专利名称：牦牛骨髓蛋白多肽骨素及其组合物和制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明提供了一种牦牛骨髓蛋白多肽骨素、含有该蛋白多肽骨素的组合物，属药品、保健食品领域。
背景技术：
全世界共有牦牛1亿头左右，90％以上分布在青藏高原，只有少数分布在印度和尼泊尔靠近我国边境地区。牦牛肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富；牦牛奶品质好、无污染；牦牛骨髓素具有提高机体免疫功能，改善高原缺氧状态的功效。
早期研究表明，禽畜骨中含有的成分不仅仅含有人体必须的钙、磷等必须微量元素，同时也含有丰富的蛋白质、脂肪等营养成分。目前国际鲜骨加工的主要途径有冷冻粉碎法制成鲜骨泥，或通过高温、高压蒸煮水解法，常温、常压蒸煮水解法，酸水解或碱水解法，酶水解法等途径将骨水解提取胶原蛋白、氨基酸、脂肪等营养成分。通过上述方法制得的蛋白、多肽、氨基酸类产品主要包括骨胶、骨素等，提取物中含有较为丰富的蛋白质、多肽和氨基酸，其中主要以甘氨酸、羟脯氨酸和丙氨酸等含量较高，可作为机体重要的蛋白补充来源。
目前，现有技术生产的骨胶、骨素存在营养成分被破坏、营养不均衡、口感差的问题。这是因为生产过程使用了某些化学试剂或长时间高温高压作用，易造成某些不稳定氨基酸被破坏，使产品中营养成分难以均衡；另外由于生产过程中加入的酸、碱、酶等物质虽经过后处理，但不能完全除去其不良影响，造成产品口感较差，具有明显的涩味、苦味。
现有牦牛骨素是以新鲜牦牛骨为原料，经破碎、蒸煮、水解、过滤和真空浓缩等步骤制备而得的骨类抽提物(包括骨素和骨油等)，在浓缩得到骨类抽提物后骨油分离，得到呈浅褐色至深褐色膏体的牛骨清汤，干燥清汤，得到骨素粉。骨素中含有超过30％的蛋白质，有的甚至超过50％，远高于鲜肉(含蛋白质约20％)中蛋白质含量，大分子蛋白质降解为蛋白多肽和氨基酸，易于为人体消化吸收。但是生产工艺复杂，生产中用到诸多操作复杂的大型仪器设备，使得这些技术很难在经济欠发达、科技较落后的地区(如我国老少边穷地区)进行生产转化；同时由于牦牛骨质地十分坚硬，现有的工艺条件不能很好的对牦牛骨进行提取生产，现有生产工艺无法简便、有效利用牦牛骨生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种总氮含量高的牦牛骨髓蛋白多肽骨素。
本发明得到的牦牛骨髓蛋白多肽骨素，它含有如下重量百分比的成分总氮含量为13～15.8％、游离氨基酸以N计占1～3％、钙0.1～1％、总磷以P计占0.01～0.1％。
进一步地，牦牛骨髓蛋白多肽骨素含有如下重量百分比的成分它含有如下重量百分比的成分总氮含量为14～15.8％、游离氨基酸以N计占2～3％、钙0.8～0.9％、总磷以P计占0.03～0.07％。
本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素是由下述方法制备a、取牦牛骨蒸煮0.5～24小时，得蒸煮物；优选蒸煮时间是4～8小时；b、将步骤a所得蒸煮物油水分离，取水层；c、取步骤b所得水层，冷却，加酶水解1～10小时，得水解液；其中，所述的酶是胰酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、氨肽酶或按肽酶其中一种或多种；另乙酸(食品级)也可以在水解过程中替代酶发挥作用；优选胰酶为以动物新鲜胰脏为原料制备而成的胰酶，其中包含胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、氨肽酶和按肽酶等，具有良好的复合酶解蛋白功能。
胰酶与原料牦牛骨重量配比是1份∶100～600份；优选1份∶300份。
各种酶及乙酸用量、水解时间同胰酶用量及水解时间。
d、取步骤c所得水解液，过滤，得滤液；e、取步骤d所得滤液，浓缩，干燥，即得牦牛骨髓蛋白多肽骨素。
本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素中多肽和氨基酸含量丰富，蛋白质以总氮含量计高达81.25～98.75％。蛋白质根据总氮含量乘以相应的焦耳氮转换因子计算而得，常用系数为6.25，即蛋白质＝总氮含量*6.25。本发明产品蛋白质含量远远超过常规骨素蛋白质含量(常规骨素含有超过30％的蛋白质，有的甚至超过50％，但没有提及蛋白质含量可以超过80％)。通过对上述四种成分进行测定，有效达到质量控制的目的，保证本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素质量的稳定性。根据申请人现有临床应用，本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素的每日服用剂量为10g～30g，并可根据具体的剂型及临床需要，合理调整剂量。
由于制备过程中没有添加化学试剂，煎煮时间也较短，不稳定氨基酸被破坏较少，产品成分较均衡；加入的酶无需后处理，口感无明显异味，大分子蛋白质降解为蛋白多肽和氨基酸，易于为人体消化吸收，还保留了畜禽骨髓和肉中天然的香气成分，并具有浓厚的口感。针对牦牛骨髓蛋白多肽骨素的制备方法，步骤简便，使用的仪器设备简单，可操作性强，设备的简化既有利于该技术方案的实施，也有利于降低成本。
本发明还提供了一种用于提高机体免疫功能的组合物，它是含有以有效量牦牛骨髓蛋白多肽骨素为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成的药剂，也可以添加食品中、保健食品中可接受的添加剂或辅助性成分制备食品、保健食品等。
其中，所述的辅助性成分为植物添加剂，其重量配比为牦牛骨髓蛋白多肽骨素4-9份、植物添加剂1-6份；其中植物添加剂为香菇多糖、灵芝多糖、芦荟多糖、播娘蒿油等。
进一步地，它是由下述重量配比的原料制备而成牦牛骨髓蛋白多肽骨素与银耳多糖的重量配比为4～7份∶1～3份；或牦牛骨髓蛋白多肽骨素与香菇多糖的重量配比为7～9份∶1～3份；或牦牛骨髓蛋白多肽骨素与灵芝多糖的重量配比为8～9份∶1～2份；或牦牛骨髓蛋白多肽骨素与芦荟多糖的重量配比为4～7份∶1～3份；或牦牛骨髓蛋白多肽骨素与播娘蒿油的重量配比为4～7份∶3～6份。
优选牦牛骨髓蛋白多肽骨素与银耳多糖的重量配比为5份∶1份。
本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素及其组合物产品是口服制剂，根据市场需要可以在牦牛骨髓蛋白多肽骨素、牦牛骨髓蛋白多肽骨素与植物添加剂配伍使用的基础上，添加食品、保健食品或药品中可接受的辅料、辅助性成分、添加剂等制备而成，如可以制备片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、糊状食品等多种产品。
本发明还提供了制备该组合物的方法，包括如下步骤a、取牦牛骨蒸煮0.5～24小时，得蒸煮物；b、将步骤a所得蒸煮物油水分离，取水层；c、取步骤b所得水层，冷却，加酶水解1～10小时，得水解液；d、取步骤c所得水解液，过滤，得滤液；e、取步骤d所得滤液，浓缩，干燥，即得牦牛骨髓蛋白多肽骨素；f、取植物添加剂，按下述重量配比，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成常用的剂型牦牛骨髓蛋白多肽骨素4-9份、植物添加剂1-6份。
本发明还提供了牦牛骨髓蛋白多肽骨素及含有牦牛骨髓蛋白多肽骨素的组合物在制备具有提高机体免疫功能，改善高原缺氧状态的药品、食品或保健食品中的用途。
含有牦牛骨髓蛋白多肽骨素的组合物，添加了植物添加剂，营养成份不变，产品流动性好，具有良好的协同作用。也可以改善牦牛骨髓蛋白多肽骨素口感、吸湿性、流动性。
综上，本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素及含有该牦牛骨髓蛋白多肽骨素的组合物，制备方法简便，可操作性强，设备简单成本小；产品质量可控，蛋白质含量高，多肽、氨基酸种类多，口感好，吸收佳，为公众提供了一种新的补充蛋白质、多肽、氨基酸的产品。
图1本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素制备工艺图2本发明组合物的制备工艺图3蒸煮时间对蛋白质含量的影响图4蒸煮时间对游离氨基酸、钙和磷含量的影响图5水解酶量对游离氨基酸和水解度的影响图6水解时间对游离氨基酸和水解度的影响图7温度对高温喷雾干燥含水量和灰分含量的影响图8本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素和本发明组合物吸湿性的比较具体实施方式
实施例1牦牛骨髓蛋白多肽骨素的制备将洗净处理好的10kg牦牛骨放入蒸煮罐，加水至刻度，压力0.2-0.4MPa，加温至100℃蒸煮4小时。进行油水分离，收集油入存储罐待用，水层放入反应罐，加温并维持反应罐内溶液80℃的温度至少半小时，然后由夹层通入自来水降低锅内溶液温度至50℃，按1/300的酶/牦牛骨比加入需要量的胰酶，在搅拌器连续搅拌下开始酶解反应，期间调整通入反应锅夹层的蒸汽量使温度维持在50℃，加入NaOH稀溶液维持反应液的pH保持在8.0，自加入胰酶起6h后酶解反应结束，加大蒸汽的通入量使酶解液升温至80℃维持30min。牦牛骨髓提取蛋白多肽骨素采取高温喷雾干燥方式，干燥温度设置为300℃。
实施例2本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素的制备根据实施例1制备方法如图1，筛选蒸煮时间、水解酶量、水解时间、喷雾干燥温度制备牦牛骨髓蛋白多肽骨素，筛选结果见试验例1～4。
实施例3本发明骨素组合物的制备如图2所示，改变植物添加剂与牦牛骨髓蛋白多肽骨素的重量配比制备本发明组合物。重量配比如下牦牛骨髓蛋白多肽骨素∶银耳多糖＝700g∶200g；另500g∶100g；另700g∶300g。
牦牛骨髓蛋白多肽骨素∶香菇多糖＝700g∶200g；另900g∶300g；另800g∶100g。
牦牛骨髓蛋白多肽骨素∶灵芝多糖＝800g∶100g；另900g∶100g；另900g∶200g。
牦牛骨髓蛋白多肽骨素∶芦荟多糖＝700g∶200g；另400g∶100g；另400g∶300g。
牦牛骨髓蛋白多肽骨素∶播娘蒿油＝700g∶200g；另700g∶600g；另400g∶500g。
以下通过试验证明本发明制备方法、本分明牦牛骨髓蛋白多肽骨素与本发明组合物的有益效果。
试验例1筛选蒸煮时间试验将洗净处理好的10kg牦牛骨放入蒸煮罐，加水至刻度，压力2-4KG，加温至100℃蒸煮，时间设置为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24小时，测定其蒸煮液蛋白质及氨基酸等含量。试验重复3次，以三次平均为统计结果，结果见表1(如图3、图4)。
表1 筛选蒸煮时间
由实验结果可知，蒸煮4小时至24小时所得蒸煮液蛋白质含量几乎一致，游离氨基酸含量增高，为节约成本和保护热不稳定氨基酸成分，蒸煮时间以4小时为佳。
试验例2水解酶量效试验设置水解酶量与牦牛骨比例为1∶100，1∶200，1∶250，1∶300，1∶350，1∶400，1∶450，1∶500，1∶550，1∶600进行水解酶量试验，以确定水解酶的加入量效关系。
维持反应锅内溶液80℃的温度至少半小时，然后由夹层通入自来水降低锅内溶液温度至50℃，按不同酶/牦牛骨比加入需要量的胰酶，在搅拌器连续搅拌下开始酶解反应，期间调整通入反应锅夹层的蒸汽量使温度维持在50℃。不断在反应液中加入NaOH稀溶液使反应液的pH维持在8.0。自加入胰酶起6h后酶解反应结束，加大蒸汽的通入量使酶解液升温至80℃维持30min，试验重复3次，以三次平均为统计结果，结果见表2(如图5)。
表2水解酶量效试验
由实验结果可知，水解酶量以酶/牦牛骨比1∶100～1∶600时，随着酶量的增加，蒸煮液蒸煮液总氮含量几乎不变，游离氨基酸含量逐渐增加，出于生产成本的考虑，以酶/牦牛骨重量配比1∶300为佳。
试验例3水解工艺试验酶量以酶/牦牛骨比1∶300计，考察水解时间。设计水解时间分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9小时来观察时间对提取成分含量的影响。试验重复3次，以三次平均为统计结果，结果见表3(如图6)。
表3水解工艺试验
由实验结果可知，水解时间4小时至10小时，蒸煮液总蛋白含量几乎不变，游离氨基酸含量随时间延长而增加，出于节约生产时间考虑，以6小时为佳。
试验例4喷雾干燥试验试验重复3次，以三次平均为统计结果，结果见表4(如图7)。
表4喷雾干燥试验
由实验结果可知，干燥温度250～300℃含水量接近，以300℃干燥效果最好。
试验例5本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素吸湿性试验准确称取本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素(由实施例1制备)适量，置敝口扁称量瓶中，在25℃75％相对湿度条件下，按一定时间间隔称重，计算吸湿量和吸湿率(％)，结果见表5。
表5本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素吸湿性试验
从结果看，提取粉吸湿性很强，需加入适量辅料解决其吸湿性。
试验例6本发明组合物与牦牛骨髓蛋白多肽骨素吸湿性对比试验见图81、牦牛骨髓蛋白多肽骨素吸湿性试验准确称取牦牛骨髓蛋白多肽骨素(由实施例1制备)适量，置敝口扁称量瓶中，在25℃75％相对湿度条件下，按一定时间间隔称重，计算吸湿量和吸湿率(％)，结果见表6。
表6 牦牛骨髓蛋白多肽骨素吸湿性试验
上表结果显示，牦牛骨髓蛋白多肽骨素吸湿性很强，流动性较差，具有一定涩味，需加入适量辅料改善其吸湿性和流动性，以及一定程度上的矫味。
2、本发明组合物吸湿性及改善口感实验准确称取本发明组合物适量，置敞口扁称瓶中，在25℃，75％相对湿度条件下，按一定时间间隔称重，计算吸湿量和吸湿率(％)，并评价口感，牦牛骨髓蛋白多肽骨素∶银耳多糖重量配比及试验结果见表7表7本发明组合物吸湿性及改善口感实验
注可见提取原粉∶银耳多糖＝100∶20时，改善口感及流动性效果较好。
3、本发明组合物吸湿性试验准确称取本发明组合物(由实施例3制备牦牛骨髓蛋白多肽骨素∶银耳多糖＝5∶1)适量，置敞口扁称瓶中，在25℃，75％相对湿度条件下，按一定时间间隔称重，计算吸湿量和吸湿率(％)，结果见表8。
表8本发明组合物吸湿性试验
将表6、表8数据作图见图8，结果表明本发明组合物吸湿性明显低于牦牛骨髓蛋白多肽骨素。
试验例7 本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素稳定性考察试验设置温度、湿度考察本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素稳定性，时间分别为0、3、6、9、12、16、18、24个月，全检测定，结果见表9。
氨基酸测定(按GB/T 5009.124-2003执行)具体步骤如下1、称样准确称取一定量均匀性好的本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素，精确到0.0001g(使本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素蛋白质含量在10mg～20mg范围内)，将称好的本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素放于水解管中。
2、水解在水解管内加6mol/L盐酸10mL～15mL(视本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素蛋白质含量而定)，加入新蒸馏的苯酚3滴-4滴，再将水解管放入冷冻剂中，冷冻3min-5min，再接到真空泵的抽气管上。抽真空(接近0Pa)，然后充入高纯氮气；再抽真空充氮气，重复三次后，在充氮气状态下封口或拧紧螺丝盖将已封口的水解管放在110℃±1℃的恒温干燥箱内，水解22h后，取出冷却。
打开水解管，将水解液过滤后，用去离子水多次冲洗水解管，将水解液全部转移到50mL。容量瓶内用去离子水定容。吸取滤液1mL于5mL容量瓶内，用真空干燥器在40℃～50℃干燥，残留物用1mL～2mL水溶解，再干燥，反复进行两次。最后蒸干，用1mLpH2.2的缓冲液溶解，供仪器测定用。
3、测定准确吸取0.200mL混合氨基酸标准，用pH2.2的柠檬酸钠缓冲液稀释到5mL，此标准稀释液浓度为5.00nmol/50μL，作为上机测定用的氨基酸标准，用氨基酸自动分析仪以外标法测定本发明组合物测定液的氨基酸含量。
4、结果计算按下式计算X=c×150×F×V×Mm×109×100]]>式中X——本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素氨基酸的含量，单位为克每百克(g/100)；c——本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素测定液中氨基酸含量.单位为纳摩尔每50微升(nmol/50μL)；F——本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素稀释倍数；V——水解后本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素定容体积，单位为毫升(mL)；
M——氨基酸分子量；m——本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素质量，单位为克(g)；1/50——折算成每毫升本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素测定的氨基酸含量，单位为微摩尔每升(μmol/L)；109——将本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素含量由纳克(ng)折算成克(g)的系数。
十六种氨基酸分子量天冬氨酸133.1；苏氨酸119.1；丝氨酸105.1；谷氨酸147.1；脯氨酸；115.1；甘氨酸75.1；丙氨酸89.1；缬氨酸117.2；蛋氨酸149.2；异亮氨酸131.2；亮氮酸131.2；酪氨酸18I.2；苯丙氨酸165.2；组氨酸155.2；赖氨酸146.2I精氨酸174.2。
表8检测结果
试验证明本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素稳定性良好，贮存24个月后，产品成分稳定，蛋白质、氨基酸含量稳定。
综上，本发明牦牛骨髓蛋白多肽骨素蛋白质、多肽和氨基酸含量丰富，蛋白质含量可达80％以上，制备过程未添加化学试剂，煎煮时间较短，不稳定氨基酸被破坏较少，产品成分较均衡；水解酶无需后处理，口感浓厚、无明显异味。牦牛骨髓蛋白多肽骨素的制备方法，步骤简便，使用的仪器设备简单，可操作性强，设备的简化既有利于该技术方案的实施，也有利于降低成本。含有该牦牛骨髓蛋白多肽骨素的组合物，添加了植物添加剂，营养成份不变、产品流动性好，具有良好的协同作用；也可以改善牦牛骨髓蛋白多肽骨素口感、吸湿性、流动性。为公众提供了一种新的补充蛋白质、多肽、氨基酸的产品。
权利要求
1.牦牛骨髓蛋白多肽骨素，其特征在于它含有如下重量百分比的成分总氮含量为13～15.8％、游离氨基酸以N计占1～3％、钙0.1～1％、总磷以P计占0.01～0.1％。
2.根据权利要求1所述的牦牛骨髓蛋白多肽骨素，其特征在于它含有如下重量百分比的成分总氮含量为14～15.8％、游离氨基酸以N计占2～3％、钙0.8～0.9％、总磷以P计占0.03～0.07％。
3.根据权利要求1或2所述的牦牛骨髓蛋白多肽骨素，其特征在于它是由下述方法制备a、取牦牛Bos grunniens骨蒸煮0.5～24小时，得蒸煮物；b、将步骤a所得蒸煮物油水分离，取水层；c、取步骤b所得水层，冷却，加酶水解1～10小时，得水解液；d、取步骤c所得水解液，过滤，得滤液；e、取步骤d所得滤液，浓缩，干燥，即得牦牛骨髓蛋白多肽骨素。
4.根据权利要求3所述的牦牛骨髓蛋白多肽骨素，其特征在于步骤a所述的蒸煮时间是4～8小时。
5.根据权利要求3所述的牦牛骨髓蛋白多肽骨素，其特征在于步骤c所述的酶是胰酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、氨肽酶或按肽酶其中一种或多种；其中，胰酶与原料牦牛骨重量配比是1份∶100～600份。
6.一种用于提高机体免疫功能的组合物，它是含有以有效量的权利要求1-5任一项所述的牦牛骨髓蛋白多肽骨素为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成的药剂。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于所述的辅助性成分为植物添加剂，其重量配比为牦牛骨髓蛋白多肽骨素4-9份、植物添加剂1-6份；其中植物添加剂为香菇多糖、灵芝多糖、芦荟多糖、播娘蒿油。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于它是由下述重量配比的原料制备而成牦牛骨髓蛋白多肽骨素与银耳多糖的重量配比为4～7份∶1～3份；或牦牛骨髓蛋白多肽骨素与香菇多糖的重量配比为7～9份∶1～3份；或牦牛骨髓蛋白多肽骨素与灵芝多糖的重量配比为8～9份∶1～2份；或牦牛骨髓蛋白多肽骨素与芦荟多糖的重量配比为4～7份∶1～3份；或牦牛骨髓蛋白多肽骨素与播娘蒿油的重量配比为4～7份∶3～6份。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于所述的牦牛骨髓蛋白多肽骨素与银耳多糖的重量配比为5份∶1份。
10.一种制备权利要求6-9任一项的组合物的方法，包括如下步骤a、取牦牛骨蒸煮0.5～24小时，得蒸煮物；b、将步骤a所得蒸煮物油水分离，取水层；c、取步骤b所得水层，冷却，加酶水解1～10小时，得水解液；d、取步骤c所得水解液，过滤，得滤液；e、取步骤d所得滤液，浓缩，干燥，即得牦牛骨髓蛋白多肽骨素；f、取植物添加剂，按下述重量配比，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备成常用的剂型牦牛骨髓蛋白多肽骨素4-9份、植物添加剂1-6份。
11.权利要求6-9任一项所述的组合物在制备具有提高机体免疫功能、改善高原缺氧状态的药品或保健食品中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种牦牛骨髓蛋白多肽骨素，它含有如下重量百分比的成分蛋白质总氮含量为13～15.8％、游离氨基酸(以N计)1～3％、钙0.1～1％、总磷(以P计)0.01～0.1％，蛋白质含量高达80％以上，多肽、氨基酸种类多。针对牦牛骨髓蛋白多肽骨素的制备方法，步骤简便，使用的仪器设备简单，可操作性强，设备的简化既有利于该技术方案的实施，也有利于降低成本。含有该牦牛骨髓蛋白多肽骨素的组合物，添加了植物添加剂，改善骨素口感、吸湿性、流动性。产品质量可控、口感好、吸收佳，为公众提供了一种新的补充蛋白质、多肽、氨基酸的产品。
文档编号A61K31/715GK101081232SQ20061002107
公开日2007年12月5日 申请日期2006年6月1日 优先权日2006年6月1日
发明者费小凡, 罗霞, 余梦瑶, 叶利明, 曹定知, 许晓燕, 杨士明, 江南 申请人:四川省中医药研究院