一种结合霍乱肠毒素b亚单位的核酸适配子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种能特异结合霍乱肠毒素B亚单位的寡核苷酸适配子及应用。所述适配子是一条81个碱基长的单链DNA分子，具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。该适配子采用系统进化指数富集技术筛选获得，可用于制备霍乱肠毒素的检测试剂，具有稳定、简便、快速、经济等优点。
【专利说明】-种结合霍乱肠毒素 B亚单位的核酸适配子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，具体涉及一种能特异性高亲和力结合霍乱肠毒素 B亚 单位的核酸适配子，及其在霍乱肠毒素检测中的应用。
【背景技术】
[0002] 霍乱（Cholera)是由01群和0139群霍乱弧菌感染引起的一种烈性肠道传染病， 是以发病急、传播快、波及范围广，能引起大流行为特征的国际检疫传染病之一。我国把霍 乱列为甲类法定传染病，是国境口岸重点检疫的传染病。霍乱弧菌主要通过其分泌的毒素 引起感染者剧烈腹泻和呕吐等临床症状。霍乱肠毒素 （cholera enterotoxin, CT)是霍乱 弧菌外毒素中最主要的一种，也是引起霍乱的主要致病因子。它由一个A亚单位（cholera enterotoxin subunitA, CT-A)和 5 个 B 亚单位（cholera enterotoxin subunit B, CT-B) 组成。B亚单位为非毒素蛋白，是毒素与宿主细胞受体结合的部分,介导CT-A进入细胞。霍 乱肠毒素的检出对确定霍乱弧菌是否引起流行具有重要的临床和流行病学意义。
[0003] 传统的霍乱弧菌方法需要先分离再培养，然后用经典的方法鉴定，耗时、不灵敏是 这些方法普遍存在的问题。免疫学方法简单、方便、迅速、特异性较好，但是仍有交叉反应比 较严重、假阳性多、灵敏度偏低等不足之处。聚合酶链式反应（PCR)技术虽具有准确、灵敏、 快速的特点，但其在检测数目较多的样品时操作比较繁杂，因此在聚合酶链式反应（PCR) 技术的基础上又衍生出很多新型聚合酶链式反应（PCR)技术，如多重PCR技术，然而多重 PCR虽简化了 PCR实验的操作，但是由于该技术需数对引物同时进行扩增，很容易产生非特 异性条带或假阳性，影响检测结果。而目前尚未有专门针对霍乱肠毒素检测的报道。
[0004] 核酸适配子（aptamer)指能与祀分子以高亲和力结合的配基，是通过一种组 合化学技术一指数富集配基的系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)，从人工合成的大容量的单链随机寡核苷酸文库中通过 反复"与靶分子作用-筛选、富集"过程，筛选出的对靶分子结合具有高特异性和高结合性 的寡核苷酸分子，又可称为适配体。由于核酸适配子在功能上与传统抗体类似，与靶物质结 合的特异性和亲和力甚至优于抗体，加上其靶分子广、稳定性高、攻击靶分子的效率高、易 改造修饰等特点，已成为分子识别的有力工具，可在基础研究、临床快速诊断、药物研发等 方面得以广泛开发应用。
[0005] 本发明以霍乱肠毒素的B亚单位为靶蛋白，利用SELEX技术筛选获得能与靶蛋白 特异结合的适配子，可用于检测霍乱肠毒素。由于以单链DNA形式存的核酸适配子可采用 化学方法在体外合成，成本低廉，性质稳定，与靶蛋白亲和力高，可以在检测方法中直接应 用，具有操作简便快速等优点。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种简便快速特异的霍乱肠毒素 检测方法。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明的内容包括：
[0008] -种特异结合霍乱肠毒素 B亚单位的单链寡核苷酸适配子，其核苷酸序列如序列 表中SEQ ID No. 1所述。
[0009] 进一步的，本
【发明内容】
还包括所述核酸适配子在制备霍乱肠毒素检测试剂中的应 用。
[0010] 与现有有技术相比，本发明的适配子为单链DNA分子，比蛋白类的抗体更加稳定； 该适配子能够特异的结合霍乱肠毒素 B亚单位，可利用自动化的机器进行体外人工合成和 标记，相对抗体的获得更为简便快速、价格低廉，具有良好的应用前景。
[0011] 为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1为不对称PCR扩增第12轮SELEX筛选获得ssDNA的电泳图。其中，M为20bp DNA分子量标记。81nt处为单链DNA产物。泳道1 一泳道5为平行扩增5管。
[0013] 图2为所述适配子的二级结构。
[0014] 图3为检测适配子与霍乱肠毒素 B亚单位亲和性的膜杂交试验图。1号格为BSA的 阴性对照，2号格为空白对照；第3、4、5、6号格霍乱肠毒素 B亚单位的点样量分别是：0. 05、 0. 1、0. 2、0. 5 μ g。
【具体实施方式】
[0015] 实施例1 一种能结合霍乱肠毒素 B亚单位的单链DNA适配子的筛选
[0016] 米用SELEX技术，按下列步骤进行：
[0017] 1、ssDNA随机文库和引物的合成
[0018] 用于SELEX筛选的ssDNA文库总长度是8Int，其中两端为引物结合的固定序列，中 间35个核苷酸为随机序列。
[0019] 文库序列为：
[0020] 5 ' -CCATGCACTGGTAGTCTGTCGAAGT-(N35)-AGATAGCTGAATGTCCGCCTA-3 '。
[0021] 扩增文库的引物序列分别为：
[0022] 上游引物：5' -CCATGCACTGGTAGTCTGTCGAAGT-3' ；
[0023] 下游引物：5, -TAGGCGGACATTCAGCTATCT-3' ；
[0024] 生物素标上游引物：5' -Biotin-CCATGCACTGGTAGTCTGTCGAAGT-3'
[0025] 随机ssDNA文库和引物由宝生物工程（大连）有限公司合成，PAGE纯化。
[0026] 2、霍乱肠毒素 B亚单位适配子的SELEX筛选过程
[0027] (1)包被与封闭：将霍乱肠毒素 B亚单位（购自美国Sigma公司）用包被缓冲液 (0.05mol/L NaHCO3, pH9.6)溶解后，取一定量加入酶联微孔板的实验孔，4°C包被过夜，用 PBS-T缓冲液洗涤后，再用3%的BSA于37°C封闭2h。
[0028] (2) ssDNA随机文库的处理：在微孔板上平行设置空白对照孔，先用3%的BSA于 37°C封闭处理 2h。用结合缓冲液（20mmol/L Hepes，5mmol/L KCl，120mmol/L NaCL，lmmol/ LMgCl2, lmmol/L CaCl2, PH7. 35)溶解随机ssDNA库，加入到已用3% BSA封闭处理的空白 对照孔，37°C结合lh，目的是反筛去除与BSA结合的ssDNA。
[0029] (3) ssDNA结合：将经过反筛后的ssDNA加入到霍乱肠毒素蛋白包被的筛选孔,让 ssDNA与毒素蛋白在37°C孵育结合lh，同时也加入酵母tRNA (终浓度为10mg/ml)进行竞争 反应以提商特异性。
[0030] (4)洗涤：用冲洗缓冲液（结合缓冲液+0· 05% Tween20)洗3次，洗去未结合的 ssDNA〇
[0031] (5)洗脱和纯化：加入200 μ 1洗脱缓冲液（20mmol/L TrisHCl，4mol/L异硫氰酸 胍，lmmol/L DTT，pH8. 3)于80°C作用IOmin,洗脱下与霍乱肠毒素蛋白结合的ssDNA,经酚、 氯仿抽提，乙醇沉淀，将ssDNA溶解于TE缓冲液中。
[0032] (6)直接不对称PCR扩增筛选获得的阳性ssDNA :上游和下游引物的之间的 比例是 100 : 1。采用 25μ1 反应体系，其中 ddH2015.25yl，10XPCRBuffer2.5yl， dNTP(2.5mM)2.0y 1，上游引物（ΙΟΟμΜ)Ι.Ομ 1，下游引物（1μΜ)1·0μ 1，Taq DNA 聚合酶 (5υ/μ1)0·125μ1，ssDNA 3μ1。PCR 循环参数是：94°C 3min;(94°C 30S，60°C 30S，72°C 30S) X40 个循环；72°C 7min。
[0033] (7)PCR产物电泳切胶纯化：将所有PCR产物用3%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，切下 单链ssDNA的扩增条带，用柱式DNA胶回收试剂盒（北京天恩泽基因科技有限公司产品） 进行回收。回收获得的ssDNA用紫外分光光度计测定浓度，-20°C保存，留待下一轮筛选用。
[0034] (8)重复步骤（1)-(7)，筛选12轮，第12轮SELEX筛选获得ssDNA的电泳图如所 示。第 1 一 12 轮的毒素蛋白包被量（pmol)分别是：200、180、150、120、100、80、70、50、40、 30、20、10 ;ssDNA 文库的量（pmol)分别是：2000、1800、1500、1200、1000、1000、800、800、 500、500、500、500。通过逐渐提高筛选的严谨性，即减少毒素蛋白的使用量，增加文库与蛋 白的相对比例，以利于高亲和力的适配子从文库中筛选出来。测定每轮筛选获得的ssDNA 与霍乱肠毒素 B亚单位的结合率（采用实施例2所述方法）。当结合率无明显变化时停止筛 选，通过对称PCR扩增获得dsDNA，回收纯化后连接T载体，经蓝白斑筛选，随机挑选30个克 隆交英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序。序列测定结果用分子生物学软件DNAMAN6. 0 分析ssDNA寡核苷酸适配子的同源性及二级结构。
[0035] (9)根据亲和力高低及二级结构的能级，从克隆筛选获得的适配子中选出1条序 列做进一步的应用。其核苷酸序列为序列表SEQ ID No. 1所示，其二级结构图见图2。
[0036] 实施例2筛选的ssDNA文库与目的蛋白结合率的测定
[0037] (1)采用生物素标记的上游引物和普通下游引物进行不对称PCR扩增获得5'端标 记了生物素的ssDNA文库，电泳后切胶纯化，调节浓度至I. 5pmol/μ 1。
[0038] (2)用霍乱肠毒素 B亚单位蛋白包被96孔酶标板，每孔200ng，同时平行设置空白 对照孔。
[0039] (3) 95°C高温变性5min后，加入每轮的标记ssDNA文库到反应孔与毒素蛋白进行 结合反应，37 °C孵育2h，弃孔内液体。
[0040] (4)用洗涤缓冲液（PBS+0. 05 % Tween20, PBS-T，ρΗ7· 4)洗涤 3 次，每 次3min，然后加入新鲜配制的链霉亲合素-辣根过氧化物酶结合物（HRP-Iabeled Str印tavidin，l : 1000 稀释）200yl，37°C孵育 30min，PBS-T 洗涤 3 次，
[0041] (5)加入TMB (四甲基联苯胺）显色液100 μ L室温避光显色15min，再加入50 μ L 的0. 5Μ H2SCM终止反应，在15min内于酶标仪中测定450nm波长下的OD值。
[0042] (6)每轮筛选后ssDNA文库与目的蛋白霍乱肠毒素 B亚单位的结合率结果见表1。 表1
[0043]
【权利要求】
1. 一种特异结合霍乱肠毒素B亚单位的单链寡核苷酸适配子，其核苷酸序列如序列表 中 SEQ ID No. 1 所述。
2. 权利要求1所述核酸适配子在制备霍乱肠毒素检测试剂中的应用。
【文档编号】C12N15/115GK104388434SQ201410588833
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月28日 优先权日:2014年10月28日
【发明者】莫秋华, 谭华, 汪海波, 冯子力, 杨泽, 林继灿 申请人:珠海国际旅行卫生保健中心