天然蝎毒多肽制备方法及其在骨髓造血功能保护的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种天然蜡毒多肤、及其制备方法和应用。具体设及一种从东亚错蜡 (Buthus martensii Karsch)的蜡毒中分离得到一种新的天然多肤，及其在制备骨髓造血 功能保护作用药物中的应用。 技术背景
[0002] 全世界蜡目分6科，70属，约800余种，中国境内主要为东亚错蜡，后者在历史上一 直作为我国传统、名贵中药之一的"全蜡"而享誉海内外。蜡毒为蜡尾节毒囊中排泌出来的 一种有毒分泌物，是全蜡治疗疾病的主要有效部位，其对肿瘤、疼痛、屯、血管疾病的疗效较 全蜡强数倍。蜡毒W毒攻毒的药理作用是建立在全蜡及蜡尾千百年来大量临床应用的基础 之上，具有鲜明的民族特色。
[0003] 蜡毒是一个巨大的生物资源宝库，其中大部分是具有药理学活性的多肤类。目前， 蜡毒中已分离出的蜡毒素大约有30种左右，主要是由35~70个氨基酸所组成的短肤，分 子量约在4000~9000D之间，抑变化对蜡毒素的毒性影响不大，在加热至100°C并持续 15~30min后，毒性依然较强。国外在蜡毒方面的研究始于十九世纪末，自上个世纪九十年 代W来，蜡毒作为研究离子通道的工具及制作抗毒血清的原料而成为国际上研究的重点。 从LQS蜡毒中分离出的氯毒素及charybdotoxin，对恶性神经胶质瘤细胞膜上的离子通道 有特异的亲和作用，细胞的恶性度越高，氯毒素对它们的亲和作用越强。氯毒素与同位素结 合后，其对胶质瘤的定向杀伤作用更为显著。此外，蜡毒素能够阻滞细胞膜的K+通道，同时 导致Ca"的内流减少，使肿瘤细胞的生长延缓。
[0004] 我国在蜡毒方面的研究虽然起步晚，但在中医临床验证及理论体系（攻毒散结、 通经活络、平肝焰风）的指导下，在抗肿瘤、抗痛、抗癒痛、抗凝、抗肝炎、抗风湿等领域均取 得了丰硕的成果。
[0005] 目前，国内外对蜡毒及其毒素（单一成分的纯品）抑制细胞生长的细胞生物学效 应及作用机理有较多的研究，而对于其保护骨髓造血功能和防护细胞应激性损伤（福射 等）等方面尚无类似报道。
[0006] 在W往的研究中，我们利用凝胶过滤层析技术，从东亚错蜡炬Uthusmartensii Karsch,BMK)蜡毒中分离得到了蜡毒多肤（Sco;rpionVenomPolyp巧tide,SVP)，并利用离 子交换层析技术从SVP中进一步分离得到了有效组分一一SVPIV和SVPV。实验表明，SVPIV 和SVPV对福射后小鼠的骨髓有核细胞数、骨髓粒单系祖细胞集落形成单位（CFU-GM)数 量、骨髓基质细胞集落数、脾结节数、骨髓细胞的增殖指数等均有升高的促进作用。其中， SVPIV促进造血细胞增殖的作用明显优于SVPV，而且前者应用30分钟后，还可促进小鼠骨 髓细胞磯酸化STAT3蛋白表达水平明显升高。经过改进分离方法，将蜡毒分成了S个组分 (SVPI、SVPII和SVPIII)。SVPII对福射后的骨髓造血细胞功能具有显著的保护作用， 并能导致福射后造血细胞白细胞介素-3受体（比-化ec巧tor,IL-3R)的高表达（参考文献 1-4)。上述的研究结果已被国外的研究者引用Salman(参考文献4)。Salman发现，全身福 射后的雄性豚鼠注射了从蜡毒炬uthusoccitanus)中分离的缓激肤激活因子化radykinin potentiatingfactor,BP巧后，血清总蛋白和白蛋白的水平均提高，认为从蜡毒中分离的 BPF能够促进生长因子和/或生长激素的分泌，进而增加肝脏蛋白质的合成，减轻福射损伤 作用。说明蜡毒多肤在促进细胞增殖和防护细胞应激性损伤（福射等）的药物开发方面具 有重要的意义。
[0007] 在近期实验中，申请者观察到从SVPII中进一步纯化出的单一天然蜡毒毒素多肤 纯品--蜡毒增殖肤（ScorpionVenomproliferativePeptidefromButhusmartensii Karsch，BmKpp)对骨髓造血功能的保护作用显著好于SVPII。
【发明内容】
[000引为解决上述技术问题，本发明人经过锐意研究，最终从东亚错蜡炬uthus martensiiKarsch)蜡毒中分离一种新的蛋白质，并证实了其在骨髓造血功能保护方面的 药用新用途。详细言之，本发明提供了：
[0009] (1) 一种多肤，其特征在于：具有SEQNo. 1所示的氨基酸序列。
[0010] (2)如（1)所述的多肤，其中所述多肤是从东亚错蜡的蜡毒中所分离得到的天然 多肤。
[0011] (3. -种保护骨髓造血功能的药物组合物，其特征在于含有SEQNo. 1的多肤。 [001引 （4)上述（1)或似所述多肤在制备保护骨髓造血功能的药物中的应用。
[0013] (5)上述（1)或（2)所述多肤的制备方法，其特征在于包括W下步骤：
[0014] S1通过电刺激法，从东亚错蜡活体中提取并收集新鲜毒液；
[0015] S2采用分子筛层析凝胶对所述毒液进行分离，并收集分离得到的第II峰处溶液；
[0016] S3通过离子凝胶柱对所述第II峰处溶液进行纯化，收集蜡毒组分II;
[0017] S4通过离子凝胶柱对所述蜡毒组分II进行二次纯化，收集目标峰处溶液；
[001引 做如妨所述的制备方法，其中，所述S2和S3中所使用的层析柱规格为lOOcmX5. 5畑1，洗脱液为地=6. 4的磯酸盐缓冲液进行梯度洗脱，A液为0. 05M磯酸盐缓 冲液（化-2册04/化畔04)，B液为含0. 3M氯化钢的A。
【附图说明】
[0019] 图1.BmKpp的高效液相色谱图
[0020] 图2.质谱分析法（MALDI-T0巧测定BmKpp的分子量为7217. 4Da
[0021] 图3.BmKpp对TBI后小鼠生存率的影响
[0022] 图4.BmKpp促进TBI后小鼠骨髓及外周血细胞恢复
[0023] 图5.BmKpp促进福射后小鼠骨髓细胞造血集落的形成
[0024] 图6.BmKpp对福射后骨髓细胞CAFC形成的影响
【具体实施方式】
[0025] 本发明将结合附图通过W下实施例作进一步说明。
[0026]W下的实施例均WBmKpp保护骨髓造血功能为例对本发明进行具体的阐述，但是 本发明的保护范围并不局限于此，本技术领域的普通技术人员通过W上内容也能实现本发 明的目的。
[0027]本发明的目的在于提供一种天然蜡毒多肤，该天然蜡毒多肤是从东亚错蜡 炬uthusmartensiiKarsch)蜡毒中分离的一种新的蛋白质。所述东亚错蜡可W为野生或 是任何一种市售的人工养殖的东亚错蜡，如乌鲁木齐县东亚错蜡良种繁育场、徐州新巧市 浩大蜡子养殖场、金华市天道有毒生物科技开发有限公司等市售的东亚错蜡。
[002引本发明的目的还在于提供一种天然蜡毒多肤的应用，其在骨髓造血功能保护方面 的药用新用途。
[0029] 本发明的目的还在于提供一种天然蜡毒多肤的制备方法，包括W下步骤：
[0030] (1)东亚错蜡蜡毒采集
[0031] 本实施方式中成年东亚错蜡取自东竞中科生物制药有限公司下属的有毒生物种 养殖基地，利用电刺激法提取新鲜毒液。采毒仪器；采用化-D药理生理实验多用仪（上海 益联科教设备有限公司生产）；仪器参数：连续脉冲25-30HZ，波宽0. 5-0. 7ms，电压6~8 伏；操作方法；用一电极夹