专利名称：霍乱弧菌毒素基因多重实时荧光定量pcr检测试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及一种霍乱弧菌毒素基因多重实时荧光定量PCR检测试剂盒及方法。
背景技术：
霍乱是由霍乱弧菌引起的急性肠道传染病，是《中华人民共和国传染病防治法》规定的甲类传染病之一，具有发病急、传播快、波及范围广等特点，曾在世界上引起多次大规模流行。主要表现为呕吐、失水、腹泻等症状。目前认为只有01和0139血清群霍乱弧菌引起霍乱疫情，主要的致病因素取决于菌体本身携带的生物学特征，霍乱弧菌的毒力因子包括霍乱毒素(Cholera toxin，CT)、小带联结毒素(Zonula occludens toxin，Ζ0Τ)、辅助霍乱肠毒素(Accessory cholera enterotoxin, ACE)等。在疫情防制过程中，分离的霍乱弧菌是否携带毒素是判定疫情极为重要的参考指标，不携带毒力因子的霍乱弧菌通常致病力不强，仅引起腹泻等轻微临床症状，不会导致大规模流行。因此，对霍乱弧菌菌体携带的毒力因子进行检测、对产毒株与否的鉴定是及时、有效地判断疫情暴发机率和评价疫情严重性的前提和基础，为进一步采取防制措施提供可靠的依据。目前，霍乱弧菌常规检测以传统培养方法为主，不仅操作繁琐，耗时长，无法判定菌体内是否含有毒力因子。针对霍乱弧菌毒素分子鉴定主要依靠动物实验模型和细胞方法、免疫学实验方法，实验周期长，动物个体差异较大，可比性不强，操作步骤繁多，而且每次实验只能对一种目标毒素进行检测，无法同时鉴定多种毒素因子，无法达到疫情控制的需要。分子生物学技术能够在很大程度上提高检测效率，目前已经广泛应用于病原菌的检测和毒素基因鉴定领域。但是由于菌体携带毒力因子的状况比较复杂，依靠多重荧光定量 PCR技术能够通过一次实验操作得到较为完整的菌体携带毒素因子信息。
发明内容
本发明涉及一种针对霍乱弧菌三种毒素基因的多重荧光定量PCR检测试剂盒和方法，根据霍乱毒素A亚单位基因(CtxA)、辅助霍乱肠毒素基因(ace)、小带联结毒素基因 (zot)设计特异性引物和探针，对霍乱弧菌菌体携带毒力基因情况进行准确、有效地甄别。本发明采用的技术方案是一种霍乱弧菌毒素基因多重实时荧光定量PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和探针以及PCR反应试剂，其特征在于，所述特异性引物和探针由霍乱毒素A亚单位基因(CtxA)、辅助霍乱肠毒素基因(ace)和小带联结毒素基因(zot)的特异性引物和探针组成CtxA 上游引物 Fl 5' -AAC GTT AAT GAT GTA TTA GGG GCA T-3'ctxA 下游引物 Rl 5' -GTT ACT GTAATA TCT ATC TCT GTA G-3'ctxA 探针 Pl 5' (HEX)-ATA CTC CCA AAT ATA TGG ATGGT-(BHQl)-3'ace 上游引物 F2 5' -GGA GAT GTC CCA GAAAGT GAT TG-3'
ace 下游引物 R2 5' -CGG GTC ATC AAA GCC TGAAG-3'ace 探针 P2 5' -(FAM)-TGC TGC CTC CTC AAT ACA GCGGCT-(BHQl)-3'zot 上游引物 F3 5' -CAC CAC GGC TGG GAT ATC TG-3'zot 下游引物 R3:5' -CTATCT CCG CCG CCT CTC T-3'zot 探针 Ρ3 :5' -(Cal610)-CAC GCC TAA CAT TGC CAA AGTGCA-(BHQ2)-3'其中FAM、HEX和CaieiO为不同波长的荧光报告基团(FAM的激发/接受波长为495nm/512nm，HEX的激发/接受波长为535nm/556nm，Cal610的激发/接受波长为 590nm/610nm)，BHQl和BHQ2为荧光淬灭基团。本发明的关键在于扩增引物的设计，试剂盒中其他组成，可按本领域常规进行选择。PCR反应试剂包括PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶等，其中PCR缓冲液可采用市购商品，也可自行配制，例如将Tris-HCl、KC1、MgCl2等按比例混合进行配制， 进行检测时，将PCR反应试剂和扩增引物和探针混合，再加入待测样品或对照品，即可进行 PCR扩增反应。为达到定量检测的效果，所述试剂盒还可包括霍乱毒素A亚单位基因(CtxA)、辅助霍乱肠毒素基因(ace)和小带联结毒素基因(zot)的标准品，所述标准品序列如下ctxA ^ ( :aacgttaatg atgtattagg ggcatacagt cctcatccag atgaacaaga agtttctgct ttaggtggga ttccatactc ccaaatatat ggatggtatc gagttcatttt ggggtgcttga tgaacaatta catcgtaata ggggctacag agatagatat tacagtaacace 标准品ggagatgtcc cagaaagtga ttgatatgtt taccatctat ccgcttatcc aacaggctat cgatatgctg cctcctcaat acagcggctt tctgttcttt ttagggttag accaagcgct ggctatcgtg cttcaggctt tgatgacccgzot 标准 品:caccacggc tgggatatct gcctaaccac gcctaacattgccaaagtgc acaacatgat aagagaggc g gcggagatago本发明还涉及一种霍乱弧菌毒素基因的多重实时荧光定量PCR检测方法，所述方法包括(1)提取待测样品DNA ；(2)以待测样品DNA为模板，加入霍乱毒素A亚单位基因(ctxA)、辅助霍乱肠毒素基因(ace)和小带联结毒素基因(zot)的特异性引物和探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶配制PCR反应液，进行PCR扩增，以非靶细菌为阴性对照于相同条件下进行PCR扩增，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性(三对引物添加的荧光报告基团波长不同，各自荧光检测在相应波长下进行)；所述特异性引物和探针如前所述。为达到定量检测的效果，所述方法可同时以霍乱弧菌的霍乱毒素A亚单位基因 (ctxA)、辅助霍乱肠毒素基因(ace)和小带联结毒素基因(zot)标准品的梯度浓度的DNA 溶液进行荧光PCR检测，分别根据拷贝浓度的对数值与各标准品Ct值的关系绘制得到标准曲线，测得样品DNA的Ct值后，对照相应标准曲线获得样品DNA中相应基因的拷贝浓度；所述标准品序列如前所述。所述PCR扩增条件如下93°C预变性5分钟，93°C 20秒、55°C 45秒进行40个循环
扩增，最后置4°C。
本发明的有益效果主要体现在本发明针对霍乱弧菌毒素基因提供了一种快速、 准确、有效的多重荧光定量PCR检测方法和检测试剂盒，为及时采取有效措施对霍乱弧菌导致的大规模疫情进行防控提供了基础。
图1为标准品检测结果；图2为实时荧光定量PCR标准曲线；图3为三种毒素基因全部阳性的样本检测结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 特异性引物、荧光探针构建标准品1、材料pGEM-T-Easy克隆系统、PCR相关试剂及Taq DNA聚合酶购自上海辉睿生物技术公司，细菌基因组DNA提取试剂购自宝生物工程(大连)有限公司，分光光度计(Eppendorf 公司)、377 型测序仪(ABI 公司),Bio-Rad icycler PCR 仪(Bio-Rad 公司)、MX3000P 实时定量 PCR 仪(Stratagene 公司)。2、引物和探针设计与合成针对霍乱弧菌的霍乱毒素A亚单位基因(ctxA) (EF158842)、辅助霍乱肠毒素基因 (ace) (AF416590)、小带联结毒素基因(zot) (AF516349)，采用 Primer Express 3. O (ABI 公司)软件设计引物和探针，从中选择最佳组合。3、检测标准品制备用DNA提取试剂提取基因组DNA，用分光光度计测定浓度，取1. Ομ L(50ng/l·! L)做 PCR反应模板，分别三对用上下游引物在Bio-Rad ieyeIerPCR仪上进行PCR扩增，PCR反应液组成如下2 XPCR buffer 10. O μ L，上游引物(10 μ Μ) 1 μ L，下游引物(10 μ Μ) 1 μ L，DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0. 2 μ L，dNTPs (各 250mM) 1. 60 μ L,模板 DNAl μ L,最后水补足至 20 μ L。 PCR条件为94°C 5分钟变性，94°C 30秒、55°C 30秒、72°C 30秒进行35个循环扩增，最后于72°C延伸5分钟后置4°C。PCR产物经电泳检测后即用克隆系统插入pGEM-T-Easy克隆载体，并将阳性克隆经测序验证。ctxA基因回收171bp片段、ace基因回收150bp片段、zot回收79bp片段，即为标准品，测定浓度并换算成(拷贝数/体积)。4、结果经测序，上述设计标准品完全与预期相符，回收的标准品片段序列如下霍乱毒 ■ (ctxA)( ^lJ :aacgttaatg atgtattagg ggcatacagt cctcatccag atgaacaaga agtttctgct ttaggtggga ttccatactc ccaaatatat ggatggtatc gagttcatttt ggggtgcttga tgaacaatta catcgtaata ggggctacag agatagatat已已C01 ) !^! ! (ace) 1^^( ^^!] :ggagatgtcc cagaaagtga ttgatatgtt taccatctat ccgcttatcc aacaggctat cgatatgctg cctcctcaat acagcggctt tctgttcttt ttagggttag accaagcgct ggctatcgtgcttcaggctt tgatgacccg。小带联结毒素基因(zot)标准品序列为caccacggc tgggatatct gcctaaccac gcctaacattgccaaagtgc acaacatgat aagagaggcg gcggagatago实施例2 环境分离株的霍乱弧菌毒素基因检测1、荧光PCR方法选择46株环境样本霍乱弧菌分离株，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组 DNA,并在MX3000P实时定量PCR仪(Mratagene公司)进行荧光PCR扩增。检测用引物和探针如下CtxA 基因上游引物 Fl 5' -AAC GTT AAT GAT GTA TTA GGG GCA T-3'ctxA 基因下游引物 Rl 5' -GTT ACT GTAATA TCT ATC TCT GTA G-3'ctxA 基因探针 Pl 5' (HEX)-ATA CTC CCA AAT ATA TGG ATGGT-(BHQl)-3'ace 基因上游引物 F2 5' -GGA GAT GTC CCA GAAAGT GAT TG-3'ace 基因下游引物 R2 5' -CGG GTC ATC AAA GCC TGAAG-3'ace 基因探针 P2 5' -(FAM)-TGC TGC CTC CTC AAT ACA GCGGCT-(BHQl)-3'zot 基因上游引物 F3 5' -CAC CAC GGC TGG GAT ATC TG-3'zot 基因下游引物 R3 :5' -CTATCT CCG CCG CCT CTC T-3'zot 基因探针 Ρ3 5' -(Cal610)-CAC GCC TAA CAT TGC CAA AGTGCA-(BHQ2) -3‘其中FAM、HEX和CA1610为荧光报告基团，BHQl和BHQ2为荧光淬灭基团。PCR 反应液组成如下10XPCR buffer 5· O μ L，ctxA 上游引物(10 μ Μ) 3· O μ L， ctxA下游引物(10 μ Μ) 2. O μ L，ace上游引物(10 μ M) 1. 6 μ L，ace下游引物 (10 μ M) 2. 4 μ L, zot 上游引物(10 μ Μ) 2. 4 μ L, zot 下游引物(10 μ Μ) 1.6 μ L, ctxA 荧光探针(10 μ Μ) 1. 8 μ L，ace 荧光探针(10 μ Μ) 1. O μ L，zot 荧光探针(10 μ Μ) 1. 0 μ L, DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0· 2 μ L，dNTPs (各 250mM) 4. 0 μ L,模板 DNAl μ L,水补足至 50 μ L。PCR反应条件为93°C预变性5分钟，93°C 20秒、55°C 45秒进行40个循环扩增， 最后置4°C。以非靶细菌(副溶血性弧菌CMCC20022)为阴性对照于相同条件下进行PCR检测， 以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测细菌荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。同时在相同条件下以不同浓度标准品进行检测，并绘制标准曲线。待测细菌的测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测霍乱弧菌三种毒力基因(ctxA，ace和zot)的数量。以肠出沙门氏菌(CICC21490)、血性大肠杆菌(EHEC) 0157:H7 (ATCC43889)，致病性大肠杆菌(EPEC) (ATCC 43887)，肠产毒性大肠杆菌(ETEC) (ATCC3M01)，肠侵袭性大肠杆菌(EIEC) (ATCC 43893)，创伤弧菌(CICC 10383)、志贺菌(ACCC04121)等按照上述方法进行检测，结果均为阴性，说明本发明方法特异性好。2、分离株检测结果46株样本分离株中携带三种毒素基因的为2株，44株菌或只含有ctxA，或含有另外两种毒素基因。图1为标准品检测结果，从左至右分别1 :106copies/uL,2 105copies/uLo 3 104copies/uL、4 103copies/uL、5 102copies/uL、6 IOlCopiesAiL 标准品；
图2为实时荧光定量PCR标准曲线。CtxA的标准曲线为y = -4. 039XlgX+41.44， 2 :ace的标准曲线为y = -3. 470 X lgX+37. 57，3 :zot的标准曲线为y =-3. 908X lgX+39. 82 ；y 对应的CT值；χ 基因拷贝数；图3显示了三种霍乱毒素基因全部阳性的样本检测结果，按照标准曲线计算细菌，1号样本ctxA, ace和zot基因的CT值分别为23. 87,22. 62和25. 95，对应的基因拷贝数为 2. 24X 104copies/uL、2. 04X 104copies/uL和 3. 55X 103copies/uL ；2 号样本ctxA、ace 和zot基因的CT值分别为22. 59,23. 55和21. 03，对应的基因拷贝数为4. 68X IO4Copies/ uL、1. 10 X 104copies/uL 和 2. 63 X 105copies/uL。
权利要求
1.一种霍乱弧菌毒素基因多重实时荧光定量PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和探针以及PCR反应试剂，其特征在于，所述特异性引物和探针由霍乱毒素A亚单位基因 (CtxA)、辅助霍乱肠毒素基因(ace)和小带联结毒素基因(zot)的特异性引物和探针组成CtxA 上游引物 Fl 5' -AAC GTT AAT GAT GTA TTA GGG GCA T-3'ctxA 下游引物 Rl 5' -GTT ACT GTAATA TCT ATC TCT GTA G-3'ctxA 探针 Pl 5' (HEX)-ATA CTC CCA AAT ATA TGG ATG GT-(BHQl)-3'ace 上游引物 F2 5' -GGA GAT GTC CCA GAAAGT GAT TG-3'ace 下游引物 R2 :5' -CGG GTC ATC AAA GCC TGAAG-3 ‘ace 探针 P2 5' -(FAM)-TGC TGC CTC CTC AAT ACA GCGGCT-(BHQl)-3'zot 上游引物 F3 5' -CAC CAC GGC TGG GAT ATC TG-3' zot 下游引物 R3 5' -CTATCT CCG CCG CCT CTC T-3' zot 探针 Ρ3 5' -(Cal610)-CAC GCC TAA CAT TGC CAA AGT GCA-(BHQ2)-3‘其中FAM、HEX和Cal610为不同波长的荧光报告基团，BHQl和BHQ2为荧光淬灭基团。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括霍乱毒素A亚单位基因 (ctxA)、辅助霍乱肠毒素基因(ace)和小带联结毒素基因(zot)的标准品，所述标准品序列如下ctxA 标准 品:aacgttaatg atgtattagg ggcatacagt cctcatccag atgaacaagaagtttctgct ttaggtggga ttccatactc ccaaatatat ggatggtatc gagttcatttt ggggtgcttga tgaacaatta catcgtaata ggggctacag agatagatat tacagtaacace 标准 品:ggagatgtcc cagaaagtga ttgatatgtt taccatctat ccgcttatcc aacaggctat cgatatgctg cctcctcaat acagcggctt tctgttcttt ttagggttag accaagcgct ggctatcgtg cttcaggctt tgatgacccgzot标准品:caccacggc tgggatatct gcctaaccac gcctaacattgccaaagtgc acaacatgat aagagaggcg gcggag￡it￡ig0
3.一种霍乱弧菌毒素基因的多重实时荧光定量PCR检测方法，所述方法包括(1)提取待测样品DNA；(2)以待测样品DNA为模板，加入霍乱毒素A亚单位基因(ctxA)、辅助霍乱肠毒素基因 (ace)和小带联结毒素基因(zot)的特异性引物和探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶配制PCR反应液，进行PCR扩增，以非靶细菌为阴性对照于相同条件下进行 PCR扩增，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性；所述特异性引物和探针如下ctxA 上游引物 Fl 5' -AAC GTT AAT GAT GTA TTA GGG GCA T-3' ctxA 下游引物 Rl 5' -GTT ACT GTAATA TCT ATC TCT GTA G-3' ctxA 探针 Pl 5' (HEX)-ATA CTC CCA AAT ATA TGG ATG GT-(BHQl)-3' ace 上游引物 F2 5' -GGA GAT GTC CCA GAAAGT GAT TG-3' ace 下游引物 R2 :5' -CGG GTC ATC AAA GCC TGAAG-3‘ace 探针 P2 5' -(FAM)-TGC TGC CTC CTC AAT ACA GCG GCT-(BHQl)-3'zot 上游引物 F3 5' -CAC CAC GGC TGG GAT ATC TG-3'zot 下游引物 R3 5' -CTATCT CCG CCG CCT CTC T-3'zot 探针 Ρ3 5' -(Cal610)-CAC GCC TAA CAT TGC CAA AGT GCA-(BHQ2)-3‘其中FAM、HEX和Cal610为不同波长的荧光报告基团，BHQl和BHQ2为荧光淬灭基团。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法同时以霍乱弧菌的霍乱毒素A亚单位基因(CtxA)、辅助霍乱肠毒素基因(ace)和小带联结毒素基因(zot)标准品的梯度浓度的DNA溶液进行荧光PCR检测，分别根据拷贝浓度的对数值与各标准品Ct值的关系绘制得到标准曲线，测得样品DNA的Ct值后，对照相应标准曲线获得样品DNA中相应基因的拷贝浓度；所述标准品序列如下ctxA ^ ( :aacgttaatg atgtattagg ggcatacagtcctcatccag atgaacaaga agtttctgct ttaggtggga ttccatactc ccaaatatat ggatggtatc gagttcatttt ggggtgcttga tgaacaatta catcgtaata ggggctacag agatagatat tacagtaacace 标准 品:ggagatgtcc cagaaagtga ttgatatgtt taccatctat ccgcttatcc aacaggctat cgatatgctg cctcctcaat acagcggctt tctgttcttt ttagggttag accaagcgct ggctatcgtg cttcaggctt tgatgacccgzot1^^( :caccacggc tgggatatct gcctaaccac gcctaacattgccaaagtgc acaacatgat aagagaggcg gcggagatago
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述PCR扩增条件如下93°C预变性5分钟，93°C 20秒、55°C 45秒进行40个循环扩增，最后置4°C。
全文摘要
本发明提供了一种针对霍乱弧菌三种毒素基因的多重荧光定量PCR检测试剂盒和方法，根据霍乱毒素A亚单位基因(ctxA)、辅助霍乱肠毒素基因(ace)、小带联结毒素基因(zot)设计特异性引物和探针，对霍乱弧菌菌体携带毒力基因情况进行准确、有效地甄别。本发明针对霍乱弧菌毒素基因提供了一种快速、准确、有效的多重荧光定量PCR检测方法和检测试剂盒，为及时采取有效措施对霍乱弧菌导致的大规模疫情进行防控提供了基础。
文档编号G01N21/64GK102533967SQ20111034118
公开日2012年7月4日 申请日期2011年11月2日 优先权日2011年11月2日
发明者吴方, 周惠芳, 张政, 朱海燕, 王建兰, 罗芸, 蒋逸群, 金大智, 顾建忠 申请人:海宁市疾病预防控制中心