专利名称：用于口服接种的冻干形式的具有改良的生物安全性特征的霍乱弧菌(Vibriocholerae)减毒株的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别地是获得霍乱弧菌(Vibrio cholerae)活减毒疫苗株，更具体地说是引入确定的突变来防止或限制这些活疫苗株重新获取CTXΦ噬菌体编码的基因和/或随后的传播，以及将其保藏用作疫苗的方法。
背景技术：
术语定义描述本发明时所使用术语的含义如下所述CTXΦ病毒指一些霍乱弧菌(Vibrio cholerae)菌株产生的蛋白质包被的DNA颗粒，其可以将包括霍乱毒素基因在内的其DNA转导给其它弧菌。
霍乱毒素(CT)指由细菌引起霍乱时，负责产生临床症状的蛋白质。
CTXΦ编码的毒素基因指除了CT基因外，还包括分别编码“紧密连接毒素(zonula occludens toxin)”及附属霍乱肠毒素(accessory cholera enterotoxin)的zot和ace基因。ZOT活性负责将上皮细胞基侧膜之间的紧密连接破坏掉，ACE蛋白具有附属于霍乱毒素活性的活性。
术语耐受性良好的疫苗或耐受性良好的菌株指缺失残余反应原性的菌株，这是大部分霍乱弧菌(Vibrio cholerae)非产毒株的特征。实际上该术语是指足够安全地在社区中使用，不需要或仅仅有限地需要在保健机构中使用，而不会对受接种者构成生命危险的菌株。应该可以预测受接种者的腹泻率是8％或以下，而且腹泻的特征是不会超过600ml(grs)，只有1％或更少的受接种者会有头痛，所述头痛轻微而历时较短(少于6小时)，最后它会使少于0.1％的受接种者发生呕吐，呕吐特征是单次呕吐500ml或更少。
血凝素蛋白酶(HA/P)指霍乱弧菌(Vibrio eholerae)所分泌的蛋白，其具有双重功能，功能之一是使某些种属的红细胞凝集，另一性质是降解或加工诸如粘蛋白和霍乱毒素之类的蛋白质。
celA指编码内切葡聚糖酶A合成的核苷酸序列。该蛋白天然存在于热解纤维梭菌(Clostridium thermocellum)菌株中，具有β(1-4)葡聚糖-葡聚糖水解酶活性，可以降解纤维素及其衍生物。
术语MSHA指霍乱弧菌(Vibrio cholerae)表面可以凝集不同种属红细胞的结构菌毛，其可以被甘露糖抑制。
VGJΦ介导的毒力逆转指先前通过抑制CTXΦ基因获得的减毒菌株通过完依赖于VGJΦ并由其介导的机制重新获得该噬菌体的所有基因并与其受体MSHA相互作用这一事件。
在VGJΦ介导的过程中传播CTXΦ噬菌体的可能性是丝状噬菌体VGJΦ通过与CTXΦ的DNA发生基因重组形成稳定的杂交结构(HybPΦ)并将其带活性基因的基因组传播给霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的其它菌株，后者可以是环境中非致病菌株、疫苗菌株或其它来自不同种属的菌株。
临床霍乱是一种急性腹泻疾病，由霍乱弧菌(Vibrio cholerae)经口感染引起。经过100多年对霍乱的研究后，仍需要针对该疾病有效和安全的疫苗。从1817年来，人类已有七次霍乱大流行，前六次由古典生物型菌株引起，而目前第七次流行的特征是El Tor生物型菌株为主。最近，从1991年1月开始，这次流行曼延到了南美，在秘鲁、厄瓜多尔和智利发生了25000多例霍乱并造成2000以上的患者死亡。到1992年11月，印度和孟加拉国出现了霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的新血清组O139，表明很有可能成为流行病并波及所有发展中国家。这些最近的经历增加了抗血清组O1(生物型El Tor)和O139霍乱弧菌(Vibrio cholerae)所致疾病的有效霍乱疫苗的需要。
因为霍乱康复后是持续至少三年的免疫状态，已在霍乱弧菌(Vibrio cholerae)疫苗学中做了很多工作以产生活减毒霍乱疫苗，口服给药后这种疫苗后，它近似地摸拟了在其免疫特性中的疾病，但不会导致服用者产生反应原性(腹泻、呕吐、发烧)。这类疫苗涉及CTXΦ所编码全部毒性基因的缺失突变。例如，抑制原噬菌体CTXΦ中编码霍乱毒素和其它毒素的基因是构造活疫苗侯选物期间的必需基因操作(参见分别于1991年和1995年公开的James B.Kaper的发明WO 91/18979及JohnMekalanos的发明WO 9518633)。
已提出将这类突变体用作单剂口服疫苗，尽管其已充分地减毒而且可以产生可靠的免疫反应(Kaper J.B.和Levine M.，专利US 06,472,276和581,406)。但是，这些突变体不能广泛应用的主要障碍是其在受接种者中产生了高水平的副作用(Levine和cols.，Infect.and Immun.56卷，第1期，1988)。
因此，获得足够程度的减毒是获得抗霍乱的活有效疫苗期间需要解决的主要问题。已经证明有至少三种活疫苗侯选物具有可接受水平的安全性，即足够程度的减毒和足够强的免疫原潜能。它们是霍乱弧菌(Vibrio cholerae)CVD103HgR(古典生物型，Inaba血清型)(Richie E.和cols，Vaccine 18，(2000)2399-2410.)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)Perú-15(El Tor生物型，Inaba血清型)(Cohen M.，和cols.(2002)Infection and Immunity，70卷，Not.4，p 1965-1970)以及霍乱弧菌(Vibrio cholerae)638(El tor生物型，Ogawa血清型)(Benitez J.A.和cols，(1999)，Infection andImmunity.Feb；67(2)539-45).
CVD103HgR菌株是已在全球数个国家注册的抗霍乱口服活疫苗的活性抗原组分，Perú-15和638菌株是不久将来在现场试验中评估的另两种活疫苗侯选物。
但是，这些减毒活疫苗侯选物还有另外的重要问题需要解决；问题之一是环境安全性，尤其是与通过遗传信息在细菌间水平转移的现有机制可能重新获得和传播霍乱毒素基因相关的安全性。与此一致，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)减毒疫苗菌株可能在来自其它弧菌的CTXΦ噬菌体感染事件中不受实验室条件控制而重新获得毒力基因(Waldor M.K.和J.J.Mekalanos，Science 2721910-1914)并促进其传播。当人们至少持续5天服用数千百万减毒细菌并保持在其粪便中流出相当数量细菌时，这一过程就变得相当重要了。一旦处于环境中，细菌就有可能从生态系统中相同或不同种属的其它细菌获得遗传物质。由于这些原因，目前需要获得的疫苗侯选物具有特定的特征来防止或限制CTXΦ，尤其是编码霍乱肠毒素的基因的获得及传播。这正是本发明的领域。
细菌病毒也称为噬菌体，具有在相同或不同种属的细菌之间转移基因的超常潜能。霍乱弧菌(Vibrio cholerae)中的CTXΦ噬菌体正是如此(Waldor M.K.和J.J.Mekalanos，1996，Science 2721910-1914)。CTXΦ是携带编码霍乱弧菌(Vibriocholerae)中霍乱毒素的基因并通过与来自于毒素共调节菌毛的IV型菌毛(称为TCP)相互作用进入细菌。TCP暴露于弧菌的外表面。根据公开的结果，在最佳实验室条件下CTXΦ噬菌体每毫升饱和相培养液的滴度可达含106颗粒或更少，这可以将其归类为中度增殖的噬菌体。同样，该噬菌体的TCP受体表达具有其产生的限制条件。尽管有这些限制，这一对噬菌体-受体的存从某种程度上限制了其被很好地接受为活霍乱疫苗，这是为什么使细菌失去进入该噬菌体的入口是理想的修饰。
理论上有两种方法防止CTXΦ进入霍乱弧菌(Vibrio cholerae)1)抑制TCP表达或2)去除参与噬菌体受体相互作用的TCP位点。由于TCP对于适当的人类肠定居及保护性免疫反应来说是必需的，这两种方法均不能实现。应该注意的是参与TCP-CTXΦ相互作用的位点对于定居过程也是必需的(Taylor R.2000.MolecularMicrobiology，(4)卷，896-910)。
已评估了数种抵抗病毒进入的策略，如防止噬菌体整合到细菌染色体及其稳定遗传，是抑制整合位点及失活recA基因以避免重组和整合到染色体的其它位点(Kenner和cols.1995.J.Infect.Dis.1721126-1129)。
同样，最近报道CTXΦ进入霍乱弧菌(Vibrio cholerae)依赖于TolQRA基因，但是此突变在霍乱疫苗侯选物中产生不想要的敏感表型，并且没有得到实现(Heilpern和Waldor.2000.J.Bact.1821739)。
未见报道防止携带有霍乱疫苗菌株或其它疫苗菌株必要毒力决定簇的噬菌体进入的其它方法。
本发明的主要目的涉及噬菌体VGJΦ及利用甘露糖敏感血凝素(MSHA)菌毛为受体，其转移编码霍乱毒素的基因的能力。具体地，它包括通过引入阻止这种菌毛正确功能的抑制突变或修饰，从而保护减毒活疫苗菌株不受VGJΦ感染。
从该菌毛的现有认知可以总结出下列方面。mshA的基因产物最初被描述为霍乱弧菌(Vibrio cholerae)表面中菌毛附器的主要亚单位，具有凝集不同种属的红细胞能力，甘露糖抑制这种能力(Jonson G和cols(1991).Microbial Pathogenesis11433-441)。同样，认为MSHA是细菌的毒力因子(Jonson G.和cols(1994).Molecular Microbiology 13109-118)。根据其性质的重要性，获取MSHA表达缺陷的突变体来研究其在毒力中可能的作用。已证明MSHA与TCP相反，并不是El Tor和O139霍乱弧菌(Vibrio cholerae)定居于人类小肠所必需(Thelin KH和Taylor RK(1996).Infection and Immunity 642853-2856)。MSHA也被描述为噬菌体493的受体(Jouravleva E.和cols(1998).Infection and Immunity，66卷，Not 6，2535-2539页)，表明该噬菌体可以参与O139弧菌的出现(Jouravleva E.和cols，(1998).Microbiology144315-324)。后来已经报道菌毛MSHA在生物表面和非生物表面上生物膜形成中起作用，从而有助于细菌在实验室及宿主外的存活(Chiavelli D.A.和cols，(2001).Appl.Environ Microbiol.Jul；67(7)3220-25；和Watnick P.I.和Kolter R.(1999).Mol.Microbiol.Nov，34(3)586-95)。从已有数据可以得知，已完成了数项与MSHA菌毛相关的研究，但这些研究没有一项研究确定此菌毛为可高效转导霍乱毒素基因的噬菌体受体，而且不仅仅是这些基因而是CTXΦ的整个基因组可显著地促进其传播。另外，尽管已做了大量研究，仍未发现与此菌毛作为毒力因子或介导CTXΦ传播的噬菌体受体相关的发明。
另一方面，在研制活霍乱疫苗的人们中提供冻干形式的该疫苗是普通应用。因此，服用调节胃内pH的抗酸溶液后才服用这些活细菌制品，然后细菌悬液继续向肠部推进而不会在胃内被破坏并在肠内定居。
冻干疫苗的精心制作改善了菌株的保藏，方便了剂量制备，允许长期贮藏，限制了污染的风险，并且更容易商业化和分发，不需要在发展中国家通常不具备的冷冻运输线。
尽管霍乱弧菌(Vibrio cholerae)被认为是对冻干过程非常敏感的微生物，已知一些添加剂可以增强菌株的存活力。因此，为了保藏疫苗菌株古典Inaba型CVD103HgR，美国马里兰大学的疫苗研发中心、来自伯尔尼的瑞士血清和疫苗研究院(ISSVB)研发了一种制剂，参见(Vaccine，8，577-580，1990，S.J.Cryz Jr，M.M.Levine，J.B.Kaper，E.Fürer和B)，其主要含有糖类和氨基酸。该制剂包含蔗糖、氨基酸和抗坏血酸，经过冷冻干燥处理后加入乳糖和天冬苯丙二肽酯。
在一项有关野生型古典Inaba 569B菌株冷冻干燥保藏的研究中，比较了不同添加剂对该霍乱弧菌(Vibrio cholerae)生存力以及冷冻干燥时及在不同温度下贮藏后最终外观的作用，该结果发表于Cryo-Letters，16，91-101(1995)，作者为Thin H.，T.Moreira，L.Luis，H.Garcia，T.K.Martino和A.Moreno。结果表明45℃时贮藏3天后生存力丧失少于1个对数级。
发明CU 22 847要求保护一种冻干方法，其中该制剂中除了含有细菌蛋白胨或酪蛋白水解物及山梨糖醇外，还含有纯化蛋白质或添加有聚合物及/或甘氨酸的脱脂乳的组合，其对不同血清组、生物型及血清型的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)菌株有着良好的生存力结果。冷冻干燥的细菌溶解于调节胃内pH的1.33％碳酸氢钠缓冲溶液后仍保有持其生存力。
任何欲在发展中国家使用的霍乱疫苗制品应满足一定的要求，如具有简单的组成，易于制备和操作，易于溶解而且溶解后具有良好的外观。此外，也期望不需低贮藏温度，并且至少在短期内耐受高的贮藏温度以及在容器偶尔存在氧和湿气。另外，也需要充分选择制剂的组成，使得可以保存不同血清组、生物型和血清型的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)。最后值得注意的是不含牛衍生成分的制剂可以使之符合因牛海绵状脑病综合征而使用牛组分的国际管理当局相关要求。
发明内容
本发明提出了免疫抗霍乱的新一代减毒活疫苗，所述疫苗改变了其性质，具体地是改善了其在人类定居期间及随后在室验室外环境中的生物学安全性。
本发明源自保护霍乱活疫苗不受含霍乱毒素基因的CTXΦ噬菌体感染以及损害从霍乱活疫苗侯选物开始的该噬菌体潜在传播的需要。具体地，本发明源自于本实验室中VGJΦ噬菌体的发现和鉴定。
VGJΦ是从霍乱弧菌(Vibrio cholerae)O139分离的丝状噬菌体，但是其具有感染O1霍乱弧菌(Vibrio cholerae)所有血清型及生物型以及霍乱弧菌(Vibriocholerae)O139其它菌株的能力。在霍乱弧菌(Vibrio cholerae)完整基因组序列中没有描述该噬菌体的序列，说明N16961菌株(O1，El Tor Inaba)中不存在该噬菌体。本实验室中大量霍乱弧菌(Vibrio cholerae)O1菌株清单中没有一株具有与VGJΦ同源的序列，而霍乱弧菌(Vibrio cholerae)O139的MO45、SG25-1和MDO12C菌株则具有同源序列。
VGJΦ噬菌体通过MSHA菌毛感染霍乱弧菌(Vibrio cholerae)。当该噬菌体进入细菌内时，其可进行复制或整合入特定的染色体区域。它是非常活跃的噬菌体，培养上清中可达1011颗粒/ml。
正如本发明下列应用所提出的，此噬菌体最重要的特征是其实施特异性转导CTXΦ噬菌体从而转导霍乱毒素基因的能力。这一过程通过CTXΦ和VGJΦ基因组之间的位点特异性重组，随后包装并将两个基因组均输出到VGJΦ衣壳中而发生。此杂交病毒颗粒命名为HybPΦ。同时受CTXΦ和VGJΦ感染的细菌培养产生了1011颗粒/ml VGJΦ和107-108颗粒/ml HybPΦ，至少比只用CTXΦ所得效价高100倍。
重要的是也应该理解，就本申请目的来说CTXΦ噬菌体的受体是表达需要特别条件的TCP，而VGJΦ的受体是MSHA菌毛，它是在所有研究表达条件下大量表达同时也在环境中产生的抗原。而且，其它弧菌产生的MSHA可增加传播风险甚至传播至其它细菌种属。
重要的是应当知道一旦新宿主受到HybPΦ感染，在饱和相可稳定产生107-108颗粒/ml的颗粒，因此该杂交噬菌体具有很强的传递和传播霍乱毒素基因的潜能。
就本申请目的来说，另一非常有趣的方面是HybPΦ中霍乱毒素基因足够活跃，以至于在体外培养期间产生50ng/ml毒素，用新生小鼠霍乱模型评估时受HybPΦ感染后减毒菌株返转成具有毒力的。
依据这些数据，本发明的主要目的是描述对活霍乱疫苗所作的另外突变以防止其受到VGJΦ或HybPΦ感染，以及在重新获得CTXΦ的情况下，使用缺失VGJΦ基因组的活霍乱疫苗以避免VGJΦ介导的CTXΦ传播的必要性。
这种突变的实例之一是导致MSHA菌毛在细胞表面表达缺失的稳定自发突变。这样VGJΦ或其衍生噬菌体HybPΦ不能感染这种疫苗。
这种突变的另一实例是该菌毛(MshA)主要蛋白质亚单位结构基因中的抑制突变。
尽管可使用其它公知的方法学将VGJΦ从受感染菌株去除，但是可简单地通过查找不同菌株间的DNA杂交来鉴定哪个不含与本发明所述VGJΦ片段同源的片段，从而实现缺失VGJΦ基因组的活霍乱疫苗侯选物的利用。
实施上述特定突变的活霍乱疫苗实例是不能与VGJΦ特异性探针反应，以及现有技术中已证明在志愿者研究中具有可接受水平反应原性的疫苗株。这些菌株的基因型包括留下残余RS1的CTXΦ噬菌体抑制突变和celA基因对hap基因的插入失活。可以通过抑制霍乱弧菌(Vibrio cholerae)流行病菌株中CTXΦ原噬菌体，然后在它们序列中插入标记基因celA来失活血凝素蛋白酶基因(hap)构建这些菌株。参见Robert的科学论文和cols.，Vaccine，14卷，16期，1517-22，1996；Benitez J.A.和cols的科学论文，(1999)，Infection and Immunity.Feb；67(2)539-45以及Campos和cols 1997年的发明申请WO9935271A3。具有这些特征及还具有营养缺陷型突变的的其它菌株也可用于获得具有本发明目标特征的菌株。
依据上文所述，本发明的主要目的是保护导致弧菌表面中MSHA菌毛缺失的抑制突变或自发突变的应用，并以此方式阻止活霍乱疫苗以杂交噬菌体NybPΦ感染的方式重新获得和传播霍乱毒素基因。
本发明优选包括现有生物型和血清型的任何活霍乱疫苗菌株或具有基因操作的另外出现血清型的任何不产毒菌株，所述基因操作抑制CTXΦ噬菌体的基因组、失活hap基因，可与任何其它突变组合，例如引入一些营养缺陷型(赖氨酸或甲硫氨酸)，同时也具有本发明所提出的特征。
本发明也优选包括使用可良好耐受的活霍乱疫苗作为递送系统将异源抗原呈递给粘膜免疫系统，通过在VGJΦ介导的事件中获得CTXΦ的不可能性和缺失VGJΦ而降低了散播CTXΦ的风险而改良了所述疫苗。
为获得MSHA菌毛表达中的这些突变体，我们使用了数种不属于本发明保护目标的分子生物学技术。
本发明也公开了保存和冻干这些菌株的方法，目的是制备活疫苗，该活疫苗冻干后能快速而充分重构，并且在1.33％碳酸氢钠溶液中重构时不影响其生存力。
本发明的目的还包括以充分筛选组分的方式使得冻干制品可以保证经过贮藏后活霍乱疫苗的生存力下降少于一个对数级，而不依赖于其具有何种血清组、血清型或生物型或是具有什么样的突变，即使是分开冻干它们或作为相同制品的组分混合它们。
加入的制剂组分包括乳糖(L)、蛋白胨(P)、酵母提取物(E)和山梨糖醇(S)。总浓度应不超过10％。
图1.VGJΦ噬菌体的显微照像。放大倍数×32000。从受感染霍乱弧菌(Vibriocholerae)569B上清纯化的VGJΦ噬菌体。
图2.杂交噬菌体HybPΦ-kn的基因组图，其具有很强的霍乱毒素传递潜能。
图3.用于抑制霍乱弧菌(Vibrio cholerae)疫苗侯选物的mshA基因的基因操作示意图及处理过程中所用自杀载体。
图4.用感染HybPΦ-Kn的减毒菌株及其衍生物接种的乳鼠生存图，其中所述减毒菌株已经恢复毒力。
具体实施例方式
实施例1VGJφ噬菌体的发现和特征VGJφ是在霍乱弧菌(Vibrio cholerae)SG25-1总DNA制品中发现的染色体外可遗传元件，SG25-1是于1993年在印度加尔各答分离的O139菌株并由Richard A.Finkelstein教授友情惠赠。简单的实验显示该元件具有可遗传性。携带该元件的供体菌株无细胞培养上清液在标准条件下如LB培养基(NaCl 10g/l、triptone 10g/l和酵母提取物5g/l)中生长，并且将与供体菌株中存在的遗传元件具有相同大小和限制性酶切图谱的遗传元件转移到不含任何染色体外元件的受体菌株。供体-受体之间无直接接触的传递这一性质在噬菌体中非常典型。
感染测定供体菌株长到600nm光密度为0.2，然后从培养液取一等份，用孔大小为0.22μm滤器过滤以去除细菌。取一等份滤液在LB板上培养并于37℃孵育过夜以确定滤液无菌。确认没有菌落形成单位后，用100μl无细胞上清液或系列稀释度感染20μl受体菌株新鲜培养物。混合物室温孵育20分钟并在固体或液体LB培养基中于37℃平铺过夜。受感染弧菌中VGJφ复制形式(FR)和单链DNA(ssDNA)的出现进一步证实了感染的发生。
VGJφ噬菌体的纯化从VGJφ感染的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)569B菌株(古典型，Inaba)培养物进行噬菌体颗粒的纯化。使用该菌株是因为其含有CTXφ缺陷的原噬菌体。细胞于8000×g离心10分钟。上清液用0.22μm的膜过滤。加入终浓度分别为3％和5％的NaCl和聚乙二醇6000使滤液中的噬菌体颗粒沉淀。混合物置冰中孵育30分钟，12000×g离心20分钟。弃上清，含噬菌体的沉淀悬浮于1ml磷酸缓冲盐溶液中。
VGJφ的鉴定沉淀的VGJφ颗粒保持了其感染569B菌株的能力而且4℃时，在PBS溶液中稳定至少6个月。
噬菌体颗粒纯化后，用酚-氯仿溶液将基因组DNA提取出来。对DNA进行分析发现其可耐受核糖核酸酶H的消化，表明基因组为DNA而不是RNA(数据未列出)；它也可以耐受不同限制性内切酶的处理但对绿豆和S1核酸酶处理敏感(数据未列出)，表明该噬菌体基因组含有ssDNA。吖啶橙(acrydine orange)存在下电泳分析显示的结果与前而结果类似。吖啶橙嵌入双链DNA(dsDNA)中是发绿色荧光，而嵌入ssDNA中时发橙色荧光。与预期的一致，基因组DNA发出橙色荧光说明其单链性质(数据未列出)，而受感染细胞中所观察的质粒DNA发出绿色荧光说明其含有dsDNA。
VGJφ基因组和细胞内复制形式之间的同一性以VGJφ基因组为探针进行Southern印迹分析，表明供体菌株SG25-1和受咸染菌株569B的染色体外元件之间的遗传同一性。这一结果证实了病毒基因组的ssDNA由胞质RF产生，同时也表明VGJφ是丝状噬菌休，其利用滚环复制机制产生基因组ssDNA，装配和在噬菌体颗粒中输出。
用限制性分析对从受感染菌株569B分离的RF作图。所得图谱显示噬菌体基因组大小(约7500b)及电泳限制性模式与以前报道的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)特异性丝状噬菌体不同。这些结果表明从SG25-1分离的噬菌体以前没有报道，将其命名为VGJφ。
VGJφ的效价滴定噬菌体悬液的操作与感染测定相同。但指示剂菌株细胞涂平板到固体LB板的软琼脂(0.4％)涂层上。将板于37℃孵育过夜，对观测到的不透明噬菌斑(感染集中点)计数。
该测定发现VGJφ感染的569B培养物每毫升培养物能产生高达3×1011个的噬菌体颗粒，与其它已报道的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)丝状噬菌体如CTXφ相比是非同寻常的高，通常这些噬菌体每毫升最多能产生106个颗粒。
电子显微镜检查用4％荧光素醋酸钠(uranile acetate)溶液(m/v)负染不同量的VGJφ颗粒，然后在透射电子显微镜JEM 200EX(JEOL，日本)中观察新制备的聚醋酸甲基乙烯酯(Formvar)栅格。观察结果证实噬菌体颗粒为丝状(图1)。
VGJ-Knφ的构建和滴定通过VGJφRF的唯一XbaI位点线性化它。将含R6K复制起点和来自pUC4K质粒的卡那霉素抗性盒的一个DNA片段插入VGJφ的XbaI位点。将此重组RF引入霍乱弧菌(Vibrio cholerae)569B中，并且噬菌体颗粒命名为VGJ-Knφ。
VGJ-Knφ感染的供体菌株569B培养到OD600＝2.0。通过0.2μm孔大小的滤器过滤等份培养液以去除细菌。取50ul等份滤液涂固体LB平板上并于37℃孵育过夜以证实无细胞的悬浮液无菌。用等份100μl无细胞噬菌体悬液或其稀释液感染20μl新制备的受体菌株培养液(约108个细胞)。混合物室温孵育20分钟以进行感染。随后将混合物涂平板到添加了卡那霉素(50ug/ml)的固体LB上，该平板于37℃孵育过夜。抗生素存在时可生长的菌落由于受标记噬菌体VGJ-Knφ感染而获得了Kn-抗性。通过纯化质粒DNA并进行限制性内切酶分析检查这些菌落中数个菌落的VGJ-knφ的RF存在。
此方法所完成的滴定测定与通过VGJφ对不透明噬菌斑测定所获得结果一致，表明VGJ-knφ感染的569B培养物每毫升培养物产生了约2×1011个VGJ-knφ噬菌体颗粒。
核苷酸序列VGJφ的核苷酸序列含7542个核苷酸，G+C含量为43.39％。鉴别了其编码的ORFs并与蛋白质数据库碱基比较。
VGJΦ的基因组构造与以前鉴定的丝状噬菌体类似，如大肠杆菌(E.coli)的Ff组噬菌体(M13、fd和f1)及霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的其它丝状噬菌体(CTXΦ、fs1、fs2和VSK)和副溶血弧菌(V.parahemolyticus)的其它丝状噬菌体(Vf12、Vf33和VfO3k6)。VGJΦ没有与Ff组噬菌体基因IV同源的基因，表明VGJΦ与CTXΦ噬菌体类似，可以利用宿主的孔蛋白(porine)来装配和输出其噬菌体颗粒。
VGJΦ的核苷酸序列说明VGJΦ是fs1和VSK噬菌体的近亲，共有高度同源的几个ORF，与VSK和fs1具有82.8％和77.8％的DNA同源性。但是，它们之间也存在高度不同的基因组区域和不共有的ORFs。此外，基因组大小不同，以前也没有报道fs1或VSK能转导霍乱毒素基因。
VGJΦ的核苷酸序列也表明存在与att序列同源的两个位点，已知att序列在整合丝状噬菌体中起作用。VGJΦ的这些位点有部分重叠并处于相反的方向。野油菜黄单胞菌(X.campestris)的噬菌体Cf1c、Cf16-v1和ΦLF，副溶血弧菌(V.parahemolyticus)的Vf33和VfO3k6，以及霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的VSK中也发现了这种排列。这些噬菌体中除Vf33和VSK外均通过这些噬菌体复制形式负链中的att位点整合入其宿主的染色体中。
实施例2.VGJΦ受体的鉴定丝状噬菌体通常使用IV型菌毛做为受体来感染其宿主。以前报道的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)特异性丝状噬菌体使用TCP或MSHA菌毛做为受体。因此，使用这些菌毛的两种El Tor菌株C6706突变体KHT52(ΔtcpA10)和KHT46(ΔmshA)来鉴别它们它们中任何一种是VGJΦ的受体。亲本菌株C6706及其TCP突变体KHT52对VGJΦ感染敏感，而MSHA突变体KHT46完全抗该噬菌体，这说明MSHA是VGJΦ的受体。菌株KHT46与质粒pJM132上携带的(来自亲本C6706的)野生型mshA结构基因互补回复了噬菌体敏感性，证实了MSHA是VGJΦ的受体。通过感染测定后分析受体菌株培养物中复制形式的存在与否来评估对VGJΦ的抗性或敏感性。
为了给出每种情况下转导的颗粒的滴度数值，使用前面所述的VGJΦ-kn感染测定，结果如下亲本菌株C6706及其衍生的TCP突变体KHT52对VGJΦ-Kn感染敏感，指示菌株显示了1011噬菌斑形成单位(PFU)的滴度，而MSHA突变体KHT46完全抗该噬菌体，用同样制备的VGJΦ-Kn感染后滴度小于5PFU/mL。菌株KHT46与野生型mhsA结构基因互补恢复了噬菌体敏感性。这些结果证实了阻止MSHA菌毛表达的突变赋予了对VJGΦ感染的抗性。
使用它们的卡那霉素抗体变异体进一步做了测定以比较HybPΦ和CTXΦ感染古典和El Tor菌株的能力。结果见表1。
如前所述，通过在CTXΦ复制形式唯一的限制性位点NotI中插入来自质粒pUC4K(Amersham Biosciences)的卡那霉素抗性盒获得CTXΦ-Kn噬菌体。
在用CTXΦ-Kn和VGJΦ-Kn共感染569b菌株无细胞培养上清液的感染测定期间获得HypPΦ噬菌体用于感染受体菌株KHT52。将携带卡那霉素抗性的该菌株细胞纯化，它们继续向上清液中继续产生出HybPΦ病毒颗粒，所述抗性最初由CTXΦ-Kn携带然后提供给HybPΦ。
用相同滴度(1～5×1011颗粒/mL)的CTXΦ-Kn及VGJΦ-Kn悬液感染受体菌株569B(古典)和C7258(El Tor)来检查在古典和El Tor弧菌中杂交噬菌体的感染效率。两种情况下，受体菌株均在CTXΦ受体TCP表达最佳条件下培养。按如下方法进行测定，将200μL纯噬菌体制备物与20μL受体菌株新鲜培养物(约108个细胞)于室温下，在20分钟期间混合，涂平板到添加有卡那霉素的固体LB培养基上并于室温孵育过夜。
基因组中携带Kn-抗性基因的菌落数是噬菌体感染的结果，表明每个噬菌体在常规实验室条件下感染不同菌株的能力。结果如表1所示。
表1.CTXφ-Kn和杂交噬菌体(HybPΦ-Kn)在569B和C7258中的滴定
如表1所示，杂交噬菌体比CTXΦ更有效的转导CT基因，所述CTXΦ是这些基因的常规载体。
这些结果指出了在霍乱弧菌(Vibrio cholerae)菌株中VGJΦ介导的CTXΦ传递的重要性，并且考虑到功能性受体MSHA在这些细菌菌株中的普遍性，所述结果强调了其关联性。
实施例3.CTXΦ的运动，其机制和毒力逆转用VGJΦ感染携带活性CTXΦ噬菌体的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)O1或O139菌株产生感染性颗粒，该颗粒的CTXΦ噬菌体基因组插入到VGJΦ的基因组中。这些杂交噬菌体颗粒命名为HybPΦ。用测定携带卡那霉素标记(HybPΦ-Kn)的杂交噬菌体的方法测定HybPΦ的滴度，测定时使用不同的菌株做指示菌株。所得滴度如表1所示。
从来源于569B(HybPΦ-Kn)菌株的制备物纯化HybPΦ-Kn，对单链测序以测定CTXΦ和VGJΦ之间的连接。
如图2表示共整合结构及两个序列中连接的核苷酸序列，这阐明了VGJΦ向其它霍乱弧菌(Vibrio cholerae)转导CTXΦ的机制。HybPΦ-Kn使用与VGJΦ相同的受体即MSHA进入霍乱弧菌(Vibrio cholerae)。
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)1333菌株是现有技术报道过的减毒克隆，与用于获得本发明衍生物的菌株类似。该菌株是致病C6706菌株的衍生物。如图4所示，乳鼠接种105个菌落形成单位的菌株1333没有致死效应，即使菌株在随后的15天中一直定居也没有致死效应。进行几个试验来测定其毒力，证实了HybPΦ-Kn感染对毒力逆转的作用。105个菌落形成单位剂量的菌株1333没有致死效应，而C6706和1333(HybPΦ-Kn)菌株具有非常类似的致死模式，接种的小鼠存活时间不超过第5天(图4)。
实施例4.VGJΦ受体，MSHA菌毛在不同培养条件下的组成型表达将霍乱弧菌(Vibrio cholerae)C7258、C6706和CA401菌株的MSHA菌毛主要亚单位在不同培养基中培养来研究MshA的表达。所用培养基为LB pH 6.5(NaCl，10g/l；细菌triptone(bacteriological triptone)，10g/l；酵母提取物，5g/l)、AKI(细菌蛋白胨，15g/l；酵母提取物，4g/l；NaCl，0.5g/l；NaHCO3，3g/l)、TSB(酷蛋白胰消化物，17g/l；大豆种子木瓜蛋白酶消化物，3.0g/l；NaCl，5g/l；二碱式磷酸钾，2.5g/l；葡萄糖，2.5g/l)、Dulbecco′s(葡萄糖，4.5g/l；HEPES，25mm；吡哆醇，HCl，NaHCO3)，无蛋白杂交瘤培养基(不含血清和蛋白的合成制剂，添加有NaHCO3，2.2g/l；谷氨酰胺，5mg/l；酚红，20g/l)和Syncase(NaH2PO4，5g/l；KH2PO4，5g/l；酪蛋白氨基酸，10g/l；蔗糖，5g/l和NH4Cl，1.18g/l)。所有情况下，将一个菌落接种于50ml培养肉汤中，并于37℃在旋转振荡器中培养16小时，但AKI的条件不同，使用AKI时菌株先于30℃静止培养4个小时，然后于37℃在旋转振荡器中培养16小时。在每种情况下，均通过离心来收获细菌生物量并用于制备细胞裂解液。采用单克隆抗体2F12F1对mshA进行免疫检测，通过Western印迹分析等量细胞裂解液。使用MSHA突变菌株KHT46为试验的阴性对照。除了阴性对照菌株KHT46外，所有研究的菌株均在所有测试培养条件下都显示了产生MshA的能力。同样，在前述条件下培养的所述菌株在相同滴度或者等于或高于1∶16滴度，能凝集鸡红细胞(甘露糖敏感)，并可被VGJΦ-Kn有效地感染，显示了高于1010颗粒/ml培养物的滴度。
实施例5.获得MSHA表达缺陷的自发突变体及评估其对感染的抗性来源于于霍乱弧菌(Vibrio cholerae)C6706(O1，The Tor，Inaba)的KHT46菌株，MSHA抑制突变体显示了对VGJΦ、VGJΦ-Kn和杂交噬菌体HybPΦ感染的耐受状态。但是，它是致病菌株，这不是本发明申请作者的财产，也不是提供它的法人古巴哈瓦那市国家科学研究中心的财产。
使用霍乱毒素基因的抑制突变体来获得本发明表面MSHA表达缺陷的自发突变体，其中在获得所述自发突变体的期间，所述抑制突变体影响了它们装配细胞表面中MSHA的能力。这些突变体虽然可以产生MSHA的结构亚基，但不在其表面进行装配，所以不具有甘露糖敏感性血细胞凝集的可检测滴度，在竞争性ELISA中也不会吸附抗MSHA的特异性单克隆抗体的活性。由于该表型特别稳定，按Campos等的专利WO 99/35271“V.cholerae v accine candidates and the methods of theirconstructing”及Robert′s的论文(Vaccine，14卷，16期，1517-22，1996)所述方法对这些突变体进行基因操作以在血凝素蛋白本酶基因中引入插入突变。所得突变体命名为JCG01和JCG02，均属于O1血清组、El Tor生物型和Ogawa血清型。
JCG01和JCG02对VGJΦ噬菌体变体VGJΦ-Kn噬菌体的感染显示了耐受性，VGJΦ-Kn噬菌体携带有卡那霉素抗性标记。具有证明的滴度1011单位/ml的VGJΦ-Kn悬液不能感染所述菌株(检测不到滴度，低于5单位/ml)。除了在依赖于MSHA的血细胞凝集中总的损害外，这种对VGJΦ-Kn感染的耐受性状态对应于相对于它们亲本(1∶32)的JCG01和JCG02菌株中非常低的滴度(1∶2)。同样，这些突变体的整个细胞在竞争性ELISA中不能抑制抗MSHA单克隆抗体(2F12F1)与固定于固相上的MshA的相互作用。但是，依据免疫印迹试验看，两个菌株均产生了主要结构亚基MshA，表明该蛋白虽然已产生了但并没有在细胞表面正确地装配。这些突变体可以证明本发明的理念并可以通过它们获取抑制突变体。
从其它霍乱疫苗侯选物开始获得mshA基因的抑制突变体用聚合酶链反应，利用下面的寡核苷酸CNC-8125，ATG ATC GTG AAG TCGACT ATG(21mer)；CNC-8126 CAG CAA CCG AGA ATT HERE ATC ACC ACG(27mer)；CNC-8127，ATT CTC GGT TGC TGG AAC TGC TTG TG(26mer)；和CNC-8128，GCT CTA GAG TAT TCA CGG TAT TCG(24mer)扩增mshA结构基因每个侧翼约1200bp碱基对的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)N16961基因组两个片段获得mshA结构基因抑制突变体。独立地克隆扩增的片段并在体外装配以产生pΔmshA克隆。该克隆含有片段的顺序和方向与细菌染色体中的片段相同，只是mshA基因的编码区已经从序列内部被抑制了。携带抑制的片段从前面的质粒以Sal I/Xba I片段在自杀载体pCVD442中进行亚克隆以获得质粒pSΔmshA。
pSΔmshA质粒用于以传统的等位基因置换方法来抑制霍乱弧菌(Vibriocholerae)疫苗菌株中染色体mshA基因。为此，将pSΔmshA导入大肠杆菌(E.coli)SM10λpir菌株中并以细菌接合的方式向霍乱弧菌(Vibrio cholerae)迁移。所得克隆在添加有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基板上进行氨苄青霉素抗生素抗性筛选。由于通过染色体mshA基因的一个侧翼片段与质粒pSΔmshA的一个侧翼片段之间进行同源重组，起始了两者之间的共整合的方法，质粒整合在受体弧菌的染色体中，这些克隆大部分都生长出来了。Sothern印迹试验验证了这一事件，其中用限制性酶Sma I消化10个克隆的总DNA并与从质粒pSΔmshA获得的探针(Sal I/Xba插入片段)进行杂交。我们感兴趣的克隆是那些产生21000碱基对条带的克隆。本试验中亲本菌株的类似对照产生了13000碱基对条带。立即将足量的克隆保藏于-70℃LB甘油中。然后取其中3个克隆在不含抗生素选择压力的条件下培养，以便使消除基因复制的同源重组事件得以发生。可以通过抑制原始基因结构(完整mshA基因)并用质粒中存在的突变拷贝(抑制mshA基因)置换来完成，如图3所示。用Southern印迹分析突变基因置换了完整基因的克隆，并以12000碱基对条带的出现来进行鉴别。最后，筛选mshA基因被抑制的克隆并作为疫苗侯选物适当地保藏(冷冻于-80℃添加有20％甘油的LB中)。对构建了mshA抑制突变体的各克隆进行此操作。
血清学鉴定在此文献所述的疫苗菌株中导入各个突变后，检查每种衍生物对应于原始血清型的脂多糖的正确表达。为此，从新鲜培养板收集细胞，重悬于盐水(NaCl，0.9％)中并立即用Ogawa、Inaba或O139弧菌特异性的合适凝集反应血清进行检验。
抗霍乱疫苗产生的主要免疫应答抗LPS，因此用与特异性抗血清的凝集反应证实对应于本发明中各个菌株的抗原表达。
乳鼠中定居测定用乳鼠中定居测定(Herrington等，J.Exper.Med.1681487-1492，1988)来测定各菌株的定居能力。通过口胃途径将105-106接种量弧菌以50ul的体积施用给至少5只乳鼠的各组动物。18-24小时后于30℃将小鼠处死，取出肠并进行匀浆，将稀释液涂平板于突变体生长的适合培养基中。
表2.本发明疫苗菌株的定居能力
所有菌株均显示有充分的定居能力以用作活疫苗侯选物。需要定居以产生强免疫学应答，因为细菌的繁殖增加了与粘膜免疫系统相互作用的持续时间。这种情况下，尽管没有霍乱的完美模型，乳鼠给出了随后各菌株在人类中定居的充足的途径。
运动性测定良好分离菌落的细胞加载在接种环的顶端，该接种环起始于主培养板并朝向活力检测的培养板(LB，0.4％琼脂)，将环的尖端插入琼脂深2～3mm。孵育24小时后测定30℃时各菌落的扩散直径。距接种点的直径达3mm或更小的细菌菌株可认为是非运动型的。细菌生长的直径超过3mm时可认为是有自动力的。结果表明本发明包括的菌株均是运动型的。
实施例6.筛选和构建疫苗侯选物的方法，该疫苗侯选物用作本发明所公开的方法修饰的起始菌株筛选我们库中的五株致病菌作为起始微生物，因为其不能与VGJΦ序列杂交。这些菌株是霍乱弧菌(Vibrio cholerae)C7258(O1，El Tor，Ogawa，Perú，1991)、C6706(O1，El Tor，Inaba，Perú，1991)、CRC266(O139，La India，1999)、CA385(Clásico，Ogaw)和CA401(Clásico，Inaba)。
本实施例中公开的方法不是本发明的目的。它们更构成了用于获得减毒菌株的方法的详细描述，所述减毒菌株构成了本发明中所要求保护的突变体。这些突变体的特征是它们耐受VGJΦ和杂交VGJΦ∷CTXΦ的感染，所述杂交VGJΦ∷CTXΦ从实施例4和5所述方法获得。
下面我们描述在所述突变适于用本发明的方法修饰前，用于以等位基因置换的方法向霍乱弧菌(Vibrio cholerae)中引入不同组突变的自杀质粒。读者应注意到本发明要求保护的菌株除了损害MSHA菌毛正确表达的突变外，还有(a)霍乱肠毒素基因或整个CTXΦ噬菌体的缺失突变及(b)被热解纤维梭菌(Clostridiumthermocellum)内切葡聚糖酶A基因中断的血凝素蛋白酶基因。它们还可以有可选地基因(c)lysA、(d)metF、(e)VC0934(编码糖基转移酶)和(f)thyA中的突变。
(a)为了通过灭活霍乱肠毒素基因或使CTXΦ原噬菌体缺失来构建不产毒的菌株，使用了自杀质粒pJAF(Benitez y cols，1996，Archives ofMedical Research，27卷，3期，275-283页)。该质粒从pBB6质粒获得(Baudry y cols，1991，Infection and Immunity60428)，pBB6含有来自霍乱弧菌(Vibrio cholerae)569B的插入片段，其编码ace、zot、ctxA和ctxB。由于缺失古典弧菌中ctxAB操纵子的3’端RS1序列，该质粒中ctxAB拷贝下游的EcoR I位点位于未确定功能的侧翼DNA。通过缺失ScaI内部片段对pBB6质粒进行修饰从而产生pBSCT5质粒，其含有失去zot和ctxA功能基因的重组区域。然后插入EcoRI接头使pBSCT5的PstI突变成EcoRI，得到pBSCT64，将所得EcoRI片段亚克隆入pGP704的EcoRI位点从而得到pAJF。
(b)为了构建HA/P表达受影响的菌株，使用了自杀质粒pGPH6。该质粒通过不同的步骤构建。首先将含hap基因的质粒pCH2(Hase y Finkelstein，1991，J.Bacteriology 1733311-3317)在位于hap编码序列中的StuI位点线性化，所述hap基因位于来自霍乱弧菌(Vibrio cholerae)3083的3.2kb HindIII片段中。将含celA基因的3.2kb HindIII片段从pCT104质粒(Cornet y cols，1983，Biotechnology 1589-594)切除并亚克隆入pCH2的StuI位点，得到pAHC3。将含pAHC3的插入片段以HindIII片段亚克隆到pUC19衍生物从而得到pIJHCI，该pUC19衍生物具有位于BglII位点侧翼的多克隆位点，其中所述pAHC3含有被celA基因插入失活的hap基因。将该质粒的BglII片段亚克隆入pGP704从而产生pGPH6，其含有带遗传性hap∷celA结构的6.4kb片段，hap基因没有功能。
(c)和(d)构建lysA或metF基因突变体时，使用自杀质粒pCVlysAΔ1或pCVMΔClaI。为了构建这些质粒，从霍乱弧菌(Vibrio cholerae)C7258 PCR扩增lysA和metF基因，各基因使用一对寡核苷酸。寡核苷酸购自Centro de IngenieríaGenética和Biotecnología，Ciudad de La Habana，古巴。引物的核苷酸序列为(lysA)(P6488)5′-GTA AAT CAC GCT ACT AAG-3′和(P 6487)5′-AGA AAA ATG GAAATGC-3′和(metF)(P 5872)5′-AGA GCA TGC GGC ATG GC-3′和(P 5873)5′-ATACTG CAG CTC GTC GAA ATG GCG-3′。将扩增子克隆入质粒pGEMT(Promega)和pIJ2925(Janssen和cols，1993，Gene 124133-134)，从而获得重组质粒pGlysA3和pMF29，其分别含有lysA和metF基因的活性拷贝。用核苷酸测序来鉴定各基因。
体外将克隆的metF和lysA基因中ClaI(246碱基对)和PstI/AccI(106碱基对)内部片段缺失，使之突变。最后的情况下，设计的策略是保留产生失活基因产物的开放阅读框以避免在霍乱弧菌(Vibrio cholerae)lysA突变体的构建时或构建后产生极性效应。将各失活的基因以BglII片段克隆入自杀载体pCVD442中，随后导入目标霍乱疫苗侯选物中。含lysA等位基因的自杀质粒命名为pCVlysAΔ1，含metF等位基因的自杀质粒则命名为pCVMΔClaI。
(e)构建VC0934基因突变体时，我们构建并使用自杀质粒pCVDΔ34。此时，以来自菌株N16961的总DNA为模板进行PCR扩增VC0934基因，所用引物为5′-GCA TGC GTC TAG TGA TGA AGG-3′和5′-TCT AGA CTG TCT TAA TAC GC-3′。将扩增子克隆入质粒pGEM5Zf T载体中，得到质粒pGEM34；用限制性内切酶NarI/BglII在VC0934编码序列中缺失270个碱基对。用klenow酶补平末端后，质粒重新成环，从而得到pG34。所得失活的基因亚克隆入用SalI和SphI消化的自杀载体pCVD442中，得到质粒pCVΔ34。该质粒用于制备野生型基因的等位基因置换。
(f)构建thyA表达缺陷的突变体时，构建并使用pEST自杀质粒。构建该质粒步骤包括将来自霍乱弧菌(Vibrio cholerae)C7258的thyA基因以EcoRI-HindIII染色体DNA片段克隆入pBR322中，得到pVT1(Valle和cols，2000，Infection andImmunity 68，11期，6411-6418页)。从该质粒位于BglII和MluI位点间的thyA基因缺失300碱基对的内部片段，得到pVMT1。该缺失去除了编码蛋白Thimidilate合酶中第7～105个氨基酸的DNA片段。将所突变的thyA基因以EcoRI-HindIII切割出来，将末端平端化然后以和β-半乳糖苷酶基因相同的方向克隆入pUC19的SmaI位点，得到pVT9。所得基因以SacI片段从pVT9亚克隆入pCVD442，所得质粒命名为pEST。该最终构建体用于制备目标菌株中野生型基因的等位基因置换。
所述的自杀载体是模式系统，可用于将长期(secuencial)突变导入霍乱弧菌(Vibrio cholerae)疫苗侯选物中。
这些载体所编码基因的等位基因置换按下述步骤操作第一步，含上述所选等位基因的自杀载体通过接合从大肠杆菌(E.coli)供体SM10λpir转移到霍乱弧菌(Vibrio cholerae)受体，后者是所计划修饰的个体。此步骤完成后产生了抗氨苄青霉素的共整合体。因此该接合事件所得克隆在添加氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板中筛选。
此第一阶段的操作方法如下用目的自杀载体转化的供体菌株SM10λpir在添加氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板(NaCl，10g/l；细菌triptone，10g/l，及酵母提取物，5g/l)中培养，而受体菌株，即需要修饰的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)菌株则在LB平板中培养。培养条件为37℃过夜。将一个供体菌落和一个受体菌落以划线方式接种到新的LB平板中。先将供体菌株以一个方向划线，然后受体菌株(霍乱弧菌(Vibrio cholerae))以相对的方向划线。这种垂直而重叠的划线可以保证培养时两菌株紧密接触。接下来将平板于37℃孵育12小时，用5ml NaCl(0.9％)收集并取200μl的102、103、104和105稀释液分散到LB-氨苄青霉素-多粘菌素B平板中，筛选自杀质粒转化了的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)克隆和反筛选供体菌株大肠杆菌SM10λpir。每次处理所得的克隆取10个冻存于-80℃的LB-甘油(20％)中，用于第二步分析。
第二步，用对进行突变过程目的基因特异性的探针进行Southern印迹杂交，目的是检测前一步所保存克隆中正确共整合体的结构。自杀质粒以同源重组方式整合入正确靶点的克隆用特殊染色体结构的存在来鉴别。该结构含有一拷贝野生型基因和一拷贝突变等位基因，两者只被质粒载体序列分开。这一特别结构在具有鉴定其的特异性探针的Southern印迹中产生了特异性杂交模式。将合适的克隆冻存于-80℃的LB甘油中。
第二步包括下列步骤首先，按照常规方法(Ausubel和cols，Short protocols inMolecular Biology，第三版，1992，2.4单元，2-11页，basic protocol)将第一步所得各个克隆的总DNA分离出来。从祖菌株分离出来的总DNA作为对照。然后用合适的限制性酶消化10个克隆的总DNA，这一点会在下文述及。取各个克隆、母菌株的1μgDNA进行消化，然后在琼脂糖凝胶的平行泳道中电泳。在碱性条件下将凝胶的DNA内含物印迹到膜内(Ausubel和cols，Short protocols in Molecular Biology，第三版，1992，2.9A单元，2-30页，alternate protocol 1)。
将印迹于80℃孵育15分钟进行固定。然后通过预杂交将膜内的游离位点封闭，随后用各个突变的特异性探针进行探测。
下面是依据靶基因，鉴别各个克隆共整合体期望结构的限制性酶、探针(通过随机引物方法用地高辛配基标记)及杂交片段大小的详细情况a)对于CTXΦ噬菌体基因的抑制突变体来说，各克隆的总DNA用限制性酶HindIII消化，置于膜中后立即与得自pBB6质粒PstI-EcoRI片段的探针杂交。，目的克隆是那些具有在Southern印迹中产生两个条带的基因结构的克隆，所述条带一条为10000碱基对，另一条为7000碱基对。作为对照的亲本菌株在相同Southern印迹试验中产生17000碱基对的单一条带。
b)对于hap基因的抑制突变体来说，各克隆的总DNA用限制性酶Xho I消化，置于膜中后立即与获自pCH2质粒中3200碱基对Hind III片段的探针杂交。目的克隆是那些具有在Southern印迹中产生单个16000碱基对条带的基因结构的克隆。作为对照的亲本菌株在相同的Southern印迹试验中产生6000碱基对的单一条带。
c)对于lysA基因的抑制突变体来说，各克隆的总DNA用限制性酶Xho I消化，置于膜中后立即与获自pCVΔlysA1质粒中Sph I/Sma I片段的探针杂交，该质粒含突变lysA基因。目的克隆是那些具有在Southern印迹中产生单个12 500碱基对条带的基因结构的克隆。作为对照的亲本菌株在相同的Southern印迹试验中产生5 200碱基对的单一条带。
d)对于metF基因的抑制突变体来说，各克隆的总DNA用限制性酶Nco I消化，置于膜中后立即与获自pCVMΔlaI质粒中BglII片段探针杂交，该质粒含突变metF基因。目标克隆是那些具有在Southern印迹中产生单个12000碱基对条带的基因结构的克隆。作为对照的亲本菌株在相同的Southern印迹试验中产生5000碱基对的单一条带。
e)对于VC0934基因的抑制突变体来说，各克隆的总DNA用限制性酶Ava I消化，置于膜中后立即与获自pCVDΔ34质粒中Sal I/Sph I片段的探针杂交，该质粒含突变VC0934基因。目的克隆是那些具有在Southern印迹中产生两个条带的基因结构的克隆，所述条带一条为1600或1900碱基对，另一条为8200或7900碱基对。作为对照的亲本菌株在相同的Southern印迹试验中产生3500碱基对的单一条带。
f)对于thyA基因的抑制突变体来说，各克隆的总DNA用限制性酶Bstx I消化，置于膜中后立即与获自pEST1质粒中Sac I片段的探针杂交，该质粒含突变thyA基因。目的克隆是那些具有在Southern印迹中产生单个9 600碱基对条带的基因结构的克隆。作为对照的亲本菌株在相同的Southern印迹试验中产生2400碱基对的单一条带。
第三步，取3个携带了前面结构之一共整合体的目的克隆在没有抗生素选择压力的条件下培养，以便通过同源重组及所得克隆扩增的方式让自杀性载体丢失。在所述克隆中，自杀性载体的丢失伴随着该细菌遗传天赋中突变型或野生型的两个拷贝基因中的一个拷贝丢失。
第四步，将前述培养物的稀释度在平板中扩大以获取分开的菌落，将其复制到添加了氨苄青霉素的平板中评估哪些克隆对氨苄青霉素敏感。将所述对氨苄青霉素敏感的克隆如前所述冻存。
第五步，通过用对目的基因(a、b、c、d和f中所述)中各个基因特异的探针进行Southern印迹研究来验证目的等位基因突变拷贝保留在染色体中的克隆。这些目的克隆扩大产生一个工作库并实施其后来的鉴定，和引入本发明申请中保护目的的修饰。
下面我们按修饰目的的各个基因，详细描述鉴别各个突变体中期望结构所用到的限制性酶、探针和杂交片段的大小a)分析CTXΦ原噬菌体中的突变体时，总DNA用限制性内切核酸酶Hind III消化。当置于膜中后立即与来源于pBB6质粒Pst I-EcoR I片段的探针杂交。Southern印迹中不出现杂交条带的那些克隆就是目的克隆。
b)分析失活的hap等位基因突变体时，总DNA用限制性酶Xho I消化，当置于膜中后立即与来源于pCH2质粒中编码hap基因的3200碱基对Hind III片段的探针杂交。Southern印迹中出现单个约9000核苷酸碱基对条带的那些克隆就是目的克隆。
c)分析lysA基因突变体时，总DNA用限制性酶Xho I消化，当置于膜中后立即与来源于pCVΔlysA质粒中分离的Sph I/Sma I片段的探针杂交，所述pCVΔlysA质粒含lysA突变基因。Southern印迹中基因结构可产生单个约5000碱基对条带的那些克隆就是目的克隆。
d)分析metF基因突变体时，总DNA用限制性酶Nco I消化，当置于膜中后立即与来源于pCVMΔClaI质粒中所包含的BglII片段的探针杂交，所述pCVMΔClaI质粒含metF突变基因。Southern印迹中基因结构可产生单个约4 700碱基对条带的那些克隆就是目的克隆。
e)分析VC0934基因突变体时，总DNA用限制性酶Ava I消化，当置于膜中后立即与获自pCVDΔ34质粒中Sal I/Sph I片段的探针杂交，所述pCVDΔ34质粒含体外获得的VC0934突变基因。Southern印迹中基因结构可产生单个约3 200碱基对条带的那些克隆就是目的克隆。
f)分析thyA基因突变体时，总DNA用限制性酶Bstx I消化；印迹与获自pEST1质粒Sac I片段的探针杂交，所述pEST1质粒含thyA基因。Southern印迹中基因结构可产生单个约2 100碱基对条带的那些克隆就是目的克隆。
实施例7.用冻干方法保藏疫苗菌株的方法下面的实施例中，微生物于37℃在LB肉汤中培养，同时以150rpm和250rpm进行轨道式振摇，直到对数生长期。于4℃以5000和8000rpm转速离心10-20分钟收获细胞，然后与具有良好保护微生物性质的成分混合，使细胞浓度为108～109细胞/ml。每个10R型培养瓶分配2ml。冻干循环包括将材料深度冷冻，于-30℃和-39℃之间保持每种产物进行8-12小时进行初级干燥，以及于18℃和25℃温度之间进行不超过12小时的次级干燥。生存力丧失定义为冻干前后或冻干材料贮藏前后的CFU/mL的对数差异，其中所述冻干物质通常溶于1.33％碳酸氢钠溶液。
制剂L+E+SBLR01、JCG03和ESP05菌株通过前述冻干方法，在制剂类型L(5.0％)、E(2.0％)和S(2.0％)中加工。冷冻的温度为-60℃。初级干燥时产品温度在-32℃保持10小时，次级干燥时温度在22℃保持12小时。冻干物质在1.33％碳酸氢钠溶液是速溶的。溶解后立即计算生存力损失，相对于冻干前活细胞的浓度来说，BLR01、JCG03和ESP05的损失分别为0.30、0.43和0.60个对数数量级。
L+P+S及L+E+S制剂与脱脂乳+蛋白胨+山梨糖醇制剂的对比菌株JCG03用两种制剂冻干一种类型为L(6.0％)、P(2.0％)和S(2.0％)，另一种类型为L(5.5％)、E(1.8％)和S(1.6％)。该菌株也在6.0％脱脂乳、2.0％蛋白胨和2.0％山梨糖醇制剂中作为对照制剂进行冻干。冷冻于-60℃完成。初级干燥时产品温度在-33℃保持12小时，次级干燥时温度在20℃保持14小时。制剂L+P+S或L+E+S的冻干物质在1.33％碳酸氢钠溶液是速溶的，而对照制剂的冻干物质稍微慢一点。溶解后立即计算生存力损失，相对于冻干前活细胞的浓度，L+P+S、L+E+S和对照制剂的损失非常类似，分别为0.48、0.52和0.55对数级。
湿度和氧气的影响菌株JCG03用前面一段所述三种制剂冻干，冻干后立即暴露于同时作用的湿度和氧气中。这一点这样实现在相对湿度为11％(由氯化锂饱和溶液产生)的条件下，样品在无菌玻璃干燥器空气中于25℃保持3天。L+P+S、L+E+S和对照制剂的生存力损失分别为1.61、1.10和3.43对数级，说明本发明的目的制剂能比对照制剂保证更大地湿度和氧气保护。
贮藏温度的影响菌株TLP01、JCG01和ESP05用L(5.5％)、E(2.0％)、S(2.0％)型制剂冻干。冷冻于-58℃完成。初级干燥时产品温度在-30℃保持12小时，次级干燥时温度在20℃保持14小时。冻干物质在1.33％碳酸氢钠溶液是速溶的。溶解后立即计算生存力损失，相对于冻干前活细胞的浓度，TLP01、JCG01和ESP05的损失分别为0.43、0.55和0.44个对数级。冻干物质于8℃或-20℃贮藏1年。表3为所获得的生存力丧失结果。
表3.生存力损失(贮藏1年)
实施例8.本发明的菌株及其特征本发明的菌株已保藏于比利时微生物协调保藏中心(BCCM)/根茨大学微生物实验室(Laboratorium voor Microbiologie-Bacterienverzameling(LMG))霍乱弧菌(Vibrio cholerae)JCG01(LMG P-22149)霍乱弧菌(Vibrio cholerae)JCG02(LMG P-22150)霍乱弧菌(Vibrio cholerae)JCG03(LMG P-22151)霍乱弧菌(Vibrio cholerae)KMD01(LMG P-22153)
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)KMD02(LMG P-22154)霍乱弧菌(Vibrio cholerae)KMD03(LMG P-22155)霍乱弧菌(Vibrio cholerae)JCG04(LMG P-22152)霍乱弧菌(Vibrio cholerae)ESP01(LMG P-22156)霍乱弧菌(Vibrio cholerae)ESP02(LMG P-22157)霍乱弧菌(Vibrio cholerae)ESP03(LMG P-22158)霍乱弧菌(Vibrio cholerae)RAF01(LMG P-22159)霍乱弧菌(Vibrio cholerae)TLP01(LMG P-22160)霍乱弧菌(Vibrio cholerae)TLP02(LMG P-22161)以及霍乱弧菌(Vibrio cholerae)TLP03(LMG P-22162)它们如表4所述。
表4.本发明的菌株
本发明优点本发明提供了一种使活霍乱疫苗侯选物不能通过VGJΦ噬菌体介导从CTXΦ噬菌体重新获得霍乱毒素基因和它毒素，因此不能通过该机制发生毒力逆转的方法。
同时还提供了确保活霍乱疫苗侯选物万一因VGJΦ噬菌体的特殊转导后重新获得CTXΦ而不会传播CTXΦ所所需的信息。
本发明提供了MSHA突变体作为活霍乱疫苗侯选物的用途，由于抗VGJΦ介导的CTXΦ感染，其显示了增加的环境安全性。
本发明在活霍疫苗侯选物的设计和构建时提供了一种新的特性来改善其环境安全性，也就是说这些疫苗万一重新获得CTXΦ也不能传播通过VGJΦ介导的CTXΦ基因。
上述特性可以应用于已经制备的活霍乱疫苗侯选物以减少其对环境潜在的影响，其中在志愿者研究中所述疫苗已表现出可接受的反应原性。
本发明也提供了保藏所有上述提及的活霍乱疫苗侯选物冻干的制剂，并改善其耐受容器中残余氧气和湿度的能力。
这些制剂也可确保冻干的活霍乱疫苗侯选物粉末在碳酸氢钠缓冲液中快速重构，使操作更容易，在此过程中保护疫苗并改善感官特征，特别是与冻干片及重构物的视觉效果有关的感观特征。
本文所提供用于活霍乱疫苗保藏及冻干的制剂之一不含通常会添加到许多制剂中以冻干人类疫苗的牛源组分。
序列表<110>Centro Nacional de Investigaciones Cientificas(CNIC)(森特拉·耐科奥诺·德·因威斯迪盖什斯·西恩蒂菲科斯(CNIC))<120>用于口服接种的冻干形式的具有改良的生物安全性特征的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)减毒株<130>CUA1V050005943<141>2004-02-19<150>CU 2003-0039<151>2003-02-20<150>CU 2003-0084<151>2003-04-17<160>1<210>1<211>7542<212>DNA<213>霍乱弧菌(Vibrio cholerae)丝状噬菌体<220>
<221>ORF359 CDS<222>(1)..(1077)<223>与来自于其它丝状噬菌体的复制蛋白pII相似<220>
<221>ORF112 CDS<222>(1085)..(1420)<223>假设的蛋白质<220>
<221>ORF81 CDS<222>(1433)..(1675)<223>假设的蛋白质<220>
<221>ORF44 CDS<222>(1690)..(1821)<223>与来自于其它丝状噬菌体衣壳的主要蛋白质pVIII相似<220>
<221>ORF29 CDS<222>(1839)..(1925)<223>假设的蛋白质<220>
<221>ORF493 CDS<222>(1954)..(3432)<223>与来自于其它丝状噬菌体衣壳的微量蛋白质pIII相似<220>
<221>ORF80 CDS<222>(3510)..(3749)<223>假设的蛋白质<220>
<221>ORF384 CDS<222>(3755)..(4906)<223>与来自于其它丝状噬菌体的装配蛋白质pI相似<220>
<221>ORF104 CDS<222>(5232)..(5543)<223>与来自于其它丝状噬菌体的装配蛋白质pI相似<220>
<221>ORF67 CDS<222>(7328)..(7528)<223>假设的蛋白质<220>
<221>ORF136 CDS<222>(6105)..(6112)<223>互补链推定的转录调节物I<220>
<221>ORF154 CDS<222>(6439)..(6900)<223>互补链推定的转录调节物I
<220>
<221>ORF58 CDS<222>(6439)..(6900)<223>互补链假设的蛋白质<400>1atgatacggt tcgccctgtc aaagttgacc acttggcttt tactttcgcc tatgcggact60tgcgccactt ggacaaaagc aacgaccaag actttatcaa tctacagatg cccgtttatc120acgagccaaa gacccgaacc aaggaacaag gcgcggtgtg ctctaccttg gaacaaatcg180agcatcatat ggaagcgcac cgaaacaaag tgtccaagat gctctttcat cgctttgatt240tgttcatgtc caaaatcatg gctttcgtta tcgcctatgc gtggtcgtgg ccttcatggt300tacaacgatt ctatggtcat tctcgatatg accggacaag ttgagtgtgg ccttgtcgga360attggcggaa acaacgatac cgtttttgtc caaatcaacg gcacggggtg caccaaactt420ttcgaccgta tcgactctaa gaagcttcat tggtggctcg ctcaggttct tggcattact480cgcttagttc gtctcgactt ggccgtggac gattacaccg gaaacttcga cgccaagtat540gcagagaaat gtttttatga gggagcattt cgcactgctc cacgggggca aggtccctca600atggttcctc ataaacgcat tacagaaaac ggcgctttga tggaagaagc aacgattgtc660ggctctcgtt cctcggcgat ttactggcgt atctacaaca aaaagcttga gcaaaaaatt720actgaccctg acctgatttg gtatcgaaac gaggttgagc tgaaaaagtg cgacatcgag780cttttagcca atcctgccgc ctcttttgcg ggtatctgcc ctttcgcggc ctctatcgag840tgtacgcctc cggttaagtt ctctcgcaac aaaaaggctc aaggtcttga atttatggct900cgcatcgcat gggttcgccg tcaatgtggc gtggcgttag cggaagttat cgccatgacg960caaggcgatt taggcgaagc attcgggatg cttatccctc acaaacatag acgccctgac1020tttgaattgc tcggcgttcc tgattcatac acacaactga aaaacacact atggagttaa1080ggtaatggct aacatcactg gcatcgtcat caaaacattt cctaaatcgg gtaccacgat1140
tgcagagctg aacgttcttc gccctgttga aaccgtcaac gttgagaagt ttgctcaata1200cggtttgggg ctaaacacgg atattccttt caataagcag ccgctgcgta tcgaacctac1260ttacgccaag cgtttgattg aaacacgcgc ttttgttcct aaccgtgaat atgacattcg1320ctttggtagt aaccctgacg acccattgga agtcgttgct gttgagctca tccccaagga1380tgacgacctt aaaaaatact ttactgaaac acttaaaaag taaggaagtt ttatgcctgt1440gtgcgctctc ccaaatagtc agggattcct agcggttact gacaagccac tgaatgaatg1500tgacggcggt tatgttgctt tcactattca ggattacgac tacttgatga gctacacacg1560cataacccca accgatgccg gaacggcctt tagcttcggt tttatggctg tattcgctct1620cggttattta tatacctatg ccgtttatat cggtaaaaaa ctcatcaacc tcttataagg1680agatacatca tggctgatat ctttggcgca attgattttg caggtgtcgc tgctcttgtt1740actgctgctg gtgttgccat cattggcatt actatggctt tcaaaggcat ctcacttggc1800aaacgcgctg ttaacaaagc ctaatcggta actgaactat gcttattgcc ctgcatgata1860ttcagttaat tattttcgcg ttgctgggtg gcatgtcggg ttttatagct gctctcaact1920tccgataaca aaggggctaa cgcccctttt tttatggtta tgtttatgcg caaatttttt1980attatctctc ttgtcattag cttatatttc accgttcttc ctgcttttgc tgcttatcag2040ttaccttttg accaaacaaa gactttctca actgttcagg ccgccgctga gtattatgtc2100aatttacttg gtggtacttc atgcaaggct gacggtaaca ggtttaaaat ttacagagtt2160aaatctattg gcgacccctc ttttgttatt caacaagaaa cctatttaga caacaaatgt2220caggtctttt catcaaaggg tgatatcagc gttactctta ttgttgttga cgaccctacc2280acctgcgagg cttcaaaagg tcaaacagga aaagtcggtt ggaattctta cttctggggc2340tcggcaactc catcccgtta tatctgctct tctgcttatg gtggttgtgt tgccctcact2400ggtgaccatt tatgtattaa tattgaccct gaagcattga aaaatgaccc gtctctttat2460gattgcgatg ctctctatat cgttcaggat actccttgtt ccccttctgg tgattatcca2520ttttgtaccg atgagaattg ctcttctttt cttcctgagc cgaatcctaa ccctaaccct2580
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PCT/RO/134表PCT/RO/134表的中文译文
仅受理局使用
仅国际局使用
权利要求
1.具有改良的环境安全性，用于口服接种抗霍乱的活霍乱弧菌(Vibriocholerae)减毒株，其特征在于·抗杂交重组噬菌体VGJФ∷CTXФ(SEQ IDNo 1)感染及随后的毒力转化，·不能通过VGJФ∷CTXФ杂交重组体(SEQ IDNo 1)出现进一步传播引入的CTXФ，以及·以冷冻干燥的制剂存在，其包含下列物质乳糖、蛋白胨、酵母提取物和山梨糖醇，总浓度不超过10％。
2.如权利要求1所述的活减毒株，其中所述菌株的特征在于·由于损害细菌表面上VGJФ受体，MSHA菌毛正确装配的突变，抗杂交重组噬菌体VGJФ∷CTXФ(SEQ IDNo 1)感染，·由于它们的基因组中缺失VGJФDNA序列，不能通过VGJФ∷CTXФ杂交重组体(SEQ IDNo 1)出现进一步传播引入的CTXФ，以及·以冷冻干燥的制剂存在，其包含下列物质乳糖(浓度范围为4.0～6.0％)、蛋白胨(浓度范围为0.5～2.0％)、山梨糖醇(浓度范围为0.5～2.0％)或包含酵母提取物(浓度范围为0.5～2.0％)和山梨糖醇(浓度范围为1.0～2.0％)。
3.如权利要求1或2所述的活减毒株，其中所述菌株的特征在于由于损害细菌表面上VGJФ受体，MSHA菌毛正确和功能性装配的自发和稳定突变，抗杂交重组噬菌体VGJФ∷CTXФ(SEQ IDNo 1)的感染。
4.如权利要求1、2或3所述的活减毒株，其中所述菌株的特征在于其属于下列O1血清组、El Tor生物型、Ogawa血清型霍乱弧菌(Vibriocholerae)菌株中的一种或多种(由BCCM、LMG国际保藏当局保藏)·霍乱弧菌(Vibrio cholerae)JCG01(LMG P-22149)·霍乱弧菌(Vibrio cholerae)JCG02(LMG P-22150)
5.如权利要求1或2所述的活减毒株，其中所述菌株的特征在于由于mshA基因中引入了损害细菌表面上噬菌体受体，MSHA菌毛的结构亚单元合成和其随后表达的缺失，抗杂交重组噬菌体VGJФ∷CTXФ(SEQIDNo 1)的感染。
6.如权利要求1、2或5所述的活减毒株，其中所述菌株的特征在于其属于下列El Tor生物型中O139及O1血清组、Ogawa血清型霍乱弧菌(Vibrio cholerae)菌株中的一种或多种(由BCCM、LMG国际保藏当局保藏)·霍乱弧菌(Vibrio cholerae)JCG03(LMGP-2215])·霍乱弧菌(Vibrio cholerae)MD01(LMGP-22153)·霍乱弧菌(Vibrio cholerae)KMD02(LMG P-22154)·霍乱弧菌(Vibrio cholerae)KMD03(LMG P-22155)·霍乱弧菌(Vibrio cholerae)JCG04(LMG P-22152)·霍乱弧菌(Vibrio cholerae)ESP01(LMG P-22156)·霍乱弧菌(Vibrio cholerae)ESP02(LMG P-22157)·霍乱弧菌(Vibrio cholerae)ESP03(LMG P-22158)·霍乱弧菌(Vibrio cholerae)RAF01(LMG P-22159)·霍乱弧菌(Vibrio cholerae)TLP01(LMG P-22160)·霍乱弧菌(Vibrio cholerae)TLP02(LMG P-22161)·霍乱弧菌(Vibrio cholerae)TLP03(LMG P-22162)
7.如权利要求1、2或5所述的活减毒株，其中所述菌株属于现有霍乱疫苗无效抵抗的新出现的血清型。
全文摘要
本发明公开了用于口服免疫抗霍乱的新减毒活菌株，提供了可长期保藏并施用于人类的冻干剂型。这些菌株综合了霍乱疫苗侯选物两个最重要的性质。所述性质之一是使用这些菌株的人可以很好地耐受。这一性质已经通过突变得以实现，本领域内也有说明。另一性质是由于基因组中缺失VGJΦDNA以及mshA基因中的无效突变或是其它自发性突变使细菌表面易于缺失MSHA IV型菌毛，从而具有增强的环境安全性。这是可以预计的，因为VGJΦ是丝状噬菌体，可与CTXΦ发生重组并传播霍乱毒素基因。VGJΦ噬菌体以及VGJΦ－CTXΦ重组体以MSHA菌毛为受体。由于缺失MSHA菌毛，这些疫苗侯选物不能从重组的杂交VGJΦ－CTXΦ获得CTXΦ。由于缺失VGJΦ，这些疫苗侯选物通过VGJΦ传播CTXΦ的能力受到削弱。
文档编号C07K14/28GK1780640SQ200480010101
公开日2006年5月31日 申请日期2004年2月19日 优先权日2003年2月20日
发明者雅维尔·坎波斯·戈梅, 托马斯·马塞利诺·莫雷拉·赫尔南德斯, 鲍里斯·路易斯·罗德里格斯·冈萨雷, 凯琳·马雷罗·多米盖兹, 埃瑞尔·马迪内兹·古蒂瑞兹, 泰莲纳·亚米尔·莱多佩雷兹, 赫米尼亚·德拉卡里戴德·德尔盖多·罗德里盖兹, 卡里戴德·乌拉·维拉维森希奥, 拉斐尔·阿尔弗雷多·范多·卡尔赞达 申请人:森特拉·耐科奥诺·德·因威斯迪盖什斯·西恩蒂菲科斯(Cnic)