菌细胞壁诱导外周关节炎症，其特征是反复发作的疾病进程和随后缓解，并在几个月后最终导致关节破坏(Cromartie等，《实验医学杂志》146卷，1585-1602页(1977)，Schwab等，《感染与免疫》59卷，4436-4442页(1991))。在疾病的慢性期内，单核的吞噬细胞或巨噬细胞据信在滑膜的破坏中起主要作用。而且，能抑制巨噬细胞聚集在滑膜中的试剂能有效地减少炎症和关节炎的病理特征。
巨噬细胞在能导致关节炎的滑膜破坏中起核心作用预示着，针对αd的单克隆抗体或αd功能的抑制剂在治疗这种疾病中有治疗潜力。如同在前面介绍的其他模型一样，预防性地给予αd单克隆抗体或小分子抑制剂，是被希望来阻止或减轻关节炎症和防止滑膜破坏。干预αd功能的试剂也可通过阻止额外的巨噬细胞聚集到关节或阻断巨噬细胞激活来减轻正在进行的炎症。最终结果是逆转正在进行的关节破坏并促进组织修复。多发性硬化虽然多发性硬化(MS)的病理原因还不清楚，但一般都认为，该疾病由能够识别中枢神经系统中的自身抗原并激发炎症级联反应的CD4+T细胞介导。所产生的免疫应答导致额外的炎症细胞包括对该病有作用的活化巨噬细胞的聚集。实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)是一种能够复制MS的某些方面的动物模型。最近，能与炎症性巨噬细胞上存在的CD11b/CD18反应的单克隆抗体(Huitinga等《欧洲免疫学杂志》23卷，709-715页(1993))已显示能够阻断临床和组织学的疾病。这些结果表明，αd的单克隆抗体或小分子抑制剂可能在阻断EAE的炎症应答中有效。这样的试剂也在MS的处理中有重要的治疗性应用。免疫复合物肺泡炎位于肺部的肺泡管、气管、结缔组织和胸膜间隙的肺泡巨噬细胞代表着肺抵抗吸入的环境物质的第一道防线。应答于物质包括细菌来源的LPS、IFN-γ和免疫复合物的刺激，肺泡巨噬细胞释放多种强炎症介质，包括高反应性的氧自由基和氮中间物。虽然超氧阴离子、过氧化氢和一氧化氮(NO-)在清除病原物中有重要的功能，但这些物质对正常的组织也能产生伤害。
在一个免疫复合物肺泡炎的大鼠模型中，从肺泡巨噬细胞释放的NO-已显示能介导多种肺损伤(Mulligan等，《美国科学院院报》88卷，638-6342(1991))。NO-也已在其他免疫复合物介导的损伤包括皮肤脉管炎(Mulligan等，上文)中被确认为介质，并在疾病例如肾小球肾炎中可能起作用。
NO-介导的组织损伤不限于有免疫复合物参与的炎症。例如，被试剂如PMA、LPS或IFN-γ刺激的小神经蚀质细胞产生能杀死少突神经蚀质细胞水平的NO-(Merrill等《免疫》151卷，2132(1993))。胰岛细胞也被发现对NO-敏感，而巨噬细胞释放这种介质已被认为参与导致糖尿病的组织损伤(Kroncke等，《BBRC》175卷，752-758页(1991))。更近一些时候，已经最终证明了NO-释放在内毒素休克中起作用(MacMicking等，《细胞》81卷，641-650(1995))。当被给予脂多糖(LPS)时，正常野生型小鼠产生严重的、进行性的主动脉压降低，导致死亡。但缺乏诱导的一氧化氮的小鼠在应答于LPS时产生不太严重的动脉压力降低，并在处理中全部存活。
体外试验表明，阻断αd能有效地阻断巨噬细胞(或通常表达αd的白细胞)活化的某些方面，如NO-释放。用IFN-γ刺激的肺泡巨噬细胞在存在抗αd多克隆抗血清(在兔中针对一种αdI结构域多肽制备)时被发现比用对照抗血清处理的巨噬细胞产生明显少的NO-分解产物--亚硝酸盐/硝酸盐。这个发现说明，针对αd特别是针对αdI结构域的单克隆抗体可能是一种潜在的抗炎症试剂，并在MS、糖尿病、肺炎和内毒素休克中有潜在应用。而且，与影响多种白细胞类型功能的CD18相对，αd的有限分布使其成为比CD18更有吸引力的靶，来阻止巨噬细胞(或通常表达αd的白细胞)活化。
大鼠IgG免疫复合物诱导的肺泡炎是广泛使用的、理解急性肺损伤重要的实验模型。这种损伤通过经气管插管向肺部注入抗牛血清白蛋白(BSA)抗体并接着静脉注射BSA来诱导。肺部微气管形成的免疫复合物导致补体激活和中性粒细胞聚集到肺部。很可能，肺部免疫复合物的形成之后接着是白细胞从血中外渗并接着穿过肺上皮。随后释放介质包括自由基、TNF-α和一氧化氮(NO-)从参与疾病进程的活化的内皮细胞、中性粒细胞和巨噬细胞中释放。疾病的病理特征包括导致水肿和肺泡间隙存在大量红细胞和PMNs的血管通透性增加。
在一个免疫复合物诱导的肺泡炎大鼠模型中对针对αdI结构域特异的多克隆抗血清进行了检测。抗αd多克隆抗血清与抗BSA在同一时间经气管插管导入肺中。接着肺部损伤通过静脉给予BSA和少量的125I标记的BSA(约800,000cpm)来诱导，后一种物质用来定量测量肺损伤产生的水肿。使肺部损伤进行4小时，损伤用肺通透性值来评价，肺通透性值被定义为肺部125I标记的BSA与1.0ml血中存在的标记量比较的比率。一般来说，阳性对照比率的通透性值的范围在0.6到0.8之间，而阴性对照(未接受BSA的大鼠)具有的通透性值范围是0.1-0.2。
初步研究表明，用抗αd多克隆抗血清处理能减少大于50％的肺通透性值，这表明肺损伤的大大缓解。以前，用抗CD18处理能减少60％的通透性值。这些发现表明αd可能是急性肺损伤过程中最重要的β2整合素，但不能精确确定抗血清阻止白细胞从血中渗出或穿过肺上皮的效果。
作为αd缓解肺损伤的另外证据，对支气管肺泡吸出液中的TNF-α水平进行了评价。用抗αd抗血清处理被发现能使TNF-α水平降低约4倍。TNF-α早已被视为急性肺炎中的重要介质，并造成炎症细胞聚集到炎症部位、细胞激活和组织损伤。很可能，抗αd抗血清在免疫复合物肺泡炎的形成过程中阻止静止的肺泡巨噬细胞活化，从而缓解TNF-α和NO-的释放，并减少随后由这些试剂导致的组织损伤和中性粒细胞聚集。LGL白血病的F344大鼠模型F344大鼠的LGL白血病最早在本世纪80年代早期至中期作为具有稳定的NK细胞活性的移植性白血病被介绍。这种白血病被认为可以作为人Tγ淋巴瘤和T细胞慢性淋巴细胞白血病的模型(Ward和Reynolds《美国病理学杂志》111卷，1-10页(1982)；Stromberg《美国病理学杂志》119卷，517-519页(1985)；Reynolds等，《免疫学杂志》132卷，534-540页(1984))。这种模型能为研究LGL和NK细胞功能提供充足的细胞。最令人感兴趣的是，如同实施例26中介绍的用仓鼠抗大鼠抗体205C通过FACS分析检测到的那样，这些细胞表面存在αd。为该发现，对αd在体外(例如，用前面介绍的细胞裂解试验)和体内的作用进行了检测。
LGL白血病的病理特征包括严重的脾大、白色斑点的肝脏、外周淋巴结增大和肺、脑和淋巴结中的点状出血。因为αd存在于正常大鼠脾脏的红髓(脾巨噬细胞上)，而LGL白血病的标志是严重的脾大，因此可以假设，αd阳性的NK肿瘤细胞也可能“返巢”或限制于一种尚待确定的配体，并在此增生。为检验这个假设，将肿瘤细胞放射性标记，并与或不与αd抗体处理一起注射到受体大鼠中。三小时后取出这些动物的脾脏，检测NK肿瘤细胞的存在。下面更完整地介绍所用的方法和实验的结果。
在进行每次实验前2至4周，将获自LGL白血病大鼠的脾脏并按下面的介绍制备的肿瘤细胞过继性转移到受体大鼠中。从前面的组织学研究和FACS分析已经知道，肿瘤的快速增生和产生的脾大发生在过继性转移后约3到4周。在第一个实验中，从一个接受了肿瘤细胞4周的动物中取出脾脏。用剪刀将脾脏剪切成小片，并将小片在存在D-PBS的条件下通过一个目筛，制备成一种单细胞悬液。将细胞悬液收集到一个50ml离心管中，并在Beckman台式离心机中在室温下以1500rpm离心10分钟。弃去上清，细胞在30ml D-PBS中重新悬浮。将约5.0ml这种细胞悬液铺于5.0ml的Histopaque上，并将梯度在1500rpm离心30分钟。从这些梯度中收集细胞层，合并，并用血球计数器计数。将细胞数量调节为每个受体大鼠接受1.0×107细胞，并稍微多出一些以抵消洗涤和准备注射过程中的细胞损失。将细胞悬浮于NK“测试培养基”(补加了抗生素的RPMI-1640，补加2％FBS)中，并用10mCi的51铬在37℃标记1小时。温育后，用测试培养基将细胞悬液的体积增加为50ml，并在1200rpm离心10分钟沉淀细胞。弃去上清，细胞按介绍再洗涤两次。将标记的细胞按1×107细胞/ml悬浮，并在注射到受体大鼠之前，在存在或不存在抗大鼠αd抗体以及一种对照IgG1抗体的情况下进行预温育。将每只动物所用的最终抗体浓度调整为5.5mg/kg或约1mg/动物。每种条件下至少做4只动物。
将受体大鼠称重，并经皮下注射150至200ul的ACE溶液(含0.25ml氯胺酮、0.2ml ACE、0.8ml Rompin)进行麻醉。对每种抗体处理，向动物经静脉注射1.0×107细胞。使用伽马计数器检测约300ul的每种细胞悬液来确定总的注射cpm/大鼠。允许标记的NK细胞在大鼠中循环3小时，然后处死动物，用主动脉穿刺法抽取1.0ml的外周血。从每只动物取出脾脏，称重，并用伽马计数器计数。为测定回到脾脏的细胞百分比，用每分钟计数(cpm)/脾脏除以注射到大鼠中的已知总cpm。为测定外周血中的cpm，假设血液占大鼠总重量的约6.0％，用1.0ml血中的cpm乘以6.0％的动物总重量来确定血液中的总cpm。然后将这个数据除以注射到每只动物中的总cpm，来获得血液中保留的cpm的百分比。
在第一个实验中，使用了抗体226B、226G、226H、226I、20C5B(一种非阻断性CD18抗体)和一种对照抗体。抗体226B和226G与对照抗体和其他两种226抗体相比，能明显减少回到脾脏中的细胞数量。与对照抗体温育后约7％至8％的标记细胞回到脾脏，而与226B和226G温育后约6％的细胞回到脾脏。血液中的总cpm的百分比在0.9％和1.4％之间，除了226B外，不同处理组之间的血液总cpm百分比没有显示明显的差异，226B组比其他组的值低。
在第二个实验中，对上面确定的程序作了几个调整。首先，对每种条件4只动物进行了增加，第二，在过继性转移2.5周后而不是上面介绍的4周后，从荷瘤大鼠中取出脾脏。按准确相同的方法制备NK细胞，并按上面确定的剂量与抗体226B或226G或一种对照抗体温育后注射到受体动物中。同样，允许标记的细胞循环3小时，然后如上处死动物，收集血液和脾脏。此外，从两个动物/环境中取出组织，测定肿瘤细胞的其他位置。这些组织包括肝脏、脑、胸腺、肺、长骨(为骨髓)和肾脏。
结果表明，在对照IgG1中，约32％的肿瘤细胞位于脾脏，而226B和226G中脾脏的标记细胞都显示减少的数量，分别为28％和29％。血液中细胞的百分比对每种抗体都相似，在血液中发现了3到4％的总cpm，226G抗体处理略少于其他两组。
各处理组的组织分布相似，肝脏显示27％的总cpm、脑0.05％、胸腺0.10％、肺15％、肾0.80％、长骨1.3％。
在第三个实验中，增加每种条件下的动物数量(n＝6或7)来设法检测上面三个处理组的统计学差异。同样，使用取自实验前两周用肿瘤细胞注射的动物的脾脏，并用上面介绍的相同方法进行制备。细胞用相同的方式进行标记，注射到动物中并允许循环3小时。在本实验中，由于使用的动物数量大，而只从动物收集血液样品和脾脏。
结果与第二次实验一致，在对照组中约30％的标记细胞被观察到回到脾脏，而在226B抗体处理的细胞只有25％、在226G抗体处理的细胞中只有27％发现于脾脏中。血液值同样在各组间没有显示主要的差异，在对照组中约17％的总cmp发现于血中，而226B和226G处理组分别发现15.8％和14.75％。
为确定3小时是否是检测处理组间差异的最佳时间点，在第四次实验中作了很小的调整。同样，用同样的方法分离和制备细胞，用于注射到受体动物中，除了将另外一种抗CD18抗体20C5B加入到待测抗体的序列中。此外，每个条件只用4只动物。在本实验中，细胞在注射后仅允许循环30分钟，在该时间点上从动物抽取血液和取出脾脏。
在30分钟时间点上，脾脏中的总cpm从在第二次实验和第三次实验中观察到的值减少到12％至13％。在脾样品中所有的处理组没有明显的差异，虽然抗体226B处理组的四只动物中的两只具有略低的值。所有组间的血液值同样相似，在血液中发现约6至7％的总cmp。各血液组之间的唯一明显差异是来自226B和226G抗体处理动物的数值较大的扩散。这些发现表明，αd在白血病细胞返巢至脾脏中起作用。实验表明，返巢需要数小时，而用αd特异性单克隆抗体的最大抑制发生在3小时。多发性硬化和动脉粥样硬化的猕猴模型免疫细胞化学染色和免疫沉淀显示，单克隆抗体212D和217L能与猕猴脾细胞交叉反应。该识别的特异性被来自猕猴脾的一种αd种同源物的免疫沉淀和氨基端测序所证实(实施例34)。由于以前的这些观察，这两种抗体被用来对获自实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)或动脉粥样硬化研究的猕猴的组织进行染色。这两种疾病的标志都是吞噬性巨噬细胞浸润到病灶中，在EAE是摄取髓磷脂碱性蛋白(MBP)，在动脉粥样硬化是低密度脂蛋白。MBP或脂堆积巨噬细胞可以用形态学或用Oil Red(ORO)或抗体Ham56(Dako，Carpinteria，CA)染色来鉴别。这些研究中所用的方法相同于实施例18中介绍来分析αd在人组织中表达特征所用的方法。
来自患EAE的猕猴脑的切片的特征是淋巴细胞和巨噬细胞的浸润。αd在表达位于病灶中巨噬细胞的一个亚群，这些巨噬细胞能用ORO染色，表明以前摄取了MBP。ORO染色阴性的病灶也为αd表达阴性。这个结果表明了ORO染色和αd的直接联系。用抗体217K、217I和217H也观察到相似的结果。
动脉硬化病灶获自用高脂肪食物饲养的猕猴的胸主动脉或腹主动脉。在人中病灶发生在两个位置，但产生病理的病灶更通常位于腹主动脉。本研究中试验的病灶被分为5个不同的阶段(I至V)和正常。阶段(IV/V)病灶来自腹主动脉，其余来自胸主动脉。
早期病灶(I/II)显示很少的巨噬细胞浸润和低水平或没有αd表达。在后期病灶中，泡沫细胞浸润增大，并且检测到αd表达。
在两个组织中，其他白细胞整合素α链亚单位的染色图谱与αd表达重叠但不相同。最显著的是，非αd白细胞整合素的α亚单位的表达在用抗αd抗体不能染色的淋巴细胞上检测到。
这些结果表明，在两种动物模型中，αd表达可能是吞噬性巨噬细胞的特征。但还不清楚，αd是否直接参与吞噬或某些下游过程例如抗原递呈。实施例37αd在临床前模型中的表达为评价αd在不同疾病状态中的不同表达，来自动物疾病模型的组织切片用按上面介绍的方法(实施例22)制备的抗αd多克隆血清染色。来自正常和疾病大鼠的组织被切成6um厚，并在Superfrost Plus(VWR Scientific)载玻片上在室温空气干燥过夜。干燥后，切片贮存于-70℃备用。使用前，载玻片从-70℃取出，在50℃放置约5分钟。将切片在冷(4℃)丙酮(Stephens Scientific)中在室温下固定10分钟，并在室温干燥。每个切片用150ul含有30％正常大鼠血清(Harlan Bioproducts)、5％正常羊血清(Vector Laboratories)和1％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma Chemical Company)的1X TBS中在室温下封闭30分钟。然后温和地从切片上吸出溶液。将兔多克隆血清和取自同一兔的免疫前血清在封闭溶液中分别稀释为蛋白浓度34ug/ml和38.5ug/ml，并分别取100ul加入到每个切片上，37℃放置30分钟。从切片上吸出血清，并通过在1X TBS中洗涤三次以去除未结合的抗体，每次5分钟。最后一个洗涤后吸去多余的TBS。来自一个Elite兔IgG Vectastain ABC试剂盒(Vector)的生物素化的羊抗兔抗体按照厂商推荐的程序进行制备，并将所获得的溶液100ul用于每个切片，37℃放置15分钟。载玻片在1X TBS中洗涤两次，每次洗涤5分钟，然后将在5％正常大鼠血清和1％BSA中1∶100稀释的链亲和素-金接合物(Goldmark Biologicals)用于每个切片，室温放置1小时。载玻片用TBS洗涤三次，每次洗涤5分钟，并加入100ul含1％戊二醛(Sigma)的TBS缓冲液，室温5分钟。载玻片再在TBS中洗涤三次，每次洗涤5分钟，并在无菌去离子水中洗涤5次，每次洗涤3分钟。将多余的液体从每个载玻片上吸去，在每张切片上加两滴银加强和起始溶液(Goldmark Biologicals)。反应在室温下进行20-30分钟，然后将切片在无菌去离子水中充分漂洗，在室温下空气干燥过夜，并用Cytoseal 60(VWR)封固。作为对照，切片用识别CD11a、CD11b、CD11c和CD18的单克隆抗体在同一实验中用相同的方法进行标记。
用αd多克隆血清和针对CD11a、CD11b、CD11c和CD18的单克隆抗体标记，显示了αd与其他α亚单位中观察到的不同的染色图谱。
在正常肺组织中，αd表达在支气管的呼吸上皮(但不是肺泡间隙的上皮)上和似乎是气隙中肺泡巨噬细胞的单个细胞上被检测到。用多克隆血清观察到的信号明显高于用免疫前血清对照观察到的背景信号水平。在肺肉牙肿组织中，在给予多糖24和96小时后，用αd染色肺泡区域的呼吸上皮检测到不同的信号，并且在似乎是气管巨噬细胞的部分上检测到更强的信号。在来自从疾病中恢复的动物(多糖给药后16天处死)的肺组织中，用αd抗体没有观察到信号。在这些组织中，用免疫前血清观察到极少的背景信号。
使用来自抗原诱导的哮喘模型的大鼠肺组织，用αd抗体在支气管和肺泡隙的呼吸上皮中检测到了非常强的信号。该信号明显高于免疫前血清中的背景信号水平。临床前模型---单核细胞增生利斯特氏菌证据表明，脾红髓中αd阳性巨噬细胞参与从循环中清除受损的血红细胞和其他颗粒。很可能细菌物质也由脾红髓中的αd阳性巨噬细胞从循环中清除。不需要一种抗原特异性T细胞应答诱导的非感染性物质将由红髓巨噬细胞直接清除。相反，机会感染性物质由红髓巨噬细胞清除的确需要为消灭细菌而产生的T细胞免疫应答。因此有可能红髓巨噬细胞上表达的αd通过调节巨噬细胞从红髓移动到边缘区或通过作为参与导致T细胞激活的巨噬细胞/T细胞相互作用的辅助分子而起作用来帮助调节巨噬细胞/T细胞相互作用。
为研究αd在对感染性物质免疫应答中的作用，使用一个单核细胞增生利斯特氏菌小鼠模型对αd在脾脏中的表达进行了评价。对已经吞噬了细菌的红髓巨噬细胞上的αd表达进行了检测。针对αd的抗体也在此模型中进行了检测，来确定αd在诱导针对单核细胞增生利斯特氏菌的T细胞应答中所起的作用。
本领域的技术人员可对上面列出的说明性实施例作各种修改和变化。因此本发明仅由所附权利要求限定。序列表(1)一般信息(i)申请人Gallatin，W.MichaelVan der Vieren，Monica(ii)发明题目新型人β2整合素α亚单位(iii)序列数114(iv)通信地址(A)收件人Marshall，O’Toole，Gerstein，Murray & Borun(B)街道233 South Wacker Drive，6300 Sear Tower(C)城市Chicgo(D)州Illinois(E)国家美国(F)邮政编码60606-6402(v)电脑可读形式(A)媒体类型软盘(B)电脑IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0，Version #1.25(vi)当前申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类
(vii)先前申请数据(A)申请号US 08/173,497(B)申请日23-DEC-1993(vii)先前申请数据(A)申请号US 08/286,889(B)申请日5-AUG-1994(vii)先前申请数据(A)申请号US 08/362,652(B)申请日21-DEC-1994(viii)律师/代理人信息(A)姓名Williams Jr.，Joseph A.
(B)注册号码38，659(C)参考/摘要号码27866/32684(iX)电信联络信息(A)电话312-474-6300(B)传真312-474-0448(C)电报25-3856(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)长度3726碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置3..3485(xi)序列描述SEQ ID N01TG ACC TTC GGC ACT GTG CTT CTT CTG AGT GTC CTG GCT TCT TAT CAT47Thr Phe Gly Thr Val Leu Leu Leu Ser Val Leu Ala Ser Tyr His1 5 10 15GGA TTC AAC CTG GAT GTG GAG GAG CCT ACG ATC TTC CAG GAG GAT GCA 95Gly Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Gln Glu Asp Ala20 25 30GGC GGC TTT GGG CAG AGC GTG GTG CAG TTC GGT GGA TCT CGA CTC GTG 143Gly Gly Phe Gly Gln Ser Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg Leu Val35 40 45GTG GGA GCA CCC CTG GAG GTG GTG GCG GCC AAC CAG ACG GGA CGG CTG 191Val Gly Ala Pro Leu Glu Val Val Ala Ala Asn Gln Thr Gly Arg Leu50 55 60TAT GAC TGC GCA GCT GCC ACC GGC ATG TGC CAG CCC ATC CCG CTG CAC 239Tyr Asp Cys Ala Ala Ala Thr Gly Met Cys Gln Pro Ile Pro Leu His65 70 75ATC CGC CCT GAG GCC GTG AAC ATG TCC TTG GGC CTG ACC CTG GCA GCC 287Ile Arg Pro Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly 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(D)拓扑学线形(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO38GTCCAAGCTG TCATGGGCCA G21(2)SEQ ID NO39信息(i)序列特征(A)长度23碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO39GTCCAGCAGA CTGAAGAGCA CGG 23(2)SEQ ID NO40信息(i)序列特征(A)长度18碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO40TGTAAAACGA CGGCCAGT18(2)SEQ ID NO41信息(i)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形
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(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置1..3486(xi)序列描述SEQ ID NO52ATG GTC CGT GGA GTT GTG ATC CTC CTG TGT GGC TGG GCC CTG GCT TCC48Met Val Arg Gly Val Val Ile Leu Leu Cys Gly Trp Ala Leu Ala Ser1 5 10 15TGT CAT GGG TCT AAC CTG GAT GTG GAG AAG CCC GTC GTG TTC AAA GAG96Cys His Gly Ser Asn Leu Asp Val Glu Lys Pro Val Val Phe Lys Glu20 25 30GAT GCA GCC AGC TTC GGA CAG ACT GTG GTG CAG TTT GGT GGA TCT CGA 144Asp Ala Ala Ser Phe Gly Gln Thr Val Val Gln Phe Gly Gly Ser Arg35 40 45CTC GTG GTG GGA GCC CCT CTG GAG GCG GTG GCA GTC AAC CAA ACA GGA 192Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Glu Ala Val Ala Val Asn Gln Thr Gly50 55 60CAG TCG TCT GAC TGT CCG CCT GCC ACT GGC GTG TGC CAG CCC ATC TTA 240Gln Ser Ser Asp Cys Pro Pro Ala Thr Gly Val Cys Gln Pro Ile Leu65 70 75 80CTG CAC ATT CCC CTA GAG GCA GTG AAC ATG TCC CTG GGC CTG TCT CTG 288Leu His Ile Pro Leu Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu85 90 95GTG GCT GAC ACC AAT AAC TCC CAG TTG CTG GCT TGT GGT CCA ACT GCA 336Val Ala Asp Thr Asn 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(B)位置61..852(xi)序列描述SEQ ID NO92TGATCTCCCT CCAGGCCACT GTTCCCTCTC CACTTCCCCT CACCGCTGCA CTGCTCAGAG 60ATG GCC CTT GGG GCT GTG GTC CTC CTT GGG GTC CTG GCT TCT TAC CAC108Met Ala Leu Gly Ala Val Val Leu Leu Gly Val Leu Ala Ser Tyr His1 5 10 15GGA TTC AAC TTG GAC GTG ATG AGC GGT GAT CTT CCA GGA AGA CGC AGC156Gly Phe Asn Leu Asp Val Met Ser Gly Asp Leu Pro Gly Arg Arg Ser20 25 30GGG CTT CGG GCA GAG CGT GAT GCA GTT TGG GGA TCT CGA CTC GTG GTG204Gly Leu Arg Ala Glu Arg Asp Ala Val Trp Gly Ser Arg Leu Val Val
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(i)序列特征(A)长度1318碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置17..1255(xi)序列描述SEQ ID NO100AATTCGGCAC GAGCTT GGG GCT GTG GTC CTC CTT GGG GTC CTG GCT TCT 49Gly Ala Val Val Leu Leu Gly Val Leu Ala Ser1 5 10TAC CAC GGA TTC AAC TTG GAC GTG GAT GAG CCG GTG ATC TTC CAG GAA 97Tyr His Gly Phe Asn Leu Asp Val Asp Glu Pro Val Ile Phe Gln Glu15 20 25GAC GCA GCG GGC TTC GGG CAG AGC GTG ATG CAG TTT GGA GGA TCT CGA145Asp Ala Ala Gly Phe Gly Gln Ser Val Met Gln Phe Gly Gly Ser Arg30 35 40CTC GTG GTG GGA GCC CCC CTG GCG GTG GTG TCG GCC AAC CAC ACA GGA193Leu Val Val Gly Ala Pro Leu Ala Val Val Ser Ala Asn His Thr Gly45 50 55CGG CTG TAC GAG TGT GCG CCT GCC TCC GGC ACC TGC ACG CCC ATT TTC241Arg Leu Tyr Glu Cys Ala Pro Ala Ser Gly Thr Cys Thr Pro Ile Phe60 65 70 75CCA TTC ATG CCC CCC GAA GCC GTG AAC ATG TCC CTG GGC CTG TCC CTG289Pro Phe Met Pro Pro Glu Ala Val Asn Met Ser Leu Gly Leu Ser Leu80 85 90GCA GCC TCC CCC AAC CAT TCC CAG CTG CTG GCT TGT GGC CCG ACC GTG337Ala Ala Ser Pro Asn His Ser 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85 90 95CCC TTT GAG AAG AAC TGC GGA CAA GAT CGC CTG TGT GAG GGG GAC CTG336Pro Phe Glu Lys Asn Cys Gly Gln Asp Arg Leu Cys Glu Gly Asp Leu100 105 110AGC ATC AGC TTC AAC TTC TCG GGC TTG AAT ACC CTG CTG GTG GGG CTC384Ser Ile Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Asn Thr Leu Leu Val Gly Leu115 120 125TCC CTG GAG CTC ACA GTG ACA GTG ACC GTG CGG AAT GAG GGC GAG GAC432Ser Leu Glu Leu Thr Val Thr Val Thr Val Arg Asn Glu Gly Glu Asp130 135 140TCC TAT GGG ACC GCC ATC ACC CTC TAC TAC CCA GCA GGG CTA TCC TAC480Ser Tyr Gly Thr Ala Ile Thr Leu Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser Tyr145 150 155 160AGG CGG GTG TCG GGC CAG ACA CAA CCC TGG CAG CGC CCC CTG CAC CTC528Arg Arg Val Ser Gly Gln Thr Gln Pro Trp Gln Arg Pro Leu His Leu165 170 175GCA TGT GAG GCT GTA CCT ACC GAG AGC GAG GGC TTG AGG AGT ACC AGC576Ala Cys Glu Ala Val Pro Thr Glu Ser Glu Gly Leu Arg Ser Thr Ser180 185 190TGC AGC GTC AAC CAC CCC ATC TTC CAA GGG GGT GCT CAG GGC ACT TTC624Cys Ser Val Asn His Pro Ile Phe Gln Gly Gly Ala Gln Gly Thr Phe195 200 205GTA GTC AAG TTC GAT GTC TCC TCC AAG GCC AGC CTG GGT GAC AGG TTG672Val Val Lys Phe Asp Val Ser Ser Lys Ala Ser Leu Gly Asp Arg Leu210 215 220CTC ATG GGG GCC AGT GCC AGC AGT GAG AAT AAT AAG CCT GCG AGC AAC720Leu Met Gly Ala Ser Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro Ala Ser Asn225 230 235 240AAG ACC TCC TTT GAG CTG GAA CTG CCA GTG AAA TAC GCT GTC TAC ATG768Lys Thr Ser Phe Glu Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Ala Val Tyr Met245 250 255ATG ATC ACA AGG CAC GAA GGC TCC ACC AGG TTC TTC AAC TTT TCC ACT816Met Ile Thr Arg His Glu Gly Ser Thr Arg Phe Phe Asn Phe Ser Thr260 265 270TCC GCT GAG AAG AGC AGC AAA GAG GCC GAG CAC CGC TAT CGG GTG AAC864Ser Ala Glu Lys Ser Ser Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr Arg Val Asn275 280 285AAC CTG AGT CTG CGA GAT GTG GCC GTC AGC GTG GAC TTC TGG GCC CCC912Asn Leu Ser Leu Arg Asp Val Ala Val Ser Val Asp Phe Trp Ala Pro290 295 300GTG CAG CTG AAC GGA GCA GCT GTG TGG GAC GTG GCG GTG GAG GCC CCT 960Val Gln Leu Asn Gly Ala Ala Val Trp Asp Val Ala Val Glu Ala Pro305 310 315 320GCC CAG AGC CTG CCC TGT GCG CGG GAG AGG GAA CCT CCG AGG ACC TCT 1008Ala Gln Ser Leu Pro Cys Ala Arg Glu Arg Glu Pro Pro Arg Thr Ser325 330 335GAC CTG AGC CGG GTC CCG GGG AGT CCC GTG CTG GAC TGC AGC GTT GCG 1056Asp Leu Ser Arg Val Pro Gly Ser Pro Val Leu Asp Cys Ser Val Ala340 345 350CAC TGC CTG AGG TTC CGC TGC CAC ATC CCC TCC TTC AGC GCC AAG GAG 1104His Cys Leu Arg Phe Arg Cys His Ile Pro Ser Phe Ser Ala Lys Glu355 360 365GAG CTC CAC TTC ACC CTG AAG GGC AAC CTC AGC TTC GCC TGG GTC AGC 1152Glu Leu His Phe Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Ala Trp Val Ser370 375 380CAG ATG CTG CAA AAG AAG GTG TCG GTG GTG AGT GTG GCC GAG ATC ACC 1200Gln Met Leu Gln Lys Lys Val Ser Val Val Ser Val Ala Glu Ile Thr385 390 395 400TTC AAC AGG GCC GTG TAC TCC CAA GTT CCG GGC GAG GAG CCC TTT ATG 1248Phe Asn Arg Ala Val Tyr Ser Gln Val Pro Gly Glu Glu Pro Phe Met405 410 415AGA GCC CAG GTG GAG ACG GTG CTG GAG GAG TAT GAG GAG CAC GAC CCC 1296Arg Ala Gln Val Glu Thr Val Leu Glu Glu Tyr Glu Glu His Asp Pro420 425 430GTC CCC CTG GTG GTG GGC AGC TGT GTG GGC GGC CTG CTG CTG CTG GCT 1344Val Pro Leu Val Val Gly Ser Cys Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu Ala435 440 445CTC ATC TCA GCC ACC CTG TAC AAG CTT GGC TTC TTC AAG CGC CGG TAC 1392Leu Ile Ser Ala Thr Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg Arg Tyr450 455 460AAG GAG ATG CTG GGC GAG AAA CCG GGA GAC GCG GCC ACC TTC CCC GGG 1440Lys Glu Met Leu Gly Glu Lys Pro Gly Asp Ala Ala Thr Phe Pro Gly465 470 475 480GAG GAC GCC AGC TGC GGG GCT TCA GAT TTG CCT TTG TCC CAG 1482Glu Asp Ala Ser Cys Gly Ala Ser Asp Leu Pro Leu Ser Gln485 490TG 1484(2)SEQ ID NO103信息(i)序列特征(A)长度494氨基酸
(B)类型氨基酸(D)拓扑学线形(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO103Asp Val Gln Ser Ser Ile Ser Tyr Asp Leu Ala Leu Asp Pro Gly Arg1 5 10 15Leu Val Ser Arg Ala Ile Phe Gln Glu Thr Gln Asn Gln Thr Leu Thr20 25 30Arg Arg Lys Thr Leu Gly Leu Gly Arg His Cys Glu Thr Met Arg Leu35 40 45Leu Leu Pro Asp Cys Val Glu Asp Val Val Asn Pro Ile Val Leu His50 55 60Leu Asn Phe Ser Leu Glu Gly Gln Pro Ile Leu Ser Ser Gln Asn Leu65 70 75 80Arg Pro Val Leu Ala Thr Gly Ser Gln Asp His Phe Ile Ala Ser Leu85 90 95Pro Phe Glu Lys Asn Cys Gly Gln Asp Arg Leu Cys Glu Gly Asp Leu100 105 110Ser Ile Ser Phe Asn Phe Ser Gly Leu Asn Thr Leu Leu Val Gly Leu115 120 125Ser Leu Glu Leu Thr Val Thr Val Thr Val Arg Asn Glu Gly Glu Asp130 135 140Ser Tyr Gly Thr Ala Ile Thr Leu Tyr Tyr Pro Ala Gly Leu Ser Tyr145 150 155 160Arg Arg Val Ser Gly Gln Thr Gln Pro Trp Gln Arg Pro Leu His Leu165 170 175Ala Cys Glu Ala Val Pro Thr Glu Ser Glu Gly Leu Arg Ser Thr Ser180 185 190Cys Ser Val Asn His Pro Ile Phe Gln Gly Gly Ala Gln Gly Thr Phe195 200 205Val Val Lys Phe Asp Val Ser Ser Lys Ala Ser Leu Gly Asp Arg Leu
210 215 220Leu Met Gly Ala Ser Ala Ser Ser Glu Asn Asn Lys Pro Ala Ser Asn225 230 235 240Lys Thr Ser Phe Glu Leu Glu Leu Pro Val Lys Tyr Ala Val Tyr Met245 250 255Met Ile Thr Arg His Glu Gly Ser Thr Arg Phe Phe Asn Phe Ser Thr260 265 270Ser Ala Glu Lys Ser Ser Lys Glu Ala Glu His Arg Tyr Arg Val Asn275 280 285Asn Leu Ser Leu Arg Asp Val Ala Val Ser Val Asp Phe Trp Ala Pro290 295 300Val Gln Leu Asn Gly Ala Ala Val Trp Asp Val Ala Val Glu Ala Pro305 310 315 320Ala Gln Ser Leu Pro Cys Ala Arg Glu Arg Glu Pro Pro Arg Thr Ser325 330 335Asp Leu Ser Arg Val Pro Gly Ser Pro Val Leu Asp Cys Ser Val Ala340 345 350His Cys Leu Arg Phe Arg Cys His Ile Pro Ser Phe Ser Ala Lys Glu355 360 365Glu Leu His Phe Thr Leu Lys Gly Asn Leu Ser Phe Ala Trp Val Ser370 375 380Gln Met Leu Gln Lys Lys Val Ser Val Val Ser Val Ala Glu Ile Thr385 390 395 400Phe Asn Arg Ala Val Tyr Ser Gln Val Pro Gly Glu Glu Pro Phe Met405 410 415Arg Ala Gln Val Glu Thr Val Leu Glu Glu Tyr Glu Glu His Asp Pro420 425 430Val Pro Leu Val Val Gly Ser Cys Val Gly Gly Leu Leu Leu Leu Ala435 440 445Leu Ile Ser Ala Thr Leu Tyr Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg Arg Tyr450 455 460Lys Glu Met Leu Gly Glu Lys Pro Gly Asp Ala Ala Thr Phe Pro Gly465 470 475 480Glu Asp Ala Ser Cys Gly Ala Ser Asp Leu Pro Leu Ser Gln485 490(2)SEQ ID NO104信息
(i)序列特征(A)长度26碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO104TGTCCAGGAC AAGAGATGGA CATTGC262)SEQ ID NO105信息(i)序列特征(A)长度24碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO105GAGCTATTTC ATAGCAAGAA TGGG 242)SEQ ID NO106信息(i)序列特征(A)长度20碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO106TATAGCATAG CGAATGATCC 202)SEQ ID NO107信息(i)序列特征
(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO107ATGGTCCGTG GAGTTGTGAT C 212)SEQ ID NO108信息(i)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线形(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQ ID NO108TCGAGATCCA CCAAACTGCA C 21(2)SEQ ID NO109信息(i)序列特征(A)长度14氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线形(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO109Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Gln Glu Asp Ala1 5 10(2)SEQ ID NO110信息(i)序列特征(A)长度14氨基酸
(B)类型氨基酸(D)拓扑学线形(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO110Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Xaa Glu Asp Ala1 5 10(2)SEQ ID NO111信息(i)序列特征(A)长度15氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线形(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO111Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Gln Glu Asp Ala1 5 10 15(2)SEQ ID NO112信息(i)序列特征(A)长度17氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线形(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO112Phe Asn Leu Asp Val Glu Glu Pro Thr Ile Phe Gln Glu Asp Ala Gly1 5 10 15Gly(2)SEQ ID NO113信息(i)序列特征(A)长度16氨基酸
(B)类型氨基酸(D)拓扑学线形(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO113Phe Asn Leu Asp Thr Glu Glu Leu Thr Ala Phe Val Asp Ser Ala Gly1 5 10 15(2)SEQ ID NO114信息(i)序列特征(A)长度17氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学线形(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO114Phe Asn Leu Asp Thr Glu Asn Ala Met Thr Phe Gln Glu Asn Ala Arg1 5 10 15Gly
权利要求
1.一种鉴定αd与VCAM-1之间结合的调节剂的方法，该方法包括以下步骤a)将αd和VCAM-1在存在或不存在一种推定的调节剂化合物的情况下接触，b)检测αd与VCAM-1之间的结合，并c)视αd与VCAM-1之间的结合在存在推定调节剂的情况下与不存在推定调节剂的情况下的结合相比是减少还是增加，来鉴定一种推定的调节剂。
2.权利要求1的方法，该方法在一种含有可溶性的αd和一种可溶性的VCAM-1的宿主细胞中进行，其中减少或增加的结合通过测量宿主细胞中结合依赖的表型改变来定量，所说的表型改变是一种表达中的改变或一个报告基因产物造成的。
3.一种鉴定调节αd与VCAM-1之间结合的化合物的方法，该方法包括以下步骤a)将αd或其一种片段、或VCAM-1或其一种片段固化在一种固相支持物上，b)用一种可检测的试剂标记未固化的结合伙伴，c)将所说的固化的结合伙伴与所说的标记的结合伙伴在存在或不存在一种能够与αd或VCAM-1特异性反应的推定调节剂化合物的情况下接触，d)检测所说的固化结合伙伴与所说的标记结合伙伴之间的结合，并e)将那些影响所说的固化的结合伙伴与所说的标记结合伙伴之间结合的化合物鉴定为调节化合物。
4.权利要求3的方法，其中αd或VCAM-1固化在用一种荧光试剂包被或浸没的固相支持物上，所说的非固化的结合伙伴用一种能激发所说的荧光试剂的化合物标记，并且αd与αd结合伙伴的相互作用通过从所说的荧光试剂的光发射来检测。
全文摘要
本发明公开了鉴定与VCAM－1结合的α
文档编号G01N33/50GK1246869SQ98802282
公开日2000年3月8日 申请日期1998年10月2日 优先权日1997年10月3日
发明者W·M·加勒廷, M·范德维伦 申请人:艾科斯有限公司