Nell肽表达系统和nell肽的骨形成活性的制作方法

专利名称：Nell肽表达系统和nell肽的骨形成活性的制作方法
关于在联邦研发基金资助下所得发明的权利声明本工作受NIH/NIDR基金No.DE9400和CRC/NIH基金No.RR00865的支持，美国政在本发明中可享有一定的权利。
技本领域本发明总的涉及骨生长因子，更具体是涉及包括NELL1的组合物，包括NELL1的制品，以及使用NELL1诱导骨形成的方法。本发明还提供NELL1和NELL2肽的表达和纯化方法。
背景技术：
生长因子是诸如肽的物质，它们在体内或体外影响特定的细胞群的生长和分化。
骨形成发生在长骨(软骨内骨形成)和扁骨(膜内骨形成)的发育过程中。而且，骨形成还发生在骨重构过程中，这在成年人的一生中连续发生，以保持骨骼的完整性。最后，骨形成还发生在骨修复过程中，例如，在骨折或外科手术的时候发生骨损伤的情况下。人们认为在长骨和扁骨的胚胎学发育中涉及不同的骨形成机理，但认为修复涉及膜内骨形成。
每种机理的骨形成都涉及成骨细胞的活性，而后者是由生长因子调节的。成骨细胞由骨髓基质细胞(也称为间质干细胞；MSC)库中生成。这些细胞存在于各种组织中，但主要存在于骨髓基质中。MSC是多能的，能够分化为各种细胞类型，包括成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌细胞、和脂肪细胞。生长因子被认为能影响骨生成细胞的增殖、分化和成骨细胞矿化作用，这些作用的每一种都影响骨形成。
例如，在颅缝骨接合和裂口移植病人中已经使用自体骨来进行骨修复。在3000名婴儿中有1名患有颅缝骨接合(CS)，即颅缝过早闭合，因此是最普通的人类先天性颅面畸形中的一种。过早的缝闭合导致颅双形，可能需要外科矫正。在人类CS中过早缝闭合可通过两种可能不同的过程发生颅盖生长过度和骨融合。最近，认为FGF2和FGFR1与通过CBFA1-介导的路径的过早颅缝融合有关(8)。CBFA1的错义突变和锁骨头颅发育不良(显示为延迟的缝闭合)有关。
已经使用自体骨如髂骨嵴或颅盖施行了自体骨移植。这些供体部位并非没有继发病态(如疼痛、步态紊乱、髂嵴供体部位大腿感觉异常、以及感染、神经短缺和颅骨移植物血肿)。而且，供体部位的体积有限，可能造成延长手术时间和留院时间。
异源体移植材料也已被使用，生长因子也已在动物模型上进行了试验。例如，bFGF已经显示出对骨再生和修复的潜在用途。另一骨生成的生长因子家族被描述为骨形态发生蛋白(BMP)。特别是，已注明BMP-2重组蛋白能使下颌骨连续性缺损和裂腭缺损再生，其结果等于或优于自体颗粒骨和骨髓。对BMP和其它骨生成因子的临床应用已经进行了研究。然而，使用最低有效剂量的BMP的费用是临床应用的限制因素。
脊柱融合是将多个脊柱的脊椎联合在一起使它们之间不再发生运动的外科技术。其指征包括折裂(破裂)脊椎的治疗、畸形的矫正、消除运动导致的疼痛、不稳定性的处理、以及一些颈间盘突出的治疗。该手术可能涉及在脊椎之间放置骨移植物，使得在脊椎之间获得牢固的连接。手术过程还可能涉及一些补充的处理，包括板、螺钉、支架的放置，最近还使用骨形态发生蛋白2和7以帮助骨移植物的稳定化和愈合。自体骨移植是临床优选的方法，但仍有约30-50％的失败率。自体骨移植是个单独的外科手术，也会带来显著的发病率。
因此，需要安全、有效和付得起费用的组合物和方法在骨发育、疾病或骨外伤中能诱导骨形成。
发明概要本发明提供用于表达和纯化NELL1和NELL2肽的方法。在一个实施方案中，该方法包括NELL肽、表达NELL肽的核酸构建物、以及可用来产生大量NELL肽的表达NELL肽的细胞。在一个实施方案中，表达NELL肽的核酸构建物还可包括编码信号肽的核酸序列，该信号肽有助于宿主细胞中的蛋白运输和NELL肽产生后的修饰。在一个实施方案中，信号肽有助于NELL肽从宿主细胞中分泌。因此，本发明至少在提供大量功能性NELL肽方面是有利的，该肽可被纯化用于临床或研究。
本发明可包括包含NELL肽的组合物和基质。在一些实施方案中，组合物可包括NELL1，还可包括有助于例如施用、稳定性、活性、扩散和/或施用部位肽浓度的其它物质。在一些实施方案中，基质可包括细胞和/或NELL1肽，它们有助于植入物周边的骨修复。
本发明包括在各种临床应用中诱导骨生成分化、成骨细胞矿化和/或骨形成的方法。
本发明的优点至少在于，NELL肽可提供比已知的生长因子更大的作用，或可增强其它生长因子的活性。因此，各种生长因子在临床应用中可使用较低剂量。这至少在临床治疗更能负担得起这一点上是意义重大的。而且，本发明的优点至少在于，NELL1促进骨生成分化、成骨细胞矿化和骨形成，这可改善单用BMP的临床治愈率和有效性。
定义术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在此可交互使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语可用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸是天然存在的相应氨基酸的人造化学类似物，以及用于指天然存在的氨基酸聚合物。
术语“NELL1 cDNA”指SEQ ID NO1，3和5(分别为图1，3和5)，“NELL2cDNA”指SEQ ID NO7，9，11和13(图7，9，11和13)。
NELL1是一种蛋白质，它可被NELL1基因或cDNA表达，包括SEQ ID NO2，4和6(分别为图2，4和16)。NELL1肽可包括NELL1肽片段，它仍保留诱导骨生成细胞分化、成骨细胞分化或骨形成的能力。NELL2肽是一种蛋白质，它可被NELL2基因或cDNA表达，包括SEQ IDNO8，10，12和14(分别为图8，10，12和14)。NELL2肽可包括NELL2肽片段，它仍保留与完全的NELL2肽序列相似的活性。
术语“抗体”可包括修饰的或改变的抗体的各种形式，如完整的免疫球蛋白、只含轻链和重链可变区的Fv片段、由二硫化物键连接的Fv片段、含可变区和部分恒定区的Fab或(Fab)’2片段、单链抗体，等等。抗体可包括完整的分子以及它们的片段，如Fab和F(ab')2，和/或单链抗体(如scFv)，它可结合一个抗原决定簇。抗体可以是动物(如小鼠或大鼠)来源的或人源的或嵌合的或人化的。抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体(“mAb's”)，如对NELL1或NELL2蛋白编码的多肽具有特异性的单克隆抗体。
术语“捕获剂”可指与其它分子特异性地结合形成结合复合物(如抗体-抗原、凝集素-碳水化合物、核酸-核酸、生物素-抗生物素蛋白，等)的分子。
术语“特异性结合”指对生物分子(如蛋白质、核酸、抗体等)，指对异种分子(如蛋白质和其它生物分子)群落中生物分子的存在有鉴定作用的结合反应(BR)。因此，在给定的条件下(如抗体的免疫测定条件或核酸的严格杂交条件)，特定的配体或抗体与其特定的“靶”分子结合，而对存在于样品中的其它分子无明显的结合。
术语“核酸”或“寡核苷酸”指共价结合在一起的至少两个核苷酸。本发明的核酸可以是单股的或双股的，可含有磷酸二酯键，但在某些情况下，也可包括具有交替骨架(包含，例如，磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基亚磷酰胺酸(omethylphosphoroamidite)键、和/或肽核酸骨架或连接)的核酸类似物。核酸类似物可具有正骨架和/或非核糖骨架。核酸还可包括一个或多个碳环糖。可进行核糖-磷酸骨架的修饰以于加入其它部分(如标记物)，或增加这些分子在生理环境中的诸如稳定性和半寿期。
术语“特异性杂交”指在严格条件(在探针优先与其靶序列杂交而与其它序列则较少杂交的条件)下，核酸分子优先与特定的核苷酸序列的结合、形成双链或杂交。


图1是编码人NELL1 cDNA(SEQ ID NO1)的核酸序列。
图2是编码人NELL1(SEQ ID NO2)的氨基酸序列。
图3是编码大鼠NELL1 cDNA(SEQ IDNO3)的核酸序列。
图4是编码大鼠NELL1(SEQ ID NO4)的氨基酸序列。
图5是编码小鼠NELL1 cDNA(SEQ ID NO5)的核酸序列。
图6是编码小鼠NELL1(SEQ ID NO6)的氨基酸序列。
图7是编码人NELL2 cDNA(SEQ ID NO7)的核酸序列。
图8是编码人NELL2(SEQ ID NO8)的氨基酸序列。
图9是编码大鼠NELL2 cDNA(SEQ ID NO9)的核酸序列。
图10是编码大鼠NELL2 SEQ ID NO10)的氨基酸序列。
图11是编码小鼠NELL2 cDNA(SEQ ID NO11)的核酸序列。
图12是编码小鼠NELL2(SEQ ID NO12)的氨基酸序列。
图13是编码鸡NELL2(SEQ ID NO13)的核酸序列。
图14是编码鸡NELL2(SEQ ID NO14)的氨基酸序列。
图15是产生功能性NELL肽的一个方法的流程图。
图16例示一个信号肽-NELL-FLAG-核酸构建物。下面划线的氨基酸序列来自蜂毒肽信号肽。在丙氨酸和脯氨酸之间的键是High Five细胞分泌的假定的断裂位点。RTVLGFG...的残基来自大鼠/人NELL1蛋白的成熟蛋白产生的。
图17例示NELL1-FLAG的细胞外表达产物。图17A是CBB-染色的UnoQ-洗脱物的SDS-PAGE凝胶，该洗脱物含有从无血清培养基中的High Five细胞产生的纯化的NELL1肽(产率约3mg/L培养基)图17B是用抗-FLAG抗体的Western印迹；图17C是CBB-染色的UnoQ-洗脱物的SDS-PAGE凝胶，该洗脱物含有从无血清培养基中的COS7细胞产生的纯化的NELL1肽(产率＜0.1mg/L培养基)；图17D是用抗-FLAG抗体的Western印迹。
图18是例示无血清培养基中昆虫细胞细胞外表达NELL2-FLAG肽的Western印迹。
图19是例示两种类型无血清培养基中High Five细胞细胞外表达NELL1和NELL2-FLAG肽的Western印迹(表达Five SFME和SF921)。
图20是表明暴露于NELL1肽(1ng，10ng，100ng/ml)和BMP4(100ng/ml)的胎鼠颅盖细胞中碱性磷酸酯酶诱导的条形图。
图21A-D是用NELL1(A&B 5ng/ml，C&D 50ng/ml)处理的成骨细胞的显微照片。
图22A和B是不存在抗坏血酸时形成小结的NELL1 MC3T3小结的显微照片。
图23A-C是表明矿化作用的显微照片A)抗-NELL，B)β-Gal和C)NELL腺病毒构建物；图23D和E是表示每个细胞群中骨钙蛋白和骨桥蛋白水平经时变化的条形图。
图24是NELL1过度表达的转基因小鼠的显微照片，染色后表明颅盖过度生长的矿化作用。
图25A和B是颅盖的显微照片，染色后显示矿化作用A)NELL1过度表达的转基因小鼠；B)正常同窝鼠。
图26是转录酶聚合酶链反应印迹，表明用A)Cbfa1或B)对照物处理的胎鼠颅盖细胞中NELL1基因的表达。
图27A-C分别是A)野生型，B)Cbfa1+/-，C)Cbfa1+/-+NELL1overexp小鼠颅(上)、锁骨(中)的骨骼染色照片；以及颅的显微-CT。
图28A和B是颅盖缺损显微-CT照片处理的(右)和对照(左)；A)BMP2处理的和B)NELL1处理的。
图29是颅盖缺损显微-CT照片NELL1处理的(右)，BMP处理的(左)。
图30A和B是腭缺损的显微-CT照片NELL1处理的(右)，对照(左)。
图31A和B是TUNEL染色的软骨的显微照片A)NELL1overexp，B)野生型小鼠。
图32是治疗病人以在选择的部位形成骨的一种方法的流程图。
图33A是表明移植物的一个实施方案的示意图；图33B是表明治疗病人以在选择的部位形成骨的实施方案示意图。
具体实施例方式
本发明涉及用NRLL1诱导骨形成的药物和方法。本发明还涉及用来表达和纯化NELL1和NELL2蛋白的方法。
NELL1是由Ting和Watanabe同时鉴定的。NELL1是810个氨基酸的肽，主要分布在骨中。在成年人中，NELL2在颅面骨中高水平表达，而在长骨中表达水平较低。已经检测了它在成骨细胞分化、骨形成和再生中的作用。NELL2由Watanabe在1996年鉴定，是个816肽，分布在神经细胞和脑中。
人NELL1基因在启动子区至少包括3个Cbfa1应答元素。Cbfa1与在NELL1启动子中的这些应答元素特异性地结合。在发育期和在成年期，NELL1表达可在转录因子控制下，至少在前成骨细胞、成骨细胞和肥大的软骨细胞中内源性地表达。锁骨头颅骨形成异常(disostosis)是一种发育性颅盖缺损，被认为至少部分是由Cbfa的破裂引起的。
为了研究NELL1和NELL2肽的功能，曾经试图生产并纯化这些肽。不幸的是，NELL1和NELL2肽在许多表达系统中不能被表达。特别是，直接在E.coli和S.cerevisiae表达系统中未检出表达。在融合的E.coli和CHO-dhfr表达系统中。只发生极低水平的表达。在杆状病毒系统中，这些肽曾得到表达。
本发明的惊人发现是，NELL1和NELL2肽可在昆虫细胞中高水平表达，而且在昆虫系统中表达的NELL1和NELL2肽是该蛋白的功能形式。
COS7细胞可用来低水平地产生NELL1和NELL2蛋白，如每升培养基10毫克，但表达需要含血清的培养基。不幸的是，该培养基不适合蛋白质生产。至于信号肽，NELL1和NELL2内源性信号肽使COS7细胞中可发生肽的低水平表达。
在一个实施方案中本发明包括用昆虫细胞系表达功能性NELL肽(如NELL1或NELL2肽)的方法。在一个实施方案中，该昆虫细胞可为High Five细胞，Sf9和其它Sf细胞。
在一个实施方案中，该方法包括提供编码NELL肽(如NELL1或NELL2肽)的核酸序列。该核酸序列可以是cDNA或基因组DNA，至少编码NELL肽的一个功能部分。例如，该核酸序列可选自(但不限于)人NELL1(SEQ ID NO1)、大鼠NELL1(SEQ ID NO3)、小鼠NELL1(SEQ ID NO5)或人NELL2(SEQ IDNO7)、大鼠NELL2(SEQ ID NO；9)、小鼠NELL2(SEQ ID NO11)、鸡NELL2(SEQ ID NO13)。该核酸序列还可包括诸如具有基本的序列相似性的序列，例如具有与上述序列的任何部分至少75％序列相似性的序列。
该核酸还可包括用于表达编码NELL肽如NELL1或NELL2肽的核酸序列的表达载体。例如，表达载体可以是plZT/V5-His(Invitrogen)，选择性标记物还可包括杀稻瘟素和新霉素。
而且，陔核酸序列还可包括编码报道蛋白产物的附加核酸，以监测基因表达的水平，或者编码可用本领域已知方法显影的肽标记的核酸，以监测肽表达的水平。附加序列可加以选择，使之不干扰核酸的表达，或不干扰所表达的肽产物的功能。
在一个实施方案中，该方法可包括提供编码NELL肽(如NELL1或NELL2肽)的核酸序列，其框架中带有编码分泌信号肽的核酸序列。在一个实施方案中，分泌信号肽可以是来自分泌的蜜蜂蛋白的分泌信号肽。例如该核酸序列可以选自(但不限于)蜂毒肽信号序列、果蝇(drosphila)免疫球蛋白结合蛋白信号序列、马γ干扰素(elFN-γ)信号肽、蛇磷脂酶A2抑制剂信号肽、人和/或鸡溶菌酶信号肽。对于哺乳动物表达系统，也可使用胰蛋白酶原前导序列。
在一个实施方案中，该方法还包括用编码NELL肽的核酸构建物转染昆虫细胞系；在允许NELL肽表达和/或分泌的条件下培养该昆虫细胞系。例如，该细胞系可用编码NELL肽的核酸构建物短时地或稳定地转染。
该方法还可包括收集所分泌的NELL肽和/或纯化NELL肽备用。可以各种功能或表达测试法测试肽产物的活性。例如在任何测试中，如果在某一特定参数上NELL肽具有比对照物质显著的作用，则可以说该NELL肽对于实现该测量的参数是有功能的。
在一个实施方案中，本发明包括用于在昆虫细胞中表达NELL肽(如NELL1和/或NELL2肽)的核酸构建物。该核酸序列可以是编码NELL肽的至少一个功能部分的cDNA或基因组DNA。例如，该核酸序列可选自(但不限于)人NELL1(SEQ ID NO1)、大鼠NELL1(SEQ ID NO3)、小鼠NELLI(SEQ ID NO5)、或人NELL2(SEQ 1D NO7)、大鼠NELL2(SEQ ID NO9)、小鼠NELL2(SEQ IDNO11)、鸡NELL2(SEQ ID NO13)。该核酸序列还可包括诸如具有基本的序列相似性的序列，例如具有与上述序列的任何部分至少75％序列相似性的序列。
该核酸构建物可包括编码信号肽的核酸序列。该核酸可包括用于表达编码NELL肽的核酸序列的表达载体。而且，该核酸序列可包括编码报道基因产物的附加核酸以监测基因表达的水平，或编码可用本领域已知方法显影的肽标记的附加核酸，以监测肽表达的水平。
该核酸构建物可包含含有选择基因的表达和克隆载体，该基因也称为可选择的标记物，如一种编码使被该载体转化的宿主细胞能存活或生长所必需的蛋白的基因。该基因的存在确保任何缺失该载体的宿主细胞在生长或繁殖上得不到转化宿主细胞所能得到的优点。典型的选择基因编码以下蛋白质(a)赋予对抗生素或其它毒素(如氨苄西林、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)抗性的蛋白质，(b)补充营养缺陷体缺陷的蛋白质。
核酸构建物还可包括为宿主生物体识别的启动子，并且可操作地连接于编码NELL的核酸上。启动子是不被翻译的序列，位于结构基因起始密码子的上游(通常在约100-1000碱基对之内)，控制核酸在其控制之下的转录和翻译，包括诱导型和组成型启动子。诱导型启动子是这样的启动子，它们可响应培养条件的某些改变(如营养物的存在或不存在，或温度的改变)而启动在它们控制下的水平提高的DNA转录。现在，许多为各种潜在宿主细胞识别的启动子是公知的。
当一个核酸被放置在与另一个核酸序列有功能关系的位置时，该核酸就可能被可操作地连接。例如，编码前序列或分泌引导物的DNA可操作地与编码多肽的DNA连接，如果它被表达为参与该多肽分泌的前蛋白的话；启动子或促进子可操作地与编码序列连接，如果它能影响该序列转录的话；或者，核糖体结合位点可操作地与编码序列连接，如果它处于能促进翻译的位置。
在一个实施方案中，本发明可包括表达功能性NELL肽的细胞。在一个实施方案中，该细胞可以是昆虫细胞。在一个实施方案中，该昆虫细胞可以是HighFive细胞。
在一个实施方案中，该细胞可被编码NELL肽的核酸构建物转染。例如，该细胞系可被编码NELL肽的核酸构建物暂时地或稳定地转染。在一个实施方案中，NELL表达核酸(如cDNA)可被克隆入基因表达载体或对转染细胞(如昆虫细胞)感受态的病毒颗粒中。
核酸序列还可包括编码NELL肽(如NELL1或NELL2肽)的核酸序列，在其框架中带有编码昆虫分泌信号肽的核酸序列。
在一个实施方案中，本发明可包括表达功能性NELL肽并可分泌功能蛋白的细胞。
在一个实施方案中，本发明可包括包含NELL肽(如NELL1或NELL2肽)的多肽(氨基酸序列)，并可包括分泌信号肽。
例如，NELL肽的氨基酸序列可选自(但不限于)人NELL1(SEQ ID NO2)、大鼠NELL1(SEQ ID NO4)、小鼠NELL1(SEQ ID NO6)、或人NELL2(SEQ IDNO8)、大鼠NELL2(SEQ ID NO10)、小鼠NELL2(SEQ ID NO12)、鸡NELL2(SEQ ID NO14)。该氨基酸序列还可包括诸如具有基本的序列相似性的序列，例如具有与上述序列的任何部分至少75％序列相似性的序列，或含有类似NELL1肽的活性结合区域。
在一个实施方案中，本发明包括按照标准肽纯化方案纯化分泌到培养基中的NELL1和/或NELL2肽的方法，包括但不限于下述的那些方法。
在一个实施方案中，可以检测所选择的细胞是否表达所选择的核酸序列，以表达和/或分泌NELL肽。在一个实施方案中，可检测NELL肽的存在、其量和/或活性。
在一个实施方案中，用本领域已知的各种方法检测和定量NELL肽。这些方法可包括生化分析方法，如电泳、毛细管电泳、高效液体色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、超扩散色谱等，或各种免疫学方法，如液体或凝胶沉淀素反应、免疫扩散(单向或双向)、免疫电泳、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附剂测定(ELISA)、免疫荧光测定、Western印迹等。
在一个实施方案中，Western印迹(免疫印迹)分析可用来检测和定量所选择的样品中NELL肽的存在。该技术包括基于分子量用凝胶电泳分离样品蛋白质，将分离的样品蛋白质转移到合适的固体支撑物(如硝基纤维素滤纸、尼龙过滤器、或衍生化的尼龙过滤器)上，使样品与特异性结合靶肽的抗体共孵育。
本发明的测定可按照本领域公知的标准方法记分(阳性或阴性或靶多肽的量)。记分的具体方法取决于测定的格式和标记的选择。例如，可通过显示酶标产生的着色产物给Western印迹测定记分。在正确的分子量位置上的清晰可见的着色条带或斑点可记为阳性结果，而没有清晰可见的斑点或条带可记为阴性结果。条带或斑点的强度可提供靶多肽浓度的定量测定。
在这样的表达系统中产生的NELL1蛋白可按与骨成形蛋白(如BMP-1到BMP-24)使用相似的方式加以使用。因此，NELL1多肽可用来加速骨折的修复，或在自然愈合受限制或不存在的情况下诱导骨修复或替换。此外，NELL1多肽可掺合在骨移植材料中。这些移植材料可用来治疗骨折或促进修补物或骨移植物的替换/愈合和促进脊柱融合。
本发明还可包括用来增加骨形成程度和/或速度的药剂和方法。更具体地说，本发明包括药剂的全身和/或局部应用，以增加骨形成。增加骨形成程度和/或速度的方法或药剂能力的临床标志可以DEXA扫描评估的所需骨形成部位上骨密度的改善来见证。可在选定的时间间隔里在骨折部位进行常规X-线检测来评估骨折愈合中骨形成的加速。也可使用更先进的技术如定量的CT扫描来测定上述标志。
在一个实施方案中，本发明可包括增加成骨细胞分化的方法，包含任选地使用第二药剂增加成骨细胞中NELL1基因产物的浓度；诱导成骨细胞分化的细胞标记物的表达。
该方法可包括将NELL1肽施用于成骨细胞来增加NELL1基因产物的浓度，NELL1肽可选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6，或能有效增加成骨细胞分化的NELL肽的任何部分。该方法可包括通过诱导内源性NELL1基因的表达(例如，通过提高表达调节分子Cbfa1的细胞水平)来增加NELL1基因产物的浓度。该方法可包括通过用编码NELL1肽的核酸构建物转染成骨细胞来增加NELL1基因产物的浓度，编码NELL1肽的核酸构建物可选自SEQ IDNO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5。
骨生成细胞包括但不限于成骨细胞、间质细胞、成纤维细胞、胎儿胚胎细胞、干细胞、骨髓细胞、硬脑膜细胞、软骨细胞、成软骨细胞和脂肪干细胞。
骨生成细胞还可包括这样的细胞它们位于骨组织内、与骨组织接触、或迁移至(即“送回”)骨组织，这些细胞直接或间接地刺激骨组织的形成。因此，骨生成细胞可以是这样的细胞，它们最终分化为成熟的成骨细胞本身，即，“直接”形成骨组织的细胞。
第二药剂可包括但不限于TGF-β、BMP2、BMP4、BMP7、bFGF、胶原。可选择在诱导成骨细胞分化中与NELL1具有互补或协同效应的第二药剂。
成骨细胞分化的细胞标记物包括但不限于碱性磷酸酯酶活性、骨钙蛋白和骨桥蛋白mRNA表达、BMP7表达、核心蛋白聚糖表达和层粘连蛋白B1表达水平的提高。但是，任何其活性或表达随着成骨细胞分化的结果而改变的细胞标记物均可用作这样的标记物。
在一个实施方案中，增加成骨细胞矿化作用的方法可包括任选地应用第二药剂增加成骨细胞中NELL1基因产物的浓度；和诱导矿化作用细胞标记物的表达。
该方法包括将NELL1肽施用于成骨细胞以增加NELL1基因产物的浓度，NELL1肽可选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6，或在增加成骨细胞矿化作用中有效的NELL肽的任何部分。可选择第二药剂，使在诱导成骨细胞矿化作用中与NELL1具有互补或协同效应。
成骨细胞矿化作用的细胞标记物包括但不限于钙掺入水平的提高。但是，任何其活性或表达随着成骨细胞矿化作用的结果而改变的细胞标记物均可用作这样的标记物。
在一个实施方案中，增加膜内骨形成的方法可包括任选地将第二药剂施用于希望骨形成的大致相同的部位，在该希望骨形成的部位增加NELL1基因产物的浓度并诱导膜内骨形成。
该方法可包括将NELL肽施用于希望骨形成的部位以增加NELL1基因产物的浓度，NELL1肽可选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6，或在增加膜内骨形成中有效的NELL肽的任何部分。
第二药剂可包括但不限于TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，胶原，骨形成细胞，骨，骨基质，腱基质，韧带基质。可选择第二药剂使其在诱导膜内骨形成中与NELL1具有补充或协同效应。
膜内骨的形成可通过在希望骨形成的部位进行组织学显微镜观察、DEXA扫描、X-线或CT-扫描来评价。
在一个实施方案中，增加软骨内骨形成的方法可包括在希望骨形成的部位增加NELL1基因产物的浓度；对希望骨形成的部位任选地施用第二药剂以及在希望骨形成的部位至少诱导成软骨细胞的肥大。
该方法可包括通过在希望骨形成的部位施用NELL1肽来增加NELL1基因产物的浓度；NELL1肽可选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6，或在增加软骨内骨形成上有效的NELL肽的任何部分。
第二药剂可包括但不限于TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，胶原，骨生成细胞，骨，骨基质，腱基质，韧带基质。可选择第二药剂使其在诱导软骨内骨形成中与NELL1具有补充或协同效应。
软骨内骨的形成可通过成软骨细胞肥大来评估，用TUNEL染色观察到肥大的和凋亡的成软骨细胞增加。
在一个实施方案中，本发明可包括将NELL1结合于载体或基质的方法和这样形成的基质。
在一个实施方案中，诱导骨形成的组合物可包括有效量的第一药剂以诱导骨形成，选自包括但不限于NELL1肽和改变NELL1肽表达的药剂或改变NELL1肽活性的药剂的组以及任选的载体。
该组合物可包括NELL1肽，选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ IDNO6，或在诱导骨形成中有效的任何片段。
该组合物可包括第二药剂，包括但不限于TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，胶原，骨，骨基质，腱基质或韧带基质，骨生成细胞和/或成骨细胞。
在一个实施方案中，载体可以是可生物降解的，如可通过酶解或水解机制降解的。载体的例子包括但不限于合成的可吸收的聚合物，例如但不限于聚(α-羟基酸)，如聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D，L-丙交酯)(PDLLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚(-己内酯)、聚(三亚甲基碳酸酯)、聚(对二噁烷酮)、聚(-己内酯-共-乙交酯)、聚(乙交酯-共-三亚甲基碳酸酯)、聚(D，L-丙交酯-共-三亚甲基碳酸酯)、多芳基化合物、多羟基丁酸酯(PHB)、聚酐、聚(酐-共-酰亚胺)、丙烯-共-富马酸酯、聚内酯、聚酯、聚碳酸酯、多阴离子聚合物、聚酐类、聚酯-酰胺、聚氨基酸、均聚肽、聚(磷腈)、聚(glaxanone)、多糖、和聚(原酸酯)、polyglactin、polyglactic acid、聚醛糖酸、聚丙烯酸、聚烷酸酯；它们的共聚物或混合物，及任何衍生物和改性物。例如，见美国专利4,563,489和PCT国际申请#WO/03024316，在此引为参考。载体的其它离子包括纤维素聚合物，例如但不限于烷基纤维素、羟基烷基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟基乙基纤维素、羟基丙基纤维素、羟基丙基-甲基纤维素、羧甲基纤维素，以及它们的阳离子盐。载体的其它例子包括合成的和天然的生物陶瓷，包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、磷灰石、生物活性玻璃材料、和源自珊瑚的磷灰石。见，例如，美国专利申请2002187104；PCT国际申请WO/9731661；PTC国际申请WO/0071083，在此引为参考。
在一个实施方案中，载体还可用组合物涂覆，该组合物包括由溶胶-凝胶技术产生的生物玻璃和/或磷灰石，或从浸渍技术产生的，例如但不限于模拟体液，其钙和磷酸盐浓度为天然血清浓度的约1.5-7倍，用各种方法调节pH范围为约2.8-7.8，温度在15-65℃的范围。见，例如，美国专利6,426,114和6,013,591和PCT国际申请WO/9117965，在此引为参考。
载体的其它例子包括胶原(如Collastat，Helistat胶原海绵)、透明质素、纤维蛋白、脱乙酰壳多糖、海藻酸盐、和明胶。见，例如，PCT国际申请WO/9505846；WO/02085422，在此引为参考。
在一个实施方案中，载体可包括肝素结合剂；包括但不限于肝素样聚合物，如硫酸葡聚糖、硫酸软骨素、硫酸肝素、岩藻聚糖、海藻酸盐，或它们的衍生物和具有氨基酸修饰以提高肝素亲和力的肽片段。见，例如，Journal of BiologicalChemistry(2003)，278(44)，p.43229-43235，在此引为参考。
在一个实施方案中，基质可以是液体、固体或凝胶的形式。
在一个实施方案中，基质可包括可流动凝胶形式的载体。可选择凝胶以是可注射的，如在希望骨形成的部位经过注射器注射。该凝胶可以是化学凝胶，可以是由主价键形成，并通过pH、离子基团和/或溶剂浓缩控制的化学凝胶。该凝胶也可以是物理凝胶，由次级键形成并由温度和粘度加以控制。凝胶的例子包括但不限于泊洛沙姆(pluronics)、明胶、透明质素、胶原、聚丙交酯-聚乙二醇溶液和轭合物、脱乙酰壳多糖、citosan和b-甘油磷酸酯(BST-凝胶)、海藻酸盐、琼脂糖、羟基丙基纤维素、甲基纤维素、聚氧乙烯、在N-甲基-2-吡咯烷酮中的聚丙交酯/乙交酯。见。例如，Anatomical Record(2001)，263(4)，342-349，在此引为参考。
在一个实施方案中，载体可以是光可聚合的，例如通过用至少约250nm波长的电磁辐射。光可聚合的聚合物的例子包括聚乙二醇(PEG)丙烯酸酯衍生物、PEG甲基丙烯酸酯衍生物、丙烯富马酸酯-共-乙二醇、聚乙烯醇衍生物、PEG-共-聚(-羟基酸)二丙烯酸酯大单体，以及改性的多糖如透明质酸衍生物和葡聚糖甲基丙烯酸酯。见，例如，美国专利5,410,016，在此引为参考。
在一个实施方案中，基质可包括温度敏感性载体。例子包括由以下材料制成的载体N-异丙基丙烯酰胺(NiPAM)、或具有降低的低临界溶液温度的改性NiPAM，及通过掺入甲基丙烯酸乙酯和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺而结合的增强肽(如NELL1)；或甲基丙烯酸烷酯如甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸己酯和甲基丙烯酸十二烷酯。PCT国际申请WO/2001070288；美国专利5,124,151，在此引为参考。
在一个实施方案中，载体可以有一个表面，该表面由以下物质修饰和/或固定化细胞粘合分子、粘合肽、和粘合肽类似物，这些物质可经受体介导的机制促进细胞-基质连接；和/或分子部分，该分子部分可促进经过非受体介导的机制结合的粘合，例如但不限于聚阳离子聚氨基酸-肽(如聚赖氨酸)、聚阴离子聚氨基酸肽、Mefp类粘合分子和其它DOPA-富集的肽(如聚赖氨酸-DOPA)、多糖、和蛋白聚糖。见，例如，PCT国际申请WO/2004005421；WO/2003008376；WO/9734016，在此引为参考。
在一个实施方案中，载体可包括由螯合剂构成的载体，例如但不限于，胶原、明胶、透明质酸、海藻酸盐、聚(乙二醇)、烷基纤维素((包括羟基烷基纤维素)包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟基乙基纤维素、羟基丙基纤维素、羟基丙基-甲基纤维素和羧甲基纤维素)、血液、纤维蛋白、聚氧乙烯氧化物、硫酸钙半水合物、磷灰石、羧基乙烯基聚合物、及聚(乙烯醇)。见，例如，美国专利6620406，在此引为参考。
在一个实施方案中，载体可包括表面活性剂以促进NELL1稳定性和/或在载体材料中的分布，例如但不限于聚氧酯(如聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯20或泊洛沙姆(Pluronic)F-68)。
在一个实施方案中，载体可包括缓冲剂，例如但不限于，甘氨酸、谷氨酸盐酸盐、氯化钠、胍、肝素、乙酸、琥珀酸、聚山梨酸酯、硫酸葡聚糖、蔗糖、和氨基酸。见，例如，美国专利5,385,887，在此引为参考。在一个实施方案中，载体可包括上述材料的组合。
例如，载体可以是PLGA/胶原载体膜。该膜可被浸在包含NELL！肽的溶液中。
在一个实施方案中，用于人体的植入物可包括一个基质，该基质包含其量足以在该植入物周围诱导骨形成的NELL1。
在一个实施方案中，用于人体的植入物可包括一个基质，该基质的表面包含其量足以在该植入物的周围诱导骨形成的NELL1。
在一个实施方案中，用于人体的植入物可包括一个基质，该基质的表面包含骨生成细胞和其量足以诱导骨形成的NELL1。在一个实施方案中，植入物可接种细胞，所述细胞包括但不限于自体细胞、骨生成细胞或成骨细胞、表达NELL1或其它骨生成分子的细胞。
植入物可包括一个基质，该基质被制成筛、针、螺丝、板或人造关节的形状。例如，基质可以是牙科或整形外科植入物的形状，可用NELL1来促进该植入物周围骨的整合。植入物可包括可吸收的基质，如包括胶原的基质。
在一个实施例中，可将本发明组合物包含在缓释药片中。
NELL1肽可与可接受的载体组合，形成药理组合物。可接受的载体可含有生理学上可接受的化合物，其作用为例如稳定该组合物或增加或减少药剂的吸收。生理学上可接受的化合物可包括例如碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化剂如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂；低分子量蛋白质；降低抗有丝分裂剂清除或水解的组合物；或赋形剂或其它稳定剂和/或缓冲剂。
其它生理学上可接受的化合物包括润湿剂、乳化剂、分散剂或防腐剂，后者特别用于防止微生物的生长和作用。各种防腐剂是已知的，包括例如苯酚和抗坏血酸。本领域技术人员会理解，应根据例如给药的途径来选择载体，包括生理学上可接受的化合物。
组合物可以各种单位剂型给药，这取决于给药的方法。例如，合适的单位剂型可包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊。
本发明组合物可包含NELL1肽溶解在药学上可接受的载体中的溶液，如对于水溶性肽而言，该载体可为水性载体。可使用各种载体，如缓冲的盐水等。这些溶液是灭菌，一般不含不需要的物质。这些组合物可用公知的常规灭菌技术来灭菌。需要时，组合物可含有药学上可接受的辅助物质以模拟生理条件如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。
这些配方中NELL1肽的浓度可作大的变动，主要根据与具体选定的给药模式和病人需要相适应的液体的体积、粘度、体重等加以选择。
剂量方案由主诉的临床指征以及病人的各种参数(如体重、年龄、性别)和临床表现(如受伤的程度、受伤的部位，等等)来决定。
但是，本发明中使用的NELL1肽或药剂的治疗有效剂量是对病人有积极的临床效果或在细胞中具有所需效应的剂量，如上所述，该药剂促进成骨细胞分化、矿化、骨形成等的能力来测定。可调节各个肽或药剂的治疗有效剂量以达到所需的临床效果，而使副作用降低到最小。对于具体病人，肽或药剂的剂量可根据以下因素进行选择给药途径、疾病的严重程度、病人的年龄和体重、病人服用的其它药物、以及在为具体病人确定个体给药方案和剂量水平时主治医师通常考虑的其它因素。
剂型包括在剂型中的药剂的治疗有效剂量可通过考虑所选用药剂的类型和给药途径来选择。剂型可包括药剂和其它惰性成分的组合，包括药学领域公知的有利于向病人投药的佐剂和药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，本发明可包括治疗病人以诱导骨形成的方法，包含以选定的时间间隔给予在有效剂型中的治疗有效剂量NELL1，以促进骨形成。该方法还包含在希望骨形成的部位给予至少一种第二药剂，包括但不限于TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，胶原，骨，骨基质，腱基质或韧带基质，骨生成细胞和/或成骨细胞。
在一个实施方案中，治疗病人以诱导骨形成的方法可包括收集哺乳动物骨生成细胞，增加与该骨生成细胞接触的NELL1肽的表达的浓度，向希望骨形成的区域给予该骨生成细胞。
在一个实施方案中，可望骨形成以修补颅外伤或颅缺损，如在有锁骨颅骨发育不全或腭裂的胎儿、婴儿或成年人中所发生的。在一个实施方案中，可能在非愈合性骨缺损(也称为临界尺寸缺损，其缺损处骨不能再生/愈合)部位可能希望骨形成。临界尺寸缺损模型作为对实施所有骨愈合(包括长骨骨折)的药剂的严密试验而被研究，因为据信所有的骨伤愈合都通过膜的(也称为膜内的)骨形成。例如，长骨骨折和颅盖缺损都通过膜的骨形成而愈合。在一个实施方案中，骨形成可能在牙槽骨移植或牙槽嵴增大或牙周骨缺损时是希望的。在一个实施方案中，希望骨形成以促进植入物(如关节或牙科植入物，或美容外科外植物(onplant))的整合。
在一个实施方案中，骨形成可被用在骨移植物自体、自生或异质材料的替换或添加上。
实施例以下实施例被用来说明而不是限制要求保护的本发明。
实施例1 NELL肽的表达将cDNA片段连接到表达载体PiZT/V5-His(3.4kb)(EcoRV位点，Invitrogen)中，并包括蜂毒肽信号肽，成熟大鼠NELL1的BamHI-EcoRI cDNA片段和FLAG标志序列。图16描绘了本实施例所用的cDNA构建物的核酸序列，以及相应的预期的肽序列。
使High Five细胞(BTI-TN-5B1-4)适应于无血清培养基，用NELL1肽表达载体转染细胞。用Zeocin处理细胞以选择只表达NELL1 FLAG构建物的细胞群落。确认存活的细胞群落是稳定的转染体。收集细胞外培养基，测试NELL1肽的存在。纯化NELL1肽并用于以下的功能测定。
图17描绘含纯化NELL1肽的UnoQ-洗脱物的CBB-染色SDS-PAGE凝胶。如在此描述的，将培养基加样到UnoQ柱(Bio-Rad)。图4B是用抗-FLAG抗体的Western印迹，描绘与蛋白质阶梯相对应的NELL1-FLAG表达。肽140kDa(细胞内前体)、130kD(成熟形式；90kDa肽)、400kDa(分泌形式，均三聚体)。在上面的例子中，表达系统的生产率为约3mg NELL1肽/L培养基。
相对于那些根本不表达或不分泌肽的其它系统(如细菌表达，包括酵母)或其肽产率极低的系统(如E.coli融合的肽系统，CHO-dhfr细胞，＞1Omcg/L)，所述系统(哺乳动物和昆虫细胞)的产率在大量生产功能肽上是惊人的和远为有效的。
重组大鼠NELL1蛋白的表达和纯化。为了用昆虫细胞生产C-端FLAG-标记的NELL1肽，将融合于得自pTB701-NELL1-FLC质粒(Kuroda，BBRC)的FLAG表位序列的大鼠NELL1 cDNA插入昆虫表达载体plZT/V5-His(Invitrogen)构建成plZT-NELL1-FLC质粒。用PCR方法将NELL1来源的分泌信号序列替换为蜜蜂蜂毒肽信号序列。High Five细胞购自Invitrogen，培养在High Five无血清培养基中(Invitrogen)。用FuGene6(Roche)以plZT-NELL1-FLC质粒转染HighFive细胞。在转染后48小时，用400mg/ml的Zeocin(Invitrogen)选择细胞。每3-4天更换选择培养基，直至建立稳定表达的细胞系。用免疫沉淀法和Western印迹分析确认NELL1的分泌。发现High Five细胞在该培养基中能表达NELL1肽(140-kDa)。
通过用UNO Q-1柱(Bio-Rad)的阴离子交换色谱从Zeocin-抗性High Five细胞的培养基纯化大鼠重组NELL1-FLAG肽。NELL1肽以500mM NaCl洗脱。
为了用COS7细胞生产C-端FLAG-标记的NELL1肽，将连接于得自pTB701-NELL1-FLC质粒的FLAG表位序列的大鼠NELL1 cDNA插入哺乳动物表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)构建成pcDAN3.1-NELL1-FLC质粒。将COS7细胞在补充10％FBS的DMEM中培养。用电穿孔方法，用内源性NELL信号肽质粒以pcDNA3.1-NELL1-FLC转染COS7细胞。在转染后48小时，将培养基进行免疫沉淀和Western印迹分析来检测NELL1肽。
图17C是含NELL1-FLAG的UnoQ洗脱物的CBB-染色SDS-PAGE凝胶。这些表达研究表明，COS不表达功能NELL肽，没有修饰NELL的N-端(如包括信号序列)以增加分泌效能。图17D是来用抗-FLAG抗体的表明NELL1肽表达的Western印迹。
重组大鼠NELL2蛋白的表达和纯化为了用昆虫细胞生产C-端FLAG-标记的NELL2肽，将融合于得自pTB701-NELL2-FLC质粒的FLAG表位序列的大鼠NELL2 cDNA插入昆虫表达载体plZT/V5-His(Invitrogen)，构建成plZT-NELL2-FLC质粒。High Five细胞购自Invitrogen，在High Five无血清培养基(Invitrogen)中培养。用FuGene6(Roche)以plZT-NELL1-FLC质粒转染High Five细胞。在转染后48小时，用400mg/ml的Zeocin(Invitrogen)选择细胞。每3-4天更换选择培养基，直至建立稳定表达的细胞系。用免疫沉淀法和Western印迹分析确认培养基中NELL2的表达。发现High Five细胞在该培养基中能表达NELL2肽(140-kDa)。
通过采用UNO Q-1柱(Bio-Rad)的阴离子交换色谱从Zeocin-抗性High Five细胞培养基中纯化重组的大鼠NELL2-FLAG肽。以500mM NaCl洗脱NELL2-FLAG肽。
实施例2从培养基中纯化NELL2蛋白带有plZT-FLC-NELL2的High Five细胞在无血清培养基(1L)中培养约3天。培养基于3000×g离心5分钟，收集上清液。加入PMSF至终浓度为1mM。加入饱和硫酸铵溶液(80％饱和度v/v)，溶液在4℃放置1小时。溶液于15000×g离心30分钟，收集沉淀物。将沉淀物溶解在4℃ 50ml的20mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA中，加样于阴离子交换色谱UnoQ柱(6ml，Bio-Rad)，该柱已用20mMTris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA于4℃平衡，进行FPLC(Amershan-Pharmacia)。用相同的缓冲液充分洗涤柱。
然后梯度(在相同的缓冲液中OM到1.5M NaCl)洗脱结合蛋白质。用抗-FlagM2(Sigma)Ab进行Western印迹鉴定NELL2-FLAG级分。将阳性级分收集在一个管子中。最终产物在无缝纤维素管(Wako，截留分子量12000)中对1L PBS于4℃透析过夜。产物保存于-70℃。
用SDS-PAGE/CBB染色检测NELL2-FLAG肽的纯度。图18表示含纯化NELL2肽的UnoQ-洗脱物的CBB染色SDS-PAGE凝胶。栏A表明从细胞培养基中分离出约130 kDa的肽带。“IP”指用于免疫沉淀的抗-FLAG抗体；“WB”指用于Western印迹检测的抗-FLAG抗体。
图19是从Five SFM表达的NELL1和NELL2的印迹。“ESF921”指无血清培养基的商品名；“Five SFM”指培养基的商品名。用于表达这两个NELL蛋白的构建物与上述的那些相似。
实施例3碱性磷酸酯酶活性的增加是成骨细胞分化的早期细胞标记在一个研究中，将胎鼠颅盖细胞在NELL1(1ng/nl，10ng/nl，100ng/ml，用上述方法产生)或BMP4(100ng/ml)存在下生长一段时间。用常规方法测定每个样品的碱性磷酸酯酶。
图20是表示在大鼠颅盖细胞培养物中作为处理的函数的碱性磷酸酯酶诱导的条形图(“OD”＝光密度)。因此，如碱性磷酸酯酶诱导测定所示，在诱导成骨细胞分化上，NELL1处理比BMP4更有效。
图21是用NELL1处理的大鼠颅盖细胞培养物的显微照片。在不存在抗坏血酸时，用NELL1处理诱导了碱性磷酸酯酶活性和细胞微小结形成，这是成骨细胞分化和骨形成前体的一个指征。
实施例4碱性磷酸酯酶测定是成骨细胞分化的早期细胞标记在一个研究中，将大鼠颅盖成骨细胞在24孔板上生长。将孔分成包含以下物质的组NELL1，BMP2，NELL1/BMP2和对照(无肽)。处理包括施加100ng/ml的肽。用常规方法测定每个样品中的碱性磷酸酯酶。
表1

因此，NELL1和BMP对成骨细胞分化有加性效应，如相对于对照或只用一种肽处理的细胞的碱性磷酸酯酶活性测定所示。
实施例5为了研究NELL1表达对成骨细胞分化的作用，用NELL1表达构建物感染MC3T3细胞微阵列后的3、6、9天，评估骨相关基因的表达，与用β-gal表达构建物感染的细胞进行比较。
表2

在NELL1转染细胞中几种骨相关基因的表达水平至少比β-gal对照转染的细胞高两倍。因此，由于晚期成骨细胞分化的细胞标志(如骨钙蛋白和骨桥蛋白)被向上调节了，所以NELL1表达和产生提高了成骨细胞分化。
实施例6微结形成，或众多成骨细胞的聚集，是成骨细胞分化和骨形成前体的一个指征。该过程被认为是由抗坏血酸调节的。
为了研究NELL1对微结形成的作用，用编码NELL1的构建物转染MC3T3细胞，然后在不存在抗坏血酸的情况下生长。
图22A和B是形成微结的表达NELL1的MC3T3细胞的显微照片，为了检测碱性磷酸酯酶而染色(B)。NELL1表达引起碱性磷酸酯酶诱导，以及微结形成。
因此，NELL1对细胞微结形成是有活性的，微结形成是骨形成的前体，NELL1单独就足以诱导成骨细胞分化。
实施例7矿化作用，或钙的细胞内累积是成骨细胞分化和骨形成前体的一个指征。为了研究NELL1矿化作用，用编码腺病毒NELL1的构建物或编码β-gal的对照构建物或反义NELL1病毒转染原代颅盖细胞。随后在培养3，6，9，12天后用Von Kassa染色观察细胞，检测细胞内钙累积的存在。实验证明NELL1能加速骨矿化作用。
图23A-C是用A)反义NELL1病毒、B)β-gal或C)NELL1处理的颅盖细胞的显微照片。对照细胞有中等的矿化量，表达NELL1的细胞的矿化水平增加，而反义NELL1细胞中矿化作用被抑制。该“剔除”研究表明，成骨细胞分化需要NELL1。
图23D和E是表明培养3、6、9、12天后相对于对照GAPFH，骨钙蛋白和骨桥蛋白mRNA表达比例的条形图。在12天后，表达NELL1的细胞表达出了显著提高的骨钙蛋白和骨桥蛋白mRNA水平。因此，NELL1在诱导成骨细胞分化和矿化的晚期细胞标志的表达上是有活性的，成骨细胞分化和矿化是骨形成的前体。
实施例8使用转基因动物模型来检测NELL1过度表达对骨形成的作用将CMV启动子连接在NELL1 cDNA上，显微注射到受精卵中。在强效的CMV启动子之下NELL1被全过度表达(pan-over-expressed)。
图24是NELL1转基因小鼠组织的显微照片，Von Kassa染色。如图24所示，NELL1转基因小鼠颅盖过度生长，这证实了NELL1诱导骨生长(包括膜骨形成)的能力。
图25A和B是NELL1转基因小鼠(A)和正常同窝鼠(B)的颅盖的Von Kassa染色显微照片。如图25A所示，NELL1转基因小鼠比正常的同窝鼠提高了矿化作用，这证实了NELL1在膜骨形成中的作用。
实施例9使用转基因动物模型来检测NELL1表达对Cbfa1缺失引起的发育缺损的作用为了确定Cbfa1在NELL1调节中是否起作用，用含小鼠Cbfa1的质粒载体转染胎鼠颅盖细胞。
图26是显示24和48小时时Cbfa1转染细胞相对于对照细胞的NELL1表达的印迹。在24小时内Cbfa1转染使NELL1表达上调(也使阳性对照骨钙蛋白上调)。这表明是NELL-1是Cbfa1(一种关键的“成骨细胞转录因子)的下游。
图27A-C是骨骼染色(上，中)和显微CT(下)的照片。图27A表示野生型小鼠的正常骨骼图像。可见到典型的矿化界线(boarder)(虚线)，前和后囱门(星号)，以及右冠状骨缝(箭头)。还显示了正常的锁骨(A-中)。显微-CT揭示了典型的颅面骨形态。图27B表示Cbfa1+/-动物的骨骼缺损。特别是，在中线颅盖缺损侧面染色很差的组织中存在不完全的骨矿化和骨形成(在点线之间)，在冠状结构区域内还可见到发亮(箭头)。注意到显著的锁骨发育不全(B-中)。图DC表明Cbfa1+/-+NELLoverexp动物的骨骼缺损，证明在骨骼染色和显微-CT上，相对于Cbfa1+/-单倍体缺损动物，颅盖骨形成显著增加。还有，相对于Cbfa1+/-单倍体缺损动物，锁骨发育不全程度的显著减少(中)。注意，在冠状骨缝处骨重合的恢复(箭头)。因此，在转基因小鼠中NELL1过度表达挽救了Cbfa1缺失，证实了NELL1在膜骨形成和软骨内骨形成中的作用。而且，先天骨缺损中NELL1可使骨再生。
实施例10临界尺寸缺损是研究药剂诱导膜内骨修复能力的重要模型。为了研究NELL1对骨修复的作用，在野生型成年CD-1雄性小鼠中制造右和左颅骨缺损(3mm)。左缺损(对照)只用PLGA/胶原载体膜移植，而右缺损用各面浸泡在200ng NELL1或BMP2中的PLGA/胶原载体膜移植。取出颅骨，用显微-CT分析法观察。
图28A是颅盖缺损治疗的照片对照(左)和BMP2(右)；对照(左)和NELL1(右)；图29是颅盖缺损治疗的照片NELL1(左)和BMP2(右)。在NELL1和BMP2两个组都观察到显著量的骨形成。因此，NELL1表达在临界尺寸缺损模型中显著实现了骨形成并诱导了骨再生，这证实了NELL1在膜骨形成中的作用。
实施例11快速腭伸展(RPE)是研究药剂诱导膜内骨修复能力的另一个模型。为了研究NELL1对骨修复的作用，将4周龄Sprague Dawley大鼠分成(1)对照伸展组和(2)NELL1治疗伸展组。将大鼠处死，取出它们的腭并在器官培养基中保持生命力。使腭伸展和向治疗组加入NELL1为时9天。
图30A和B是伸展的腭的照片(A)NELL1治疗和(B)对照。在NELL1和BMP2两个组中都观察到显著量的骨形成。因此，在RPE模型中NELL1治疗显著实现了骨形成，证实了NELL1在膜骨形成中的作用。
实施例12软骨内骨形成是长骨发育中的关键过程。它包括几个阶段成软骨细胞增生，肥大，凋亡，血管侵入，被成骨细胞替代。这些阶段中任何一个的加速都会诱导软骨内骨生长。
图31A和B是针对凋亡细胞进行TUNEL染色的软骨显微照片(A)NELL1过度表达转基因小鼠；(B)野生型小鼠。
如图31A所示，在NELL1过度表达小鼠中，软骨显示肥大的成软骨细胞和凋亡(用TUNEL ASSAY棕色染色鉴定凋亡细胞核的萎缩来表示)。在图31B中是用TUNEL染色的正常小鼠(野生型)软骨，只呈现极少凋亡的细胞，细胞也不肥大。因此，NELL1能够诱导软骨肥大和凋亡，由此诱导了长骨形成和再生。
实施例13NELL基质制备在体外试验中，将聚丙交酯-共-乙交酯(8515 PLGA；特性粘数～0.6dL/g，Birmingham Polymers，AL)溶解在氯仿中制成5％溶液，倒入玻璃培养皿并使其缓慢挥发24小时。在溶剂提取后，按以下8个组将膜包被(a)仅有聚合物无包被；(b)常规磷灰石(1×SBF接着1.5×SBF)；(c)加速的仿生磷灰石(5×SBF然后为无-Mg和无碳酸盐的5×SBF)(d)纤连蛋白(0.01mg/ml)(e)聚-L-赖氨酸(0.01mg/ml)(f)胶原；(g)Mefp-1(0.01mg/ml)；和(h)胶原和透明质素的混合物。每组又分成含NELL1(100ng)的和无NELL1的组，在非分化培养基(无抗坏血酸，无β-甘油磷酸酯)中与原代成骨细胞体外培养7天。对于每种材料，NELL1的组比无NELL1的组激发出更高的碱性磷酸酯酶活性。在这些材料中，加速的磷灰石(c组)诱导出最高的碱性磷酸酯酶活性，而聚合物对照(a组)则最低。
在体内试验中，将聚丙交酯-共-乙交酯(8515 PLGA；特性粘数～0.6dL/g，Birmingham Polymers，AL)溶解在氯仿中并与成孔剂(porogen)(直径为～100-300μm的蔗糖颗粒)混合，在颗粒浸提和溶剂提取后产生～90％空隙率的PLGA框架。将该多孔框架进行氩-等离子体-蚀刻，灭菌，用含200ng NELL1肽的牛I型胶原水性混合物包被，干燥，然后植入成年雄性野生型小鼠的颅盖缺损中。阳性对照(PLGA/胶原/BMP)和阴性对照(仅PLGA/胶原，无生长因子)也植入类似的缺损中。四周后，显微-CT分析显示，阴性对照框架(仅PLGA/胶原)很少或没有诱导骨形成，但含NELL1的和含BMP的框架到第4周时在缺损上诱导了快速的和完全的矿化。常规组织学证实，该矿化表现出成熟骨骼的经典特征。
应该理解在此叙述的实施例和实施方案只是为了说明的目的，本领域技术人员可据此进行各种修改或改变，这些修改和改变都在本申请精神和所附权利要求书的范围之内。所有在此引用的出版物、专利和专利申请都整体地结合在此引为参考。应该理解，本发明还可包含所述实施方案的任何组合或与已知的方法和组合物的组合。
虽然已经叙述了NELL肽表达系统和NELL肽的骨形成活性的某些实施方案，但应该理解，这些实施方案所包含的概念也可用于其它的实施方案中。简而言之，本申请的保护只限于以下的权利要求书。
序列表<110>加州大学董事会丁淦苏立奇 科罗达吴恩明<120>NELL肽表达系统和NELL肽的骨形成活性<130>38586-332<150>US 60/445,672<151>2003-02-07<160>14<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>2433<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(1)...(2433)<400>1atg ccg atg gat ttg att tta gtt gtg tgg ttc tgt gtg tgc act gcc 48Met Pro Met Asp Leu Ile Leu Val Val Trp Phe Cys Val Cys Thr Ala1 5 10 15agg aca gtg gtg ggc ttt ggg atg gac cct gac ctt cag atg gat atc 96Arg Thr Val Val Gly Phe Gly Met Asp Pro Asp Leu Gln Met Asp Ile20 25 30gtc acc gag ctt gac ctt gtg aac acc acc ctt gga gtt gct cag gtg 144Val Thr Glu Leu Asp Leu Val Asn Thr Thr Leu Gly Val Ala Gln Val35 40 45tct gga atg cac aat gcc agc aaa gca ttt tta ttt caa gac ata gaa 192Ser Gly Met His Asn Ala Ser Lys Ala Phe Leu Phe Gln Asp Ile Glu50 55 60aga gag atc cat gca gct cct cat gtg agt gag aaa tta att cag ctg 240Arg Glu Ile His Ala Ala Pro His Val Ser Glu Lys Leu Ile Gln Leu65 70 75 80ttc cag aac aag agt gaa ttc acc att ttg gcc act gta cag cag aag 288Phe Gln Asn Lys Ser Glu Phe Thr Ile Leu Ala Thr Val Gln Gln Lys85 90 95cca tcc act tca gga gtg ata ctg tcc att cga gaa ctg gag cac agc 336Pro Ser Thr Ser Gly Val Ile Leu Ser Ile Arg Glu Leu Glu His Ser100 105 110tat ttt gaa ctg gag agc agt ggc ctg agg gat gag att cgg tat cac 384Tyr Phe Glu Leu Glu Ser Ser Gly Leu Arg Asp Glu Ile Arg Tyr His115 120 125tac ata cac aat ggg aag cca agg aca gag gca ctt cct tac cgc atg 432Tyr Ile His Asn Gly Lys Pro Arg Thr Glu Ala Leu Pro Tyr Arg Met130 135 140gca gat gga caa tgg cac aag gtt gca ctg tca gtt agc gcc tct cat 480Ala Asp Gly Gln Trp His Lys Val Ala Leu Ser Val Ser Ala Ser His145 150 155 160ctc ctg ctc cat gtc gac tgt aac agg att tat gag cgt gtg ata gac 528Leu Leu Leu His Val Asp Cys Asn Arg Ile Tyr Glu Arg Val Ile Asp165 170 175cct cca gat acc aac ctt ccc cca gga atc aat tta tgg ctt ggc cag 576Pro Pro Asp Thr Asn Leu Pro Pro Gly Ile Asn Leu Trp Leu Gly Gln
180 185 190cgc aac caa aag cat ggc tta ttc aaa ggg atc atc caa gat ggg aag 624Arg Asn Gln Lys His Gly Leu Phe Lys Gly Ile Ile Gln Asp Gly Lys195 200 205atc atc ttt atg ccg aat gga tat ata aca cag tgt cca aat cta aat 672Ile Ile Phe Met Pro Asn Gly Tyr Ile Thr Gln Cys Pro Asn Leu Asn210 215 220cac act tgc cca acc tgc agt gat ttc tta agc ctg gtg caa gga ata 720His Thr Cys Pro Thr Cys Ser Asp Phe Leu Ser Leu Val Gln Gly Ile225 230 235 240atg gat tta caa gag ctt ttg gec aag atg act gca aaa cta aat tat 768Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ala Lys Met Thr Ala Lys Leu Asn Tyr245 250 255gca gag aca aga ctt agt caa ttg gaa aac tgt cat tgt gag aag act 816Ala Glu Thr Arg Leu Ser Gln Leu Glu Asn Cys His Cys Glu Lys Thr260 265 270tgt caa gtg agt gga ctg ctc tat cga gat caa gac tct tgg gta gat 864Cys Gln Val Ser Gly Leu Leu Tyr Arg Asp Gln Asp Ser Trp Val Asp275 280 285ggt gac cat tgc agg aac tgc act tgc aaa agt ggt gcc gtg gaa tgc 912Gly Asp His Cys Arg Asn Cys Thr Cys Lys Ser Gly Ala Val Glu Cys290 295 300cga agg atg tcc tgt ccc cct ctc aat tgc tcc cca gac tcc ctc cca 960Arg Arg Met Ser Cys Pro Pro Leu Asn Cys Ser Pro Asp Ser Leu Pro305 310 315 320gta cac att gct ggc cag tgc tgt aag gtc tgc cga cca aaa tgt atc 1008Val His Ile Ala Gly Gln Cys Cys Lys Val Cys Arg Pro Lys Cys Ile325 330 335tat gga gga aaa gtt ctt gca gaa ggc cag cgg att tta acc aag agc 1056Tyr Gly Gly Lys Val Leu Ala Glu Gly Gln Arg Ile Leu Thr Lys Ser340 345 350tgt cgg gaa tgc cga ggt gga gtt tta gta aaa att aca gaa atg tgt 1104Cys Arg Glu Cys Arg Gly Gly Val Leu Val Lys Ile Thr Glu Met Cys355 360 365cct cct ttg aac tgc tca gaa aag gat cac att ctt cct gag aat cag 1152Pro Pro Leu Asn Cys Ser Glu Lys Asp His Ile Leu Pro Glu Asn Gln370 375 380tgc tgc cgt gtc tgt aga ggt cat aac ttt tgt gca gaa gga cct aaa 1200Cys Cys Arg Val Cys Arg Gly His Asn Phe Cys Ala Glu Gly Pro Lys385 390 395 400tgt ggt gaa aac tca gag tgc aaa aac tgg aat aca aaa gct act tgt 1248Cys Gly Glu Asn Ser Glu Cys Lys Asn Trp Asn Thr Lys Ala Thr Cys405 410 415gag tgc aag agt ggt tac atc tct gtc cag gga gac tct gcc tac tgt 1296Glu Cys Lys Ser Gly Tyr Ile Ser Val Gln Gly Asp Ser Ala Tyr Cys420 425 430gaa gat att gat gag tgt gca gct aag atg cat tac tgt cat gcc aat 1344Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ala Ala Lys Met His Tyr Cys His Ala Asn435 440 445act gtg tgt gtc aac ctt cct ggg tta tat cgc tgt gac tgt gtc cca 1392Thr Val Cys Val Asn Leu Pro Gly Leu Tyr Arg Cys Asp Cys Val Pro450 455 460gga tac att cgt gtg gat gac ttc tct tgt aca gaa cac gat gaa tgt 1440Gly Tyr Ile Arg Val Asp Asp Phc Ser Cys Thr Glu His Asp Glu Cys465 470 475 480ggc agc ggc cag cac aac tgt gat gag aat gcc atc tgc acc aac act 1488Gly Ser Gly Gln His Asn Cys Asp Glu Asn Ala Ile Cys Thr Asn Thr
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cga gct gaa cag cga atg aat aga ttg gat cag tgc tat tgt gaa agg 816Arg Ala Glu Gln Arg Met Asn Arg Leu Asp Gln Cys Tyr Cys Glu Arg260 265 270act tgc acc atg aag gga acc acc tac cga gaa ttt gag tcc tgg ata 864Thr Cys Thr Met Lys Gly Thr Thr Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Trp Ile275 280 285gac ggc tgt aag aac tgc aca tgc ctg aat gga acc atc cag tgt gaa 912Asp Gly Cys Lys Asn Cys Thr Cys Leu Asn Gly Thr Ile Gln Cys Glu290 295 300act cta atc tgc cca aat cct gac tgc cca ctt aag tcg gct ctt gcg960Thr Leu Ile Cys Pro Asn Pro Asp Cys Pro Leu Lys Ser Ala Leu Ala305 310 315 320tat gtg gat ggc aaa tgc tgt aag gaa tgc aaa tcg ara tgc caa ttt 1008Tyr Val Asp Gly Lys Cys Cys Lys Glu Cys Lys Ser Ile Cys Gln Phe325 330 335caa gga cga acc tac ttt gaa gga gaa aga aat aca gtc tat tcc tct 1056Gln Gly Arg Thr Tyr Phe Glu Gly Glu Arg Asn Thr Val Tyr Ser Ser340 345 350tct gga gta tgt gtt ctc tat gag tgc aag gac cag acc atg aaa ctt 1104Ser Gly Val Cys Val Leu Tyr Glu Cys Lys Asp Gln Thr Met Lys Leu355 360 365gtt gag agt tca ggc tgt cca gct ttg gat tgt cca gag tct cat cag 1152Val Glu Ser Ser Gly Cys Pro Ala Leu Asp Cys Pro Glu Ser His Gln370 375 380ata acc ttg tct cac agc tgt tgc aaa gtt tgt aaa ggt tat gac ttt 1200Ile Thr Leu Ser His Ser Cys Cys Lys Val Cys Lys Gly Tyr Asp Phe385 390 395 400tgt tct gaa agg cat aac tgc atg gag aat tcc atc tgc aga aat ctg 1248Cys Ser Glu Arg His Asn Cys Met Glu Asn Ser Ile Cys Arg Asn Leu405 410 415aat gac agg gct gtt tgt agc tgt cga gat ggt ttt agg gct ctt cga 1296Asn Asp Arg Ala Val Cys Ser Cys Arg Asp Gly Phe Arg Ala Leu Arg420 425 430gag gat aat gcc tac tgt gaa gac atc gat gag tgt gct gaa ggg cgc 1344Glu Asp Asn Ala Tyr Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ala Glu Gly Arg435 440 445cat tac tgt cgt gaa aat aca atg tgt gtc aac acc ccg ggt tct ttt 1392His Tyr Cys Arg Glu Asn Thr Met Cys Val Asn Thr Pro Gly Ser Phe450 455 460atg tgc atc tgc aaa act gga tac atc aga att gat gat tat tca tgt 1440Met Cys Ile Cys Lys Thr Gly Tyr Ile Arg Ile Asp Asp Tyr Ser Cys465 470 475 480aca gaa cat gat gag tgt atc aca aat cag cac aac tgt gat gaa aat 1488Thr Glu His Asp Glu Cys Ile Thr Asn Gln His Asn Cys Asp Glu Asn485 490 495gct tta tgc ttc aac act gtt gga gga cac aac tgt gtt tgc aag ccg 1536Ala Leu Cys Phe Asn Thr Val Gly Gly His Asn Cys Val Cys Lys Pro500 505 510ggc tat aca ggg aat gga acg aca tgc aaa gca ttt tgc aaa gat ggc 1584Gly Tyr Thr Gly Asn Gly Thr Thr Cys Lys Ala Phe Cys Lys Asp Gly515 520 525tgt agg aat gga gga gcc tgt att gcc gct aat gtg tgt gcc tgc cca 1632Cys Arg Asn Gly Gly Ala Cys Ile Ala Ala Asn Val Cys Ala Cys Pro530 535 540caa ggc ttc act gga ccc agc tgt gaa acg gac att gat gaa tgc tct 1680Gln Gly Phe Thr Gly Pro Ser Cys Glu Thr Asp Ile Asp Glu Cys Ser545 550 555 560
gat ggt ttt gtt caa tgt gac agt cgt gct aat tgc att aac ctg cct 1728Asp Gly Phe Val Gln Cys Asp Ser Arg Ala Asn Cys Ile Asn Leu Pro565 570 575gga tgg tac cac tgt gag tgc aga gat ggc tac cat gac aat ggg atg 1776Gly Trp Tyr His Cys Glu Cys Arg Asp Gly Tyr His Asp Asn Gly Met580 585 590ttt tca cca agt gga gaa tcg tgt gaa gat att gat gag tgt ggg acc 1824Phe Ser Pro Ser Gly Glu Ser Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gly Thr595 600 605ggg agg cac agc tgt gcc aat gat acc att tgc ttc aat ttg gat ggc 1872Gly Arg His Ser Cys Ala Asn Asp Thr Ile Cys Phe Asn Leu Asp Gly610 615 620gga tat gat tgt cga tgt cct cat gga aag aat tgc aca ggg gac tgc 1920Gly Tyr Asp Cys Arg Cys Pro His Gly Lys Asn Cys Thr Gly Asp Cys625 630 635 640atc cat gat gga aaa gtt aag cac aat ggt cag att tgg gtg ttg gaa 1968Ile His Asp Gly Lys Val Lys His Asn Gly Gln Ile Trp Val Leu Glu645 650 655aat gac agg tgc tct gtg tgc tca tgt cag aat gga ttc gtt atg tgt 2016Asn Asp Arg Cys Ser Val Cys Ser Cys Gln Asn Gly Phe Val Met Cys660 665 670cga cgg atg gtc tgt gac tgt gag aat ccc aca gtt gat ctt ttt tgc 2064Arg Arg Met Val Cys Asp Cys Glu Asn Pro Thr Val Asp Leu Phe Cys675 680 685tgc cct gaa tgt gac cca agg ctt agt agt cag tgc ctc cat caa aat 2112Cys Pro Glu Cys Asp Pro Arg Leu Ser Ser Gln Cys Leu His Gln Asn690 695 700ggg gaa act ttg tat aac agt ggt gac acc tgg gtc cag aat tgt caa 2160Gly Glu Thr Leu Tyr Asn Ser Gly Asp Thr Trp Val Gln Asn Cys Gln705 710715 720cag tgc cgc tgc ttg caa ggg gaa gtt gat tgt tgg ccc ctg cct tgc 2208Gln Cys Arg Cys Leu Gln Gly Glu Val Asp Cys Trp Pro Leu Pro Cys725 730 735cca gat gtg gag tgt gaa ttc agc att ctc cca gag aat gag tgc tgc 2256Pho Asp Val Glu Cys Glu Phe Ser Ile Leu Pro Glu Asn Glu Cys Cys740 745 750ccg cgc tgt gtc aca gac cct tgc cag gct gac acc atc cgc aat gac 2304Pro Arg Cys Val Thr Asp Pro Cys Gln Ala Asp Thr Ile Arg Asn Asp755 760 765atc acc aag act tgc ctg gac gaa atg aat gtg gtt cgc ttc acc ggg 2352Ile Thr Lys Thr Cys Leu Asp Glu Met Asn Val Val Arg Phc Thr Gly770 775 780tcc tct tgg atc aaa cat ggc act gag tgt act crc tgc cag tgc aag 2400Ser Ser Trp Ile Lys His Gly Thr Glu Cys Thr Leu Cys Gln Cys Lys785 790 795 800aat ggc cac atc tgt tgc tca gtg gat cca cag tgc ctt cag gaa ctg 2448Asn Gly His Ile Cys Cys Ser Val Asp Pro Gln Cys Leu Gln Glu Leu805 810 815tga 2451*<210>8<211>816<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>8Met Glu Ser Arg Val Leu Leu Arg Thr Phe Cys Leu Ile Phe Gly Leu
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<221>CDS<222>(1)...(2451)<400>9atg gaa tcc cgg gta tta ctg aga acg ttc tgc gtg atc ctc ggg ctc 48Met Glu Ser Arg Val Leu Leu Arg Thr Phe Cys Val Ile Leu Gly Leu1 5 10 15gaa gcg gtt tgg gga ctt ggt gtg gac ccc tcc cta cag att gac gtc 96Glu Ala Val Trp Gly Leu Gly Val Asp Pro Set Leu Gln Ile Asp Val20 25 30tta tca gag tta gaa ctt ggg gag tcc aca get gga gtg cgc caa gtc 144Leu Ser Glu Leu Glu Leu Gly Glu Ser Thr Ala Gly Val Arg Gln Val35 40 45cea gga ctg cat aat ggg acg aaa gcc ttc ctc ttc caa gat tcc ccc 192Pro Gly Leu His Asn Gly Thr Lys Ala Phe Leu Phe Gln Asp Set Pro50 55 60aga agc ata aaa gca ccc att gct aca gct gag cgg ttt ttc cag aag 240Arg Ser Ile Lys Ala Pro Ile Ala Thr Ala Glu Arg Phe Phe Gln Lys65 70 75 80ctg agg aat aaa cac gag ttc aca att ctg gtg acc ctg aaa cag atc 288Leu Arg Asn Lys His Glu Phe Thr Ile Leu Val Thr Leu Lys Gln Ile85 90 95cac tta aat tcg gga gtc att ctc tcc atc cac cae ttg gat cac agg 336His Leu Asn Ser Gly Val Ile Leu Set Ile His His Leu Asp His Arg100 105 110tac ctg gaa ctg gaa agc age ggc cac cgg aat gag atc aga ctg cat 384Tyr Leu Glu Leu Glu Ser Ser Gly His Arg Asn Glu Ile Arg Leu His115 120 125tac cgc tct gga act cac cgc ccg cac acg gaa gtg ttt cct tat att 432Tyr Arg Ser Gly Thr His Arg Pro His Thr Glu Val Phe Pro Tyr Ile130 135 140ttg gct gat gcc aag tgg cac aag ctc tcc tta gcc ttc agt gcc tcc 480Leu Ala Asp Ala Lys Trp His Lys Leu Ser Leu Ala Phe Ser Ala Ser145 150 155 160
cac tta att tta cac atc gac tgc aac aag atc tat gaa cga gtg gtg 528His Leu Ile Leu His Ile Asp Cys Asn Lys Ile Tyr Glu Arg Val Val165 170 175gaa atg cct tct aca gac ttg cct ctg ggc acc aca ttt tgg ttg gga 576Glt Met Pro Set Thr Asp Leu Pro Leu Gly Thr Thr Phe Trp Leu Gly180 185 190cag aga aat aac gca cac ggg tat ttt aag gga ata atg caa gat gtg 624Gln Arg Asn Asn Ala His Gly Tyr Phe Lys Gly Ile Met Gln Asp Val195 200 205caa tta ctt gtc atg ccc cag ggg ttc atc gct cag tgc ccg gat ctt 672Gln Leu Leu Val Met Pro Glu G1y Phe Ile Ala Gln Cys Pro Asp Leu210 215 220aat cga acc tgt cca aca tgc aac gac ttc cat ggg ctt gtg cag aaa 720Asn Arg Thr Cys Pro Thr Cys Asn Asp Phe His Gly Leu Val Gln Lys225 230 235 240atc atg gag ctg cag gac att tta tcg aag acg tca gcc aag ttg tct 768Ile Met Glu Leu Gln Asp Ile Leu Ser Lys Thr Ser Ala Lys Leu Ser245 250 255aga gct gaa caa cga atg aac agg ctg gat cag tgc tac tgt gag cgg 816Arg Ala Glu Gln Arg Met Asn Arg Leu Asp Gln Cys Tyr Cys Glu Arg260 265 270acg tgc acc atg aag gga gcc acc tac cgg gag ttc gag tcc tgg aca 864Thr Cys Thr Met Lys Gly Ala Thr Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Trp Thr275 280 285gac ggc tgc aag aac tgc aca tgc ttg aat ggg acc atc cag tgc gag 912Asp Gly Cys Lys Asn Cys Thr Cys Leu Asn Gly Thr Ile Gln Cys Glu290 295 300act ctg gtc tgc cct gct ccc gac tgc ccg gct aaa tcg gct cca gcg 960Thr Leu Val Cys Pro Ala Pro Asp Cys Pro Ala Lys Ser Ala Pro Ala305 310 315 320tac gtg gat ggc ag tgc tgt aag gag tgc aag tcc acc tgc cag ttc 1008Tyr Val Asp Gly Lys Cys Cys Lys Glu Cys Lys Ser Thr Cys Gln Phe325 330 335cag ggg cgg agc tac ttt gag gga gaa agg agc aca gtc ttc tca gct 1056Gln Gly Arg Ser Tyr Phe Glu Gly Glu Arg Ser Thr Val Phe Ser Ala340 345 350tcc gga atg tgc gte ttg tat gaa tgc aag gat cag acc atg aag ctt 1104Ser Gly Met Cys Val Leu Tyr Glu Cys Lys Asp Gln Thr Met Lys Leu355 360 365gtt gag aac gcc ggc tgc ccg gct tta gat tgc ccc gag tct cat cag 1152Val Glu Asn Ala Gly Cys Pro Ala Leu Asp Cys Pro Glu Ser His Gln370 375 380atc gcc ttg tct cac agc tgc tgc aag gtt tgc aaa ggt tat gac ttc 1200Ile Ala Leu Ser His Ser Cys Cys Lys Val Cys Lys Gly Tyr Asp Phe385 390 395 400tgt tct gag aag cat aca tgc atg gag aac tca gtc tgc agg aac ctg 1248Cys Ser Glu Lys His Thr Cys Met Glu Asn Ser Val Cys Arg Asn Leu405 410 415aac gac agg gca gtg tgc agc tgc cgg gat ggt ttc cgg gcc ctc cgg 1296Asn Asp Arg Ala Val Cys Ser Cys Arg Asp Gly Phe Arg Ala Leu Arg420 425 430gag gac aat gcc tac tgt gaa gac att gac gag tgt gca gag ggg cgc 1344Glu Asp Asn Ala Tyr Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ala Glu Gly Arg435 440 445cat tac tgc cgt gag aac acc atg tgt gtg aac aca ccg ggc tct ttc 1392His Tyr Cys Arg Glu Asn Thr Met Cys Val Asn Thr Pro Gly Ser Phe450 455 460
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tac tca tct tct gga atg tgt gtc tta tat gaa tgc aag gat cag acc 1104Tyr Ser Ser Ser Gly Met Cys Val Leu Tyr Glu Cys Lys Asp Gln Thr355 360 365atg aag ctt gtt gag aac att ggc tgc cca ccc tta gat tgt ccc gag 1152Met Lys Leu Val Glu Asn Ile Gly Cys Pro Pro Leu Asp Cys Pro Glu370 375 380tct cat cag att gcc ttg tct cac agc tgc tgc aag gtt tgt aaa ggt 1200Ser His Gln Ile Ala Leu Ser His Ser Cys Cys Lys Val Cys Lys Gly385 390 395 400tat gac ttc tgt tct gag aag cat acc tgc atg gag aac tcg gtc tgc 1248Tyr Asp Phe Cys Ser Glu Lys His Thr Cys Met Glu Asn Set Val Cys405 410 415agg aac ctg aac gac agg gtt gtg tgc agc tgc agg gat ggt ttt cgg 1296Arg Asn Leu Asn Asp Arg Val Val Cys Ser Cys Arg Asp Gly Phe Arg420 425 430gct ctc cga gag gac aac gcc tac tgt gaa gac att gac gag tgt gca 1344Ala Leu Arg Glu Asp Asn Ala Tyr Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ala435 440 445gaa ggg cgc cat tac tgc cgt gag aac acc atg tgt gtg aat aca cct 1392Glu Gly Arg His Tyr Cys Arg Glu Asn Thr Met Cys Val Asn Thr Pro450 455 460ggt tct ttc atg tgt gtc tgc aaa act ggg tac atc agg atc gac gat1440Gly Ser Phe Met Cys Val Cys Lys Thr Gly Tyr Ile Arg Ile Asp Asp465 470 475 480tac tca tgt aca gaa cat gat gag tgt ctc aca acc cag cac aat tgt 1488Tyr Ser Cys Thr Glu His Asp Glu Cys Leu Thr Thr Gln His Asn Cys485 490 495gat gaa aac gct ttg tgc ttt aac act gtt gga gga cac aac tgt gtc 1536Asp Glu Asn Ala Leu Cys Phe Asn Thr Val Gly Gly His Asn Cys Val500 505 510tgc aag cct ggc tac acc ggg aat gga acc acg tgc aaa gct ttc tgc 1584Cys Lys Pro Gly Tyr Thr Gly Asn Gly Thr Thr Cys Lys Ala Phe Cys515 520 525aaa gat ggc tgt aga aac gga gga gcg tgc att gct gcc aat gtg tgt 1632Lys Asp Gly Cys Arg Asn Gly Gly Ala Cys Ile Ala Ala Asn Val Cys530 535 540gcc tgc cca caa ggc ttc acg gga ccc agc tgt gag aca gac att gac 1680Ala Cys Pro Gln Gly Phe Thr Gly Pro Ser Cys Glu Thr Asp Ile Asp545 550 555 560gag tgc tct gag ggc ttt gtt cag tgt gac agc cgt gcc aac tgc atc 1728Glu Cys Ser Glu Gly Phe Val Gln Cys Asp Ser Arg Ala Asn Cys Ile565 570 575aac ctg cct ggg tgg tat cac tgt gag tgc aga gac ggc tac cat gac 1776Asn Leu Pro Gly Trp Tyr His Cys Glu Cys Arg Asp Gly Tyr His Asp580 585 590aat ggg atg ttt gcg cca ggc gga gaa tcc tgt gaa gat att gac gaa 1824Asn Gly Met Phe Ala Pro Gly Gly Glu Ser Cys Glu Asp Ile Asp Glu595 600 605tgc ggg act ggg agg cac agc tgc acc aac gac acc att tgc ttc aac 1872Cys Gly Thr Gly Arg His Ser Cys Thr Asn Asp Thr Ile Cys Phe Asn610 615 620ttg gac ggg gga tac gat tgc cgg tgt ccc cat ggg aag aac tgc act 1920Leu Asp Gly Gly Tyr Asp Cys Arg Cys Pro His Gly Lys Asn Cys Thr625 630 635 640ggg gac tgc gtg cac gag ggg aaa gtg aag cac acc ggc cag atc tgg 1968Gly Asp Cys Val His Glu Gly Lys Val Lys His Thr Gly Gln Ile Trp645 650 655
gtg ctg gaa aac gac agg tgc tcc gtg tgt tcc tgg cag act ggg ttt 2016Val Leu Glu Asn Asp Arg Cys Ser Val Cys Ser Trp Gln Thr Gly Phe660 665 670gtc atg tgt cga cgg atg gtc tgc gac tgc gaa aac ccc aca gat gac 2064Val Met Cys Arg Arg Met Val Cys Asp Cys Glu Asn Pro The Asp Asp675 680 685ctt tcc tgc tgc cct gag tgt gac cca agg ctg agc agt cag tgc ctg 2112Leu Ser Cys Cys Pro Glu Cys Asp Pro Arg Leu Ser Ser Gln Cys Leu690 695 700cat caa aac ggg gaa acc gtg tac aac agc ggc gac acc tgg gtc cag 2160His Gln Asn Gly Glu Thr Val Tyr Asn Ser Gly Asp Thr Trp Val Gln705 710 715 720gat tgc cgt cag tgc cgc tgc ttg caa gga gaa gtt gac tgt tgg ccc 2208Asp Cys Arg Gln Cys Arg Cys Leu Gln Gly Glu Val Asp Cys Trp Pro725 730 735ctg gct tgc cca gag gta gaa tgt gaa ttt agc gtc ctt cct gag aac 2256Leu Ala Cys Pro Glu Val Glu Cys Glu Phe Ser Val Leu Pro Glu Asn740 745 750gag tgc tgc cca cgc tgt gtc acc gat cct tgt cag gcc gac acc atc 2304Glu Cys Cys Pro Arg Cys Val Thr Asp Pro Cys Gln Ala Asp Thr Ile755 760 765cgc aat gac atc acc aaa acc tgc ctg gac gag atg aac gtg gtt cgc 2352Arg Asn Asp Ile Thr Lys Thr Cys Leu Asp Glu Met Asn Val Val Arg770 775 780ttc acc ggg tct tcc tgg atc aag cac ggc acg gag tgt acc ctc tgc 2400Phe Thr Gly Ser Ser Trp Ile Lys His Gly Thr G1u Cys Thr Leu Cys785 790 795 800cag tgc aag aat ggc cat ttg tgc tgc tca gtg gat cca cag tgc ctt 2448Gln Cys Lys Asn Gly His Leu Cys Cys Ser Val Asp Pro Gln Cys Leu805 810 815cag gag ctg tga 2460Gln Glu Leu *<210>12<211>819<212>PRT<213>鼠(Mus musculus)<400>12Met His Ala Met Glu Ser Arg Val Leu Leu Arg Thr Phe Cys Val Ile1 5 10 15Leu Gly Leu Gly Ala Val Trp Gly Leu Gly Val Asp Pro Ser Leu Gln20 25 30Ile Asp Val Leu Thr Glu Leu Glu Leu Gly Glu Ser Thr Asp Gly Val35 40 45Arg Gln Val Pro Gly Leu His Asn Gly Thr Lys Ala Phe Leu Phe Gln50 55 60Glu Ser Pro Arg Ser Ile Lys Ala Ser Thr Ala Thr Ala Glu Arg Phe65 70 75 80Leu Gln Lys Leu Arg Asn Lys His Glu Phe Thr Ile Leu Val Thr Leu85 90 95Lys Gln Ile His Leu Asn Ser Gly Val Ile Leu Ser Ile His His Leu100 105 110Asp His Arg Tyr Leu Glu Leu Glu Ser Ser Gly His Arg Asn Glu Ile115 120 125Arg Leu His Tyr Arg Ser Gly Thr His Arg Pro His Thr Glu Val Phe130 135 140Pro Tyr Ile Leu Ala Asp Ala Lys Trp His Lys Leu Ser Leu Ala Phe145 150 155 160Ser Ala Ser His Leu Ile Leu His Ile Asp Cys Asn Lys Ile Tyr Glu165 170 175Arg Val Val Glu Met Pro Phe Thr Asp Leu Ala Leu Gly Thr Thr Phe180 185 190Trp Leu Gly Gln Arg Asn Asn Ala His Gly Tyr Phe Lys Gly Ile Met
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245 250 255caa gct gag cag agg atg aac aag ttg gat cag tgc tat tgt gaa agg 816Gln Ala Glu Gln Arg Met Asn Lys Leu Asp Gln Cys Tyr Cys Glu Arg260 265 270acc tgc aca atg aaa ggc atg aca tac aga gaa ttt gaa tcc tgg aca 864Thr Cys Thr Met Lys Gly Met Thr Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Trp Thr275 280 285gat ggt tgt aag aac tgc act tgc atg aat ggc act gtg cag tgt gaa 912Asp Gly Cys Lys Asn Cys Thr Cys Met Asn Gly Thr Val Gln Cys Glu290 295 300gct ttg att tgc tcc ctc tct gac tgt cca cct aat tct gcc ctg rca 960Ala Leu Ile Cys Ser Leu Ser Asp Cys Pro Pro Asn Ser Ala Leu Ser305 310 315 320tac gtg gat ggc aag tgc tgc aaa gaa tgt caa tcg gtg tgc ata ttt 1008Tyr Val Asp Gly Lys Cys Cys Lys Glu Cys Gln Ser Val Cys Ile Phe325 330 335gaa ggc aga acc tac ttt gaa gga caa aga gaa acg gtg tat tea agc 1056Glu Gly Arg Thr Tyr Phe Glu Gly Gln Arg Glu Thr Val Tyr Ser Ser340 345 350tca ggg gac tgt gtt ctg ttt gag tgc aag gac cac aaa atg cag cgt 1104Ser Gly Asp Cys Val Leu Phe Glu Cys Lys Asp His Lys Met Gln Arg355 360 365att cca aaa gac agt tgt gca act ttg aac tgc ccg gaa tct caa cag 1152Ile Pro Lys Asp Ser Cys Ala Thr Leu Asn Cys Pro Glu Ser Gln Gln370 375 380arc cca tta tct cac agt tgc tgc aaa atc tgt aaa ggc cat gac ttt 1200Ile Pro Leu Ser His Ser Cys Cys Lys Ile Cys Lys Gly His Asp Phe385 390 395 400tgc act gaa gga cat aac tgt atg gag cat tct gtc tgc cga aac cta 1248Cys Thr Glu Gly His Asn Cys Met Glu His Ser Val Cys Arg Asn Leu405 410 415gat gac aga gct gtc tgt agc tgc cga gat ggc ttc cgg gcc crt cgg 1296Asp Asp Arg Ala Val Cys Ser Cys Arg Asp Gly Phe Arg Ala Leu Arg420 425 430gag gac aat gcc tac tgt gaa gat gtt gat gag tgt gcc gag ggg cag 1344Glu Asp Asn Ala Tyr Cys Glu Asp Val Asp Glu Cys Ala Glu Gly Gln435 440 445cac tac tgt cgg gag aac acc atg tgt gta aat aca cca gga tcc ttc 1392His Tyr Cys Arg Glu Asn Thr Met Cys Val Asn Thr Pro Gly Ser Phe450 455 460atg tgc arc tgc aaa aca gga tat ara cgc att gat gac tat rca tgt 1440Met Cys Ile Cys Lys Thr Gly Tyr Ile Arg Ile Asp Asp Tyr Set Cys465 470 475 480aca gag cac gat gaa tgt gta aca aac cag cac aac tgt gat gaa aat 1488Thr Glu His Asp Glu Cys Val Thr Asn Gln His Asn Cys Asp Glu Asn485 490 495gcg cta tgt rtc aac acg gtg ggt ggg cac aac tgt gtc tgc aag ctg 1536Ala Leu Cys Phe Asn Thr Val Gly Gly His Asn Cys Val Cys Lys Leu500 505 510ggt tac aca gga aat ggg acg gtg tgt aaa gca ttt tgc aaa gat ggg 1584Gly Tyr Thr Gly Asn Gly Thr Val Cys Lys Ala Phe Cys Lys Asp Gly515 520 525tgc agg aat gga gga gcc tgt att gct tcc aac gtg tgt gcc tgc cca 1632Cys Arg Asn Gly Gly Ala Cys Ile Ala Ser Asn Val Cys Ala Cys Pro530 535 540caa ggc ttc act ggc ccc agc tgt gaa act gac att gat gaa tgc tct 1680Gln Gly Phe Thr Gly Pro Ser Cys Glu Thr Asp Ile Asp Glu Cys Ser
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<400>14Met Glu Ser Gly Cys Gly Leu Gly Thr Leu Cys Leu Leu Leu Cys Leu1 5 10 15Gly Pro Val Val Gly Phe Gly Val Asp Pro Ser Leu Gln Ile Asp Val20 25 30Leu Ser Glu Leu Gly Leu Pro Gly Tyr Ala Ala Gly Val Arg Gln Val25 40 45Pro Gly Leu His Asn Gly Ser Lys Ala Phe Leu Phe Pro Asp Thr Ser50 55 60Arg Ser Val Lys Ala Ser Pro Glu Thr Ala Glu Ile Phe Phe Gln Lys65 70 75 80Leu Arg Asn Lys Tyr Glu Phe Thr Ile Leu Val Thr Leu Lys Gln Ala85 90 95His Leu Asn Ser Gly Val Ile Phe Ser Ile His His Leu Asp His Arg100 105 110Tyr Leu Glu Leu Glu Ser Ser Gly His Arg Asn Glu Ile Arg Leu His115 120 125Tyr Arg Thr Gly Ser His Arg Ser His Thr Glu Val Phe Pro Tyr Ile130 135 140Leu Ala Asp Asp Lys Trp His Arg Leu Ser Leu Ala Ile Ser Ala Ser145 150 155 160His Leu Ile Leu His Val Asp Cys Asn Lys Ile Tyr Glu Arg Val Val165 170 175Glu Lys Pro Phe Met Asp Leu Pro Val Gly Thr Thr Phe Trp Leu Gly180 185 190Gln Arg Asn Asn Ala His Gly Tyr Phe Lys Gly Ile Met Gln Asp Val195 200 205Gln Leu Leu Val Met Pro Gln Gly Phe Ile Ser Gln Cys Pro Asp Leu210 215 220Asn Arg Thr Cys Pro Thr Cys Asn Asp Phe His Gly Leu Val Gln Lys225 230 235 240Ile Met Glu Leu Glu Asp Ile Leu Ala Lys Thr Ser Ala Lys Leu Ser245 250 255Gln Ala Glu Gln Arg Met Asn Lys Leu Asp Gln Cys Tyr Cys Glu Arg260 265 270Thr Cys Thr Met Lys Gly Met Thr Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Trp Thr275 280 285Asp Gly Cys Lys Asn Cys Thr Cys Met Asn Gly Thr Val Gln Cys Glu290 295 300Ala Leu Ile Cys Ser Leu Ser Asp Cys Pro Pro Asn Ser Ala Leu Ser305 310 315 320Tyr Val Asp Gly Lys Cys Cys Lys Glu Cys Gln Ser Val Cys Ile Phe325 330 335Glu Gly Arg Thr Tyr Phe Glu Gly Gln Arg Glu Thr Val Tyr Ser Ser340 345 350Ser Gly Asp Cys Val Leu Phe Glu Cys Lys Asp His Lys Met Gln Arg355 360 365Ile Pro Lys Asp Ser Cys Ala Thr Leu Asn Cys Pro Glu Ser Gln Gln370 375 380Ile Pro Leu Ser His Ser Cys Cys Lys Ile Cys Lys Gly His Asp Phe385 390 395 400Cys Thr Glu Gly His Asn Cys Met Glu His Ser Val Cys Arg Asn Leu405 410 415Asp Asp Arg Ala Val Cys Ser Cys Arg Asp Gly Phe Arg Ala Leu Arg420 425 430Glu Asp Asn Ala Tyr Cys Glu Asp Val Asp Glu Cys Ala Glu Gly Gln435 440 445His Tyr Cys Arg Glu Asn Thr Met Cys Val Asn Thr Pro Gly Ser Phe450 455 460Met Cys Ile Cys Lys Thr Gly Tyr Ile Arg Ile Asp Asp Tyr Ser Cys465 470 475 480Thr Glu His Asp Glu Cys Val Thr Asn Gln His Asn Cys Asp Glu Asn485 490 495Ala Leu Cys Phe Asn Thr Val Gly Gly His Asn Cys Val Cys Lys Leu500 505 510Gly Tyr Thr Gly Asn Gly Thr Val Cys Lys Ala Phe Cys Lys Asp Gly515 520 525Cys Arg Asn Gly Gly Ala Cys Ile Ala Ser Asn Val Cys Ala Cys Pro530 535 540Gln Gly Phe Thr Gly Pro Ser Cys Glu Thr Asp Ile Asp Glu Cys Ser545 550 555 560Asp Gly Phe Val Gln Cys Asp Ser Arg Ala Asn Cys Ile Asn Leu Pro565 570 575Gly Trp Tyr His Cys Glu Cys Arg Asp Gly Tyr His Asp Asn Gly Met580 585 590Phe Ser Pro Ser Gly Glu Ser Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ala Thr
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1.在昆虫细胞中表达功能肽性的一种方法，所述方法包括提供至少一种核酸构建物，该核酸构建物在其框架中包含编码至少一个NELL1肽的至少一个核酸及编码昆虫分泌信号肽的核酸；用所述的核酸构建物转染昆虫细胞；在允许NELL1肽表达的条件下培育所述的昆虫细胞；任选地收集从该细胞系分泌的NELL1肽；任选地基本上纯化该NELL1肽；以及任选地测试该NELL1肽的活性。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述的昆虫是High Five细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述的昆虫分泌信号肽是蜂毒肽信号序列。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述的编码NELL1的核酸选自SEQ IDNO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述的NELL1肽选自SEQ ID NO2，SEQID NO4或SEQ ID NO6。
6.用于在昆虫细胞中表达NELL1肽的核酸构建物，所述的核酸构建物在其框架中包含编码至少一个NELL1肽的至少一个核酸及编码昆虫分泌信号肽的核酸。
7.如权利要求5所述的核酸，其中所述的昆虫分泌信号肽是蜂毒肽信号肽序列。
8.如权利要求5所述的核酸，其中所述的编码NELL1肽的核酸选自SEQ IDNO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5。
9.如权利要求5所述的方法，其中所述的NELL1肽选自SEQ ID NO2，SEQID NO4或SEQ ID NO6。
10.一种用于表达功能性NELL1肽的细胞系，所述的细胞系包括一种核酸构建物，所述核酸构建物在其框架中包含编码至少一个NELL1肽的至少一个核酸及编码昆虫分泌信号肽的核酸。
11.如权利要求10所述的细胞，其中所述的细胞是昆虫细胞。
12.如权利要求11所述的细胞，其中所述的细胞是High Five细胞。
13.如权利要求10所述的细胞，其中所述的细胞分泌所述的NELL1肽。
14.如权利要求10所述的细胞，其中所述的分泌信号肽是蜂毒肽信号肽。
15.如权利要求10所述的细胞，其中所述的编码NELL1肽的核酸选自SEQID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述的NELL1肽选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
17.一种多肽，包含NELL1肽和昆虫分泌信号肽。
18.如权利要求16所述的多肽，其中所述的NELL1肽选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
19.如权利要求17所述的多肽，其中所述的分泌信号肽是蜂毒肽信号序列。
20.一种在哺乳动物细胞中表达功能性肽的方法，所述的方法包括提供核酸构建物，该核酸构建物在其框架中包含编码至少一个NELL1肽的至少一个核酸与编码分泌信号肽的核酸；用所述的核酸构建物转染哺乳动物细胞；在允许NELL1肽表达的条件下培育所述的哺乳动物细胞；任选地收集从该细胞系分泌的NELL1肽；任选地基本上纯化该NELL1肽；以及任选地测试该NELL1肽诱导骨形成的活性。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述的昆虫细胞是COS7细胞。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述的昆虫分泌信号肽是NELL肽信号序列。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述的编码NELL1肽的核酸选自SEQID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5。
24.如权利要求20所述的方法，其中所述的NELL1肽选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
25.一种用于在哺乳动物细胞中表达NELL1肽的核酸构建物，所述的核酸构建物在其框架中包含编码至少一个NELL1肽的至少一个核酸与编码分泌信号肽的核酸。
26.如权利要求24所述的核酸，其中所述的昆虫分泌信号肽是NELL肽信号序列。
27.如权利要求24所述的核酸，其中所述的编码NELL1肽的核酸选自SEQID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5。
28.如权利要求24所述的核酸，其中所述的NELL1肽选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
29.一种用于表达功能性NELL1肽的细胞系，所述的细胞系包含一种核酸构建物，所述的核酸构建物在其框架中包含编码至少一个NELL1肽的至少一个核酸与编码分泌信号肽的核酸。
30.如权利要求29所述的细胞，其中所述的细胞是哺乳动物细胞。
31.如权利要求30所述的细胞，其中所述的细胞是COS7细胞。
32.如权利要求29所述的细胞，其中所述的细胞分泌所述的NELL1肽。
33.如权利要求29所述的细胞，其中所述的分泌信号肽是NELL肽信号序列。
34.如权利要求29所述的细胞，其中所述的编码NELL1肽的核酸选自SEQID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5。
35.如权利要求20所述的方法，其中所述的NELL1肽选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
36.一种包含NELL1肽和分泌信号肽的多肽。
37.如权利要求35所述的多肽，其中所述的NELL1肽选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
38.如权利要求35所述的多肽，其中所述的分泌信号肽是NELL肽信号序列。
39.在昆虫细胞中表达功能肽性的一种方法，所述的方法包括提供一种核酸构建物，该核酸构建物在其框架中包含编码至少一个NELL2肽和昆虫分泌信号肽的至少一个核酸与NELL2肽；用所述的核酸构建物转染昆虫细胞；在允许NELL2肽表达的条件下培育所述的昆虫细胞；任选地收集从该细胞系分泌的NELL2肽；任选地基本上纯化该NELL2肽；以及任选地测试该NELL2肽的活性。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述的昆虫细胞是High Five细胞。
41.如权利要求39所述的方法，其中所述的昆虫分泌信号肽是蜂毒肽信号肽序列。
42.如权利要求39所述的方法，其中所述的编码NELL2肽的核酸选自SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11或SEQ ID NO13。
43.如权利要求39所述的方法，其中所述的NELL2肽选自SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12或SEQ ID NO14。
44.一种用于在昆虫细胞中表达NELL2肽的核酸构建物，所述的核酸构建物在其框架中包含编码至少一个NELL2肽的至少一个核酸与编码昆虫分泌信号肽的核酸。
45.如权利要求43所述的核酸，其中所述的昆虫分泌信号肽是蜂毒肽信号序列。
46.如权利要求43所述的核酸，其中所述的编码NELL2肽的核酸选自SEQIDNO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11或SEQ ID NO13。
47.如权利要求5所述的核酸，其中所述的NELL2肽选自SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12或SEQ ID NO14。
48.一种用于表达功能性NELL2肽的细胞系，所述的细胞系包括一种核酸构建物，所述的核酸构建物在其框架中包含编码至少一个NELL2肽的至少一个核酸与编码昆虫分泌信号肽的核酸。
49.如权利要求48所述的细胞，其中所述的细胞是昆虫细胞。
50.如权利要求49所述的细胞，其中所述的细胞是High Five细胞。
51.如权利要求48所述的细胞，其中所述的细胞分泌所述的NELL2肽。
52.如权利要求48所述的细胞，其中所述的分泌信号肽是蜂毒肽信号肽序列。
53.如权利要求48所述的细胞，其中所述的编码NELL2肽的核酸选自SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11或SEQ ID NO13。
54.如权利要求39所述的方法，其中所述的NELL2肽选自SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12或SEQ ID NO14。
55.一种包含NELL2肽和昆虫分泌信号肽的多肽。
56.如权利要求55所述的多肽，其中所述的NELL2肽选自SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12或SEQ ID NO14。
57.如权利要求55所述的多肽，其中所述的分泌信号肽是蜂毒肽信号序列。
58.一种在哺乳动物细胞中表达功能性肽的方法，所述的方法包括提供核酸构建物，该核酸构建物在其框架中包含编码至少一个NELL2肽的至少一个核酸和编码分泌信号肽的核酸与NELL2肽；用所述的核酸构建物转染昆虫细胞；在允许NELL2肽表达的条件下培育所述的昆虫细胞；任选地收集从该细胞系分泌的NELL2肽；任选地基本上纯化该NELL2肽；以及任选地测试该NELL2肽促进神经元细胞存活的活性。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述的哺乳动物细胞是COS7细胞。
60.如权利要求58所述的方法，其中所述的哺乳动物分泌信号肽是NELL肽信号序列。
61.如权利要求58所述的方法，其中所述的编码NELL1肽的核酸选自SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11或SEQ ID NO13。
62.如权利要求58所述的方法，其中所述的NELL2肽选自SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12或SEQ ID NO14。
63.一种用于在哺乳动物细胞中表达NELL2肽的核酸构建物，所述的核酸构建物在其框架中包含编码至少一个NELL2肽的至少一个核酸与编码分泌信号肽的核酸。
64.如权利要求63所述的核酸，其中所述的哺乳动物分泌信号肽是NELL肽信号序列。
65.如权利要求63所述的核酸，其中所述的编码NELL2肽的核酸选自SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11或SEQ ID NO13。
66.如权利要求63所述的核酸，其中所述的NELL2肽选自SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12或SEQ ID NO14。
67.一种用于表达功能性NELL2肽的细胞系，所述的细胞系包括一种核酸构建物，所述的核酸构建物在其框架中包含编码至少一个NELL2肽的至少一个核酸与编码分泌信号肽的核酸。
68.如权利要求67所述的细胞，其中所述的细胞是哺乳动物细胞。
69.如权利要求68所述的细胞，其中所述的细胞是COS7细胞。
70.如权利要求67所述的细胞，其中所述的细胞分泌所述的NELL2肽。
71.如权利要求67所述的细胞，其中所述的分泌信号肽是NELL肽信号序列。
72.如权利要求67所述的细胞，其中所述的编码NELL2肽的核酸选自SEQID NO7，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11或SEQ ID NO13。
73.如权利要求58所述的方法，其中所述的NELL2肽选自SEQ ID NO8，SEQ ID NO10，SEQ ID NO12或SEQ ID NO14。
74.一种增加骨生成细胞分化的方法，包括在骨生成细胞中增加NELL1基因产物的浓度；任选地施用一种第二种骨生成剂；以及诱导成骨细胞分化的细胞标记物的表达。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述的增加NELL1基因产物的浓度包括将NELL1肽施用于骨生成细胞。
76.如权利要求74所述的方法，其中所述的NELL1肽选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
77.如权利要求74所述的方法，其中所述的增加NELL1基因产物的浓度包括诱导内源性NELL1基因的表达。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述的增加NELL1基因产物的浓度包括增加Cbfal的细胞水平。
79.如权利要求74所述的方法，其中所述的增加NELL1基因产物的浓度包括用编码NELL1肽的核酸构建物转染骨生成细胞。
80.如权利要求74所述的方法，其中所述的编码NELL1肽的核酸构建物包含选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5中的至少一个。
81.如权利要求74所述的方法，其中所述的NELL1肽选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
82.如权利要求74所述的方法，其中所述的骨生成细胞选自成骨细胞、间质细胞、成纤维细胞、胎儿胚胎细胞、干细胞、骨髓细胞、硬脑膜细胞、软骨细胞、成软骨细胞、原代颅盖细胞、干细胞、脂肪干细胞。
83.如权利要求74所述的方法，其中所述的第二种骨生成肽选自TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，胶原。
84.如权利要求74所述的方法，其中所述的诱导成骨细胞分化的细胞标记物选自碱性磷酸酯酶活性，骨钙蛋白mRNA表达，骨桥蛋白mRNA表达，核心蛋白聚糖表达，和层粘连蛋白B表达。
85.一种增加成骨细胞矿化作用的方法，包括在骨生成细胞中增加NELL1基因产物的浓度；任选地将一种药剂施用于骨生成细胞；以及诱导矿化作用的细胞标记物的表达。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述增加NELL1基因产物的浓度包括将NELL1肽施用于骨生成细胞。
87.如权利要求85所述的方法，其中所述的NELL1肽选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
88.如权利要求85所述的方法，其中所述增加NELL1基因产物的浓度包括诱导内源性NELL1基因的表达。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述增加NELL1基因产物的浓度包括增加Cbfal的细胞水平。
90.如权利要求85所述的方法，其中所述增加NELL1基因产物的浓度包括用编码NELL1肽的核酸构建物转染骨生成细胞。
91.如权利要求85所述的方法，其中所述的编码NELL1肽的核酸构建物包含选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5中的至少一个。
92.如权利要求85所述的方法，其中所述的NELL1肽选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
93.如权利要求85所述的方法，其中所述的骨生成细胞选自成骨细胞、间质细胞、成纤维细胞、胎儿胚胎细胞、干细胞、骨髓细胞、硬脑膜细胞、软骨细胞、成软骨细胞、原代颅盖细胞、干细胞、脂肪干细胞。
94.如权利要求85所述的方法，其中所述的第二种骨生成剂选自TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，胶原。
95.如权利要求85所述的方法，其中所诱导的矿化作用的细胞标记物选自钙掺入。
96.一种增加膜内骨形成的方法，包括在需要骨形成的部位增加NELL1基因产物的浓度；
97.如权利要求96所述的方法，其中所述增加NELL1基因产物的浓度包括将NELL1肽施用于需要骨形成的部位。
98.如权利要求96所述的方法，其中所述NELL1肽选自SEQ ID NO2，SEQID NO4或SEQ ID NO6。
99.如权利要求96所述的方法，其中所述增加NELL1基因产物的浓度包括诱导内源性NELL1基因的表达。
100.如权利要求96所述的方法，其中所述增加NELL1基因产物的浓度包括用编码NELL1肽的核酸构建物转染细胞，并将该细胞施用在需要骨形成的部位的附近。
101.如权利要求96所述的方法，其中所述编码NELL1肽的核酸构建物包含选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO3或SEQ ID NO5的至少一个。
102.如权利要求96所述的方法，其中所述NELL1肽选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
103.如权利要求96所述的方法，其中所述的药剂选自TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，胶原，骨，基质，韧带基质，腱基质，骨生成细胞或成骨细胞。
104.如权利要求96的方法，其中诱导膜内骨的形成用CT、基因表达、组织学、机械试验来评估。
105.增加软骨内骨形成的方法，包括在需要骨形成和/或愈合和/或再生的部位增加NELL1基因产物的浓度；任选地在需要骨形成的部位施用药剂；以及在需要骨形成的部位诱导成软骨细胞的肥大。
106.如权利要求105所述的方法，其中所述骨形成包括骨愈合或骨再生。
107.如权利要求105所述的方法，其中所述增加NELL1基因产物的浓度包括将NELL1肽施用在需要骨形成的部位。
108.如权利要求105所述的方法，其中所述NELL1肽选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
109.如权利要求105所述的方法，其中所述增加NELL1基因产物的浓度包括诱导内源性NELL1基因的表达。
110.如权利要求105所述的方法，其中所述增加NELL1基因产物的浓度包括用编码NELL1肽的核酸构建物转染细胞，并将该细胞施用在需要骨形成的部位的附近。
111.如权利要求110所述的方法，其中所述编码NELL1肽的核酸构建物包含选自以下的至少一个SEQ ID NO1，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5。
112.如权利要求110所述的方法，其中所述NELL1肽选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
113.如权利要求105所述的方法，其中所述的药剂选自TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF,胶原，骨，基质，韧带基质，腱基质，骨生成细胞或成骨细胞。
114.如权利要求105所述的方法，其中所述诱导成软骨细胞肥大导致凋亡的成软骨细胞的增加。
115.在脊椎的邻近部位增加骨形成的方法，包括在需要脊柱融合的脊椎的邻近处增加NELL1基因产物的浓度；任选地在需要脊柱融合的脊椎的邻近处施用外加的活性药剂；以及在需要脊柱融合的部位诱导成软骨细胞肥大或成骨细胞分化。
116.如权利要求115所述的方法，所述方法还包括增加成骨细胞的分化。
117.如权利要求115所述的方法，所述方法还包括增加成骨细胞的矿化作用。
118.如权利要求115所述的方法，所述方法还包括诱导膜骨形成。
119.如权利要求115所述的方法，其中所述增加NELL1基因产物的浓度包括将NELL1肽施用在需要脊柱融合的部位。
120.如权利要求115所述的方法，其中所述NELL1肽选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
121.如权利要求115所述的方法，其中所述增加NELL1基因产物的浓度包括诱导内源性NELL1基因的表达。
122.如权利要求115所述的方法，其中所述增加NELL1基因产物的浓度包括用编码NELL1肽的核酸构建物转染细胞，并将该细胞施用在需要脊柱融合的部位的附近。
123.如权利要求122所述的方法，其中所述编码NELL1肽的核酸构建物包含选自以下的至少一个SEQ ID NO1，SEQ ID NO3或SEQ ID NO5。
124.如权利要求122所述的方法，其中所述NELL1肽选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4，或SEQ ID NO6。
125.如权利要求115所述的方法，其中所述的药剂选自TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，胶原，骨，基质，韧带基质，腱基质，骨生成细胞或成骨细胞。
126.诱导骨形成的组合物，包含有效量的诱导骨形成的第一药剂，选自NELL1肽/改变NELL1肽表达的药剂，或改变NELL1肽活性的药剂；和任选的载体。
127.如权利要求126所述的组合物，其中所述NELL1肽选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
128.如权利要求126所述的组合物，其中所述的药剂选自TGF-B，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，胶原。
129.如权利要求126所述的组合物，其中所述的药剂选自骨基质，韧带基质或腱基质，骨生成细胞或成骨细胞。
130.如权利要求126所述的组合物，其中所述的载体是可被酶解或水解机制降解的。
131.如权利要求126所述的组合物，其中所述的载体是选自以下物质的合成聚合物聚(α-羟基酸)，如聚(L-丙交酯)，聚(D，L-丙交酯)，聚乙交酯，聚(丙交酯-共-乙交酯)，聚(-己内酯)，聚(三亚甲基碳酸酯)，聚(对-二噁烷酮)(poly(p-dioxanone))，聚(-己内酯-共-乙交酯)，聚(乙交酯-共-三亚甲基碳酸酯)聚(D，L-丙交酯-共-三亚甲基碳酸酯)，多芳基化合物，多羟基丁酸酯，聚酐，聚(酐-共-酰亚胺)，丙烯-共-富马酸酯，聚内酯，聚酯，聚碳酸酯，多阴离子聚合物，聚酐，聚酯-酰胺，聚(氨基酸)，均多肽，聚(磷腈)，聚(glaxanone)，多糖，和聚(原酸酯)，聚glactin，聚glatic acid，聚醛糖酸，聚丙烯酸，聚烷酸酯。
132.如权利要求126所述的组合物，其中所述的载体是选自以下物质的纤维素聚合物烷基纤维素，羟基烷基纤维素，甲基纤维素，乙基纤维素，羟基乙基纤维素，羟基丙基纤维素，羟基丙基-甲基纤维素，羧甲基纤维素，以及它们的阳离子盐。
133.如权利要求126所述的组合物，其中所述的载体是选自以下物质的合成或天然生物陶瓷碳酸钙，磷酸钙，磷灰石，生物活性玻璃材料，及源自珊瑚的磷灰石。
134.如权利要求126所述的组合物，其中所述的载体选自胶原，透明质素，血纤蛋白，脱乙酰壳多糖，海藻酸盐，及明胶。
135.如权利要求126所述的组合物，进一步包含选自以下物质的肝素结合剂硫酸葡聚糖，硫酸软骨素，硫酸乙酰肝素，岩藻聚糖，海藻酸盐。
136.如权利要求126所述的组合物，其中所述的载体是可流动形式凝胶。
137.如权利要求126所述的组合物，其中所述的载体是光可聚合的。
138.如权利要求126所述的组合物，其中所述的载体是温度敏感的。
139.如权利要求126所述的组合物，其中所述的组合物还包括选自以下物质的鳌合剂胶原，明胶，透明质酸，海藻酸盐，聚(乙二醇)，烷基纤维素(包括羟基烷基纤维素)，包括甲基纤维素，乙基纤维素，羟基乙基纤维素，羟基丙基纤维素，羟基丙基-甲基纤维素，和羧甲基纤维素，血，血纤蛋白，聚氧乙烯氧化物，硫酸钙半水合物，磷灰石，羧基乙烯基聚合物，或聚(乙烯基醇)。
140.如权利要求126所述的组合物，其中所述的组合物还包括选自以下物质的表面活性剂聚山梨酸酯80，聚山梨酸酯20或泊洛沙姆(Pluronic)F-68。
141.如权利要求126所述的组合物，其中所述的组合物还包括选自以下物质的缓冲剂甘氨酸，谷氨酸盐酸盐，氯化钠，胍，肝素，谷氨酸盐酸盐，乙酸，琥珀酸，聚山梨酸酯，硫酸葡聚糖，蔗糖，和氨基酸。
142.治疗病人以增加膜内骨形成的方法，包括按选定的时间间隔给予在有效剂型中的治疗有效剂量NELL1肽，以增强骨形成。
143.如权利要求142所述的方法，还包含在需要骨形成的部位给予选自以下物质的至少一种药剂TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，胶原，骨基质，韧带基质，或腱基质。
144.治疗病人以诱导骨形成的方法，包括收集哺乳动物骨生成细胞；增加与骨生成细胞接触的NELL1肽的浓度；在需要骨形成的部位给予该骨生成细胞。
145.如权利要求144所述的方法，其中所述增加与骨生成细胞接触的NELL1肽的表达浓度包括将包含NELL1肽的组合物施用于骨生成细胞。
146.如权利要求144所述的方法，其中所述增加与骨生成细胞接触的NELL1肽的浓度包含诱导NELL1肽的内原性表达。
147.如权利要求144所述的方法，其中所述增加与骨生成细胞接触的NELL1肽的表达浓度包括用表达NELL1肽的核酸构建物转染细胞。
148.如权利要求145、146或147所述的方法，其中所述NELL1肽选自SEQID NO2，SEQ ID NO4或SEQ ID NO6。
149.如权利要求145、146或147所述的方法，进一步包含在需要骨形成的部位给予至少一种选自以下物质的药剂TGF-β，BMP2，BMP4，BMP7，bFGF，胶原，骨，基质，韧带基质，腱基质，骨生成细胞或成骨细胞。
150.用于人体的一种植入物，包括一种基质，其中所述基质包含其量足以在该植入物的邻近处诱导骨形成的NELL1。
151.用于人体的一种植入物，包括一种基质，其具有的表面的至少一部分包含NELL1，其量足以在该植入物的邻近处诱导骨形成。
152.用于人体的一种植入物，包括一种基质，其具有的表面的至少一部分包含骨生成细胞，该基质包含其量足以诱导骨形成的NELL1。
153.如权利要求145、146或147所述的植入物，其中所述的基质被制成筛，针，螺丝，板，或假肢关节。
154.如权利要求145、146或147所述的植入物，其中所述的基质是可再吸收的。
155.如权利要求145、46或147所述的植入物，其中所述的基质包含胶原。
全文摘要
本发明总的涉及骨生长因子，更具体涉及包括NELL1的组合物、包括NELL1的制品，以及使用NELL1诱导骨形成的方法。本发明还提供NELL1和NELL2肽的表达和纯化方法。
文档编号C07K14/435GK101018562SQ200480009450
公开日2007年8月15日 申请日期2004年2月9日 优先权日2003年2月7日
发明者丁淦, 苏立奇·科罗达, 胡恩明 申请人:加州大学董事会