专利名称：经修饰的牛g-csf多肽和其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及任选经至少一个非天然编码氨基酸修饰的牛粒细胞集落刺激因子 (bovine granulocyte-colony stimulating factor，bG-CSF)多月太。
背景技术：
大量文献曾报导感染性疾病对食用动物生产的经济影响。感染性疾病会降低收益，增加生产成本，并危及食品，而且还会影响动物的行为特性、健康和福利。疾病可降低产奶量和奶质，使奶农和牛肉生产商蒙受巨大经济损失，尤其是在一些情况下，感染性微生物疾病造成新生动物、幼小动物(例如后备家畜)或成年动物发病和死亡时更是如此。两种此类疾病，乳腺炎和牛呼吸系统疾病(bovine respiratory disease，BRD)，可能对食用动物的生产造成破坏性影响。乳腺炎定义为乳腺的发炎。这种病可影响任何动物，例如母牛、绵羊和山羊。牛乳腺炎是主要由革兰氏阳性(gram positive)细菌和革兰氏阴性(gramnegative)细菌所引起的如奶牛等反刍动物，尤其是乳品深加工单元中的奶牛乳房的感染。细菌感染导致乳腺(即，奶头和乳房)发炎。动物可能会因在围产期期间中性粒细胞杀微生物功能削弱而比较易于患上乳腺炎。由于在挤奶过程中易于将病原体从一动物转移到另一动物，使得这种疾病特别麻烦，并且在经济方面相当重要。其通常在分娩期左右的前几周发生，并且会随着每一次哺乳而复发。一些引起牛乳腺炎的主要病原性微生物为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、 乳房链球菌(Streptococcus uberis)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、 大肠杆菌(Escherichia coli)、产气杆菌(Aerobacter aerogenes)、月市炎克氏杆菌 (Klebsiellapneumoniae)禾口绿月农杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。还参见牛乳腺炎 (BovineMastitis)，格雷尼布鲁姆福德(Glenys Bloomfield)编辑，V&0出版公司，1987，其以引用的方式并入本文中。这些微生物经由乳头管侵入乳房，并使产奶组织发炎，导致形成瘢痕组织，而瘢痕组织一旦形成，就可能引起奶牛产奶量的持久降低。感染还将改变奶的组成、数量、外观和品质。引起乳腺炎的病原体分为两类，即，传染性病原体和环境性病原体。 传染性细菌，例如无乳链球菌和金黄色葡萄球菌，主要定殖于宿主组织部位，例如乳腺、乳头管和乳头皮肤病变；并且在挤奶过程中，从一头受感染的奶牛传播到另一头。环境性细菌，通常为链球菌属(str印tococci)、肠球菌(enterococci)和大肠菌群有机体，一般存在于奶牛的周围，来自诸如奶牛粪便、土壤、植物物质、草垫或水等来源；并且通过与动物的机会性致病接触而发生感染。传染性病原体与环境性病原体之间的差别虽然不具有排他性， 但具有实际意义，因为不同微生物群需要不同的乳畜群维护措施。在所有牛乳腺炎病例中， 无论致病性微生物是什么，侵入乳房内腺中的病原体都是通过乳头管口和乳头管传播。有害微生物的常见来源包括不卫生的挤奶设备、挤奶员、其他患乳腺炎的动物、不卫生的稳定环境以及动物自身的排泄(排便/排尿)过程。根据不同严重程度和症状学，牛乳腺炎存在多种形式或类型，包括下列(1)乳房感染微生物侵入乳房腔，在腺体内繁殖并引起发炎；(2)非临床型或亚临床型乳腺炎，此种形式的乳腺炎不存在腺体肿胀或奶中不能观察到异常，但借助于特殊测试可以检测到奶中的变化。到目前为止，此类乳腺炎最为流行，并且在大多数畜群中引起的总损失最大。其通常称为“隐性”乳腺炎(3)临床型乳腺炎，此种形式的乳腺炎可以观察到异常的乳房和分泌情况。轻度临床型乳腺炎涉及奶质改变，例如结片、结块和水样或不常见的外观。乳房略微发热和敏感，或者没有出现发热和敏感情形，但可能发生肿胀的征象。重度临床型乳腺炎涉及突然发作，伴随受感染部分的肿胀，发热、变硬并且变得敏感。奶质呈现异常，并且产奶量降低。有时，除发生乳房的局部影响外，奶牛本身也变得虚弱。出现发烧、数脉、抑郁、虚弱和食欲不振等征象。这些病状的组合通常称为急性全身性乳腺炎，因为不仅乳房，而且动物的全身都受到影响；和(4)慢性乳腺炎，此种形式乳腺炎是由持续性乳房感染引起，这种持续性乳房感染大部分时间以非临床形式存在，但偶尔也可能发展成活动型临床形式。在这些“突然短期爆发(flare-up)”后，一般会暂时恢复到非临床形式。(一般参见现代牛乳腺炎观点(Current Concepts of Bovine Mastitis)，美国国家乳腺炎协会公司(National Mastitis Council, Inc.)出版，第 2 版，1978，第 5 页。)乳腺炎不断为乳品工业带来巨大经济损失。乳腺炎通过多种方式直接和间接影响着畜群的收益性，包括(1)降低产奶量；( 升高受感染奶牛的淘汰率；C3)降低奶的营养价值；⑷丢弃经过抗生素处理的奶；(5)兽医成本(抗生素和兽医探访)；和(6)死亡。(牛乳腺炎(Bovine Mastitis)，格雷尼布鲁姆福德(Glenys Bloomfield)，同上文，第33页。)影响养牛业的另一常见疾病是运输热(shipping fever)(牛呼吸系统疾病或 BRD)。有时，出于以下两个原因将BRD称为“疾病综合症”其通常由多种病原体引起，包括病毒和细菌，这些病原体彼此相互作用，引起完全型疾病，并且由于病原体的表现遵循一个循序渐进的过程，由此逐步使动物变虚弱。细菌病原体是引起急性综合症的最常见的原因之一。细菌病原体可能在牛呼吸道受到病毒感染以及例如断奶、运输、饲料改变和环境温度及湿度变化应激等其他因素损害之后、之前侵入，并引起感染。在许多情况下，当将不同来源的牛混装在卡车、牲畜围场和拍卖棚中时，这些牛在运输期间暴露于病原体的几率增加， 导致递送到饲养场的牛具有较高的疾病发生率。已经分离出数种与BRD相关的细菌，并且其中一些最常见的为溶血性曼氏杆菌 (Mannhemia haemolytica)、多杀巴斯德杆菌(Pasteurella multocida)禾口 (或)睡眠嗜组织菌(Histophilus somni)。睡眠嗜血杆菌(Haemophilus somnus)是一种剧毒病原体， 可使牛发生败血病，且有时将其引起的表现称为“睡眠嗜血杆菌综合症”，其中一种形式为呼吸系统疾病，诸如感染性牛鼻气管炎(infectiousbovine rhinotracheitis, IBR)、牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea, BVD)和牛呼吸道合胞病毒(bovine respiratory syncytial virus, BRSV)等病毒也可能涉及引发BRD综合症，常使继发性细菌感染成为可能。由于实际上不太可能将这些有机体从环境中消除，使得从防止这些致病因素造成影响，以及检测和治疗临床病例的观点看，必须尽可能快速且有效地处理BRD综合症。 呼吸系统疾病是造成肉牛疾病损失的主要原因。人们普遍认识到，在大部分运输热病例中，导致死亡的最终原因是细菌性(常为巴斯德氏菌属)肺炎。在北非，溶血性巴斯德菌 (Pasteurella haemolytica)，尤其是IA型溶血性巴斯德菌，是从呼吸系统疾病病例中分离出的最常见细菌。针对运输热所涉及的一些感染物进行疫苗接种有时非常有帮助，但疫苗只能有效用于已知涉及疾病综合症的仅少数感染物。抗生素疗法是乳腺炎和BRD控制策略的主要组成部分。美国专利第7，182，948号 (以全文引用的方式并入本文中)指出，经显示，含碘的抗微生物乳头浸液可有效对抗乳房感染以及引起乳腺炎的细菌(帕克雷J.W. (Parrkey, J. W.)等人，(1983)乳品科学杂志 (J. Dairy Sci.) 66 (1), 161167) 0这些组合物常常通过在挤奶之前以及移开挤奶杯后浸渍或喷涂乳头来对乳头投予。为了减少乳腺炎的发生，已经开发出含有多种抗微生物剂的市售乳头浸液，这些抗微生物剂包括碘消灵(iodophor)、季铵化合物、释放氯的化合物(例如碱金属次氯酸盐)、氧化性化合物(例如过氧化氢、过酸类)、质子化羧酸类(例如庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸)、酸阴离子剂(例如烷基芳基磺酸)、二氧化氯(来自亚氯酸盐)， 和双胍类(bisbiguanide)，例如氯己定(chlorhexidine)。这些具有不同效力程度的药剂通过减少乳头上的病原体群，限制乳腺炎的传播。然而，使用这些抗微生物剂会引起一些问题。最普遍的是引起乳头刺激以及乳头开裂。为了缓和这些问题，这些组合物中已经包括润肤性添加剂，例如甘油和羊毛脂。但是，即使利用了这些润肤剂，仍会存在皮肤刺激。美国专利第6，790，867号(以全文引用的方式并入本文中)指出，皮下注射组合了非类固醇消炎药(non-steroidal anti inflammatory drug, NSAID)(例如氟尼辛(fIunixin))与氟化氯霉素(fluorinated chloramphenicol)或甲砜霉素 (thiamphenicol)衍生物抗生素(例如氟苯尼考(florfenicol))的调配物，可用来治疗 BRD。美国专利申请公开案第20070155799号(以全文引用的方式并入本文中)揭示了可用作抗生素前药且与NSAID或其他抗生素类组合的新颖苯尼考(fenicol)化合物。NMC(以前的美国国家乳腺炎协会；一个致力于减少乳腺炎和增强奶质的非盈利性组织)强调了适当乳头卫生以及适当的乳头护理对于预防乳腺炎的重要性。乳腺炎所造成的经济损失引起了越来越多的针对乳腺炎控制的研究。据报导，身体应激以及环境条件是乳腺炎感染的主要原因。参见美国专利公开案第20020051789号，以引用的方式并入本文中。由于有文献报导，亚临床型乳腺炎与乳头不良状况直接相关(雷杰惠斯 P. (Neijenhuis，P.)等人，(2001)乳品科学杂志(J. Dairy Sci.) (84)洸6似672)，已经开发出并入调节剂的大量市售乳头浸液(美国国家乳腺炎协会，关于1980年以来公开的有关挤奶前和挤奶后乳头消毒剂的功效的同行评审出版物的综述(Summary of Peer-Reviewed Publicationson Efficacy of Premilking and Postmilking Teat Disinfectants Published Since 1980) ；2002年1月)。经显示，乳尖硬结和粗糙与临床型乳腺炎具有直接关系(雷杰惠斯 F. (Neijenhuis，F.)等人，(2001)乳品科学杂志(J. Dairy Sci.) (84) 2664 2672) 0减少乳头皲裂和刺激以及保持乳头柔软对于控制乳房感染十分重要。也曾在乳头浸液中使用甘油作为乳头调节剂。然而，研究表明，当含碘的乳头浸液中，甘油含量从 2%增加到10%时，诸如金黄色葡萄球菌、无乳链球菌或大肠菌群等引起乳腺炎的细菌没有明显减少(美国国家乳腺炎协会，1980年以来公开的有关挤奶前和挤奶后乳头消毒剂的功效的同行评审出版物的综述(Summary ofPeer-Reviewed Publications on Efficacy of Premilking and Postmilking TeatDisinfectants Published Since 1980) ；2002 年 1 月)。因此，尽管可以使用诸如乳头浸液等产品，但调节乳腺炎发生、复发和/或严重程度的需求仍未得到满足。
美国专利第5，849，883号(以全文引用的方式并入本文中)揭示了大量用于治疗乳腺炎的抗生素，包括(但不限于)内酰胺抗生素，例如青霉素类(penicillin) (氨必西林(ampicillin)、氯唑西林(cloxacillin)、海他西林(hetacillin)、萘夫西林(nafcillin)、青霉素G(苯甲基青霉素)、普鲁卡因(procaine)青霉素)和头 ？包菌素类(cephalosporin)(头孢哌酮(cefoperazone)、头孢呋辛(cefuroxime)、 头孢洛宁(Cefalonium)、头孢匹林(cefapirin)、头孢噁唑(cefoxazole)、头孢乙腈 (cefracetrile))；氨基糖苷类抗生素(新霉素B (framycetin)、新霉素(neomycin)、 新生霉素(novobiocin)、链霉素(str印tomycin))；大环内酯类抗生素(红霉素 (erythromycin))；四环素类(tetracycline)(氯四环素、氧四环素)；和多肽抗生素(多粘菌素(Polymyxin B))。乳腺炎的抗生素治疗常常是通过对检测到临床型乳腺炎的哺乳期奶牛或者在干乳期(干乳疗法(dry cow therapy))进行乳房内输注来给予。(牛乳腺炎，同上文，第69页。)在存在重度临床疾病的情况下，由于乳房内输注会因管堵塞而无效，以致抗生素必须经不经肠给予。早期关于抗生素能完全控制疾病的希望并未实现。迄今所利用的上文提到的抗生素都不能完全令人满意。此外，人们发现，出于以下原因，特别需要用非抗生素类化疗用药物化合物的治疗来代替抗生素治疗(1)为了不逐步形成在人类疾病中出现的细菌菌株耐药性，所以不应将人类医学中有效的抗生素用于兽医用药；( 应保存抗生素来针对不可使用化疗用药物化合物的疾病，因为据证实，在长期使用某种抗生素后，细菌菌株将逐步形成对这种抗生素的耐药性；和C3)金黄色葡萄球菌(上文提到过的一种病原体)已经对用于治疗牛乳腺炎的大部分抗生素都逐步形成耐药性。美国专利第4，610，993号(以引用的方式并入本文中)中描述此类利用非抗生素类化疗用药物化合物进行治疗的一种方法，该专利主张一种利用有效量的至少一种N-氧化吡啶二硫化物化合物治疗动物的牛乳腺炎的方法。美国专利第4，401，666号(以引用的方式并入本文中)中描述相同发明人提出的另一种方法，该专利主张一种利用有效量的至少一种2-硫酮-N-氧化吡啶的金属盐来治疗动物的牛乳腺炎的方法。尽管提出了这几种公开的方法，但发现利用非抗生素类化合物的节省成本的方法仍然很重要，这些非抗生素类化合物实质上克服了迄今所使用的抗生素的缺点，并且能有效治疗和预防乳腺炎。影响养牛业的另一常见疾病是运输热(shipping fever)(牛呼吸系统疾病)。呼吸系统疾病是造成肉牛疾病损失的主要原因。术语“运输热”用于描述在将6个月大或更大的牛运输到饲养场中或牧场上后所观察到的呼吸系统疾病综合症。断奶、阉割、去角、禁食、拥挤、暴露于感染物、饮食改变、运送、极端环境温度和其他应激物应激与病毒、细菌、支原体和/或衣原体感染组合可引起运输热综合症。混合来自不同农场和/或卖场的小牛极为容易暴露于感染物。美国专利第6，497，869号(以引用的方式并入本文中)描述一些可能影响到牛的初始感染物。对于运输热，群体混合可能是比应激物更重要的诱病因素，但疾病也可能在未混合的情况下发生，并且应激物常常会使呼吸系统疾病显著恶化。降低断奶、 阉割、去角等引起的应激以及在运输前使牛适应新的饮食数天或数周的尝试有时能成功地 (但不太节省成本)降低运输热的发生率。针对运输热所涉及的一些感染物进行疫苗接种有时非常有用，但疫苗只能有效用于已知涉及疾病综合症的仅少数感染物。人们普遍认识到，在大部分运输热病例中，导致死亡的最终原因是细菌性(常为巴斯德氏菌属)肺炎。在北非，溶血性巴斯德菌，尤其是IA型溶血性巴斯德菌，是从呼吸系统疾病病例中分离出的最常见细菌。通过实验再现牛细菌性肺炎但不对呼吸道带来严重应激和诱病性损害的尝试往往不成功。人们普遍相信，在应激期间，病毒、支原体和/或衣原体最常提供对呼吸道的初始损害，从而易于诱发重度细菌感染和疾病。典型的临床型呼吸系统疾病发作常常是在牛到达饲养场数小时或数天内开始。新近运输的体重在400到500磅范围内的牛的呼吸道疾病发病率为10到80%或更高，且死亡率为1到10%或更高。当牛血清中抗体经过分析4倍升高(血清转化)以及分离呼吸道和其分泌物中的微生物时，可以鉴别出无数种病原体。许多动物，无论是虚弱动物还是看起来健康的动物，都显示曾受到过一种或一种以上感染物感染(呼吸道疾病可能很少仅由于一种感染物)。尽管到达后，在饲养场中临床上识别出牛呼吸系统疾病综合症，但引起临床型疾病的感染可能在卖场中初次将来自不同农场的牛集合在一起时就开始了。还参见牛呼吸系统疾病(Bovine Respiratory Disease)，劳恩R. W. (Loan，R. W.)，德克萨斯农工大学出版社(Texas A & M University Press)，1984，以引用的方式并入本文中。投予治疗牛乳腺炎或呼吸系统疾病或者非人类动物(包括(但不限于)牛、家禽、 猪、马、狗和猫)的其他感染或调节所述感染发生、复发、持续时间和/或严重程度的化合物将适用于兽医学中。这些感染的实例包括(但不限于)马新生期败血病、猪胸膜肺炎和非人类动物的肺炎。这些化合物可恢复或调节动物体内中性粒细胞的功能。生长激素(GH)超基因家族(贝赞F. (Bazan,F.)，现代免疫学(Immunology"Today)， 11 :350-354(1991)；莫特 H. R. (Mott, H. R.)和坎贝尔 I. D. (Campbell, I. D.)，结构生物学的当前观点(Current Opinion in Structural Biology) 5 :114-121 (1995)；西文诺曼0. (Silvennoinen, 0.)和艾利J.N. (Ihle，J. N.) (1996)造血细胞因子受体的信
^ (S1GNALINg BY the HematopoieTIC CYToKINERECEpTOES ))代表了一组具有类似结构特征的蛋白
质。这一蛋白质家族的每一成员都包含一个四螺旋束。尽管这一家族中仍有较多的成员有待鉴别，但一些家族成员包括下述生长激素、催乳激素、胎盘催乳质、促红细胞生成素(erythropoietin, ΕΡ0)、血栓形成素(thrombopoietin, ΤΡ0)、白细胞介素-2 (IL-2)、 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-IU IL_12(p35 亚单元)、IL-13、IL-15、制瘤素M、睫状神经营养因子、白血病抑制因子、α干扰素、β干扰素、Y干扰素、ω干扰素、τ干扰素、ε干扰素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF) >
(macrophage colony stimulating factor，M—CSF)禾口营胃素 (cardiotrophin_l， CT-1)( “GH超基因家族”)。GH超基因家族的成员具有类似的二级和三级结构，尽管其通常具有有限的氨基酸或DNA序列一致性。共有的结构特征使得易于鉴别出基因家族的新成员。四螺旋束多肽描述于名为“经修饰的人四螺旋束多肽和其用途(Modified Human FourHelical BundlePolyp印tides and Their Uses) ” 的 WO 2005/074650 中，该案以全文引用的方式并入本文中。GH超基因家族的成员为粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)是数种称为集落刺激因子(CSF)的糖蛋白生长因子中的一者，因为其能支持造血祖细胞的增殖。G-CSF可刺激特定骨髓前体细胞增殖以及其分化成粒细胞。G-CSF与其他CSF的差别在于，其能够刺激中性粒细胞在半固体琼脂中形成集落，并在活体外诱导鼠类骨髓单核白血病细胞终末分化。粒细胞集落刺激因子是活体内中性粒细胞增殖和成熟的有效刺激物(克汗(Cohen)等人，美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci.) 1987 ； 84 =2484-2488 ；还参见贺达瑞(Heidari)等人，兽医免疫学和免疫病理学(Vet. Immunol. Immunopatho 1. )2001 ；81 =45-57,以引用的方式并入本文中)。G-CSF还能够在活体外诱导功能活化或者使中性粒细胞“预致敏”或成熟(维斯波特R. H. (ffeisbart, R. H.)，盖森 C.G. (Gasson, C. G.)和 D. W.格雷德(D. W. Golde.)内科学年鉴(Annals of Internal Medicine) 1989 ；110 :297-303)。经显示，G-CSF可使人粒细胞预致敏，并增强由趋化肽N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基-苯丙氨酸所刺激的超氧化物释放(S.北川(S. Kitagawa) 等人，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem. Biophys. Res. Commun.) 1987 ； 144 1143-1146 ；和 C. F.纳萨曼(C. F. Nathan)，血液学(Blood) 1989 ；74 :301-306)，并且活化人中性粒细胞IgA介导的胞噬作用(维斯伯特R. H. (ffeisbart, R. H.)等人，自然 (Nature) 1988；332 :647-649)。中性粒细胞是宿主针对细菌和真菌感染的防御机制的关键组分。G-CSF能够诱导增加绝对数量的循环中性粒细胞，并增强中性粒细胞的功能。已经描述重组人G-CSF (hG-CSF)的cDNA克隆和表达，并且已经确定，重组hG_CSF 展现天然分子的大部分(如果不是全部的话)生物特性(索泽L. (Souza, L.)等人，科学 (Science) 232，61-65 (1986) )。cDNA和基因组DNA克隆的序列分析允许推导出氨基酸序列， 并且揭露这一蛋白质是204个氨基酸长，且具有含30个氨基酸的信号序列。成熟蛋白质为 174个氨基酸长，并且不具有潜在的N连接糖基化位点，但存在数个可能的0连接糖基化位点ο两个研究组曾描述过编码人G-CSF的cDNA的克隆和表达(永田S. (Nagata, S.)等人，自然(Nature) 319，415-418 (1986)；索泽 L. Μ. (Souza, L. Μ.)等人，科学(Science) 232， 61-65(1986))。首个有关G-CSF cDNA克隆的报导提出，成熟蛋白质为177个氨基酸长。作者报导，其也已经鉴别出G-CSF的cDNA克隆，这一克隆编码缺乏具有3个氨基酸的链的蛋白质。这一较短形式的G-CSFcDNA将表现出预期的G-CSF活性。第二项报导描述与所述较短形式一致的cDNA序列，并且没有提到其他变异体。由于这些作者确定，所述短cDNA表达具有预期的生物活性特征的G-CSF，使得有可能这一形式为G-CSF的重要形式，且较长形式为次要剪接变异体或是克隆人工产物的结果。松本(Matsumoto)等人在感染与免疫杂志Qnfection and Immunity)(第55卷， 第11期，第2715页(1987))中论述了人G-CSF对中性粒细胞减少小鼠的微生物感染的保护作用。以下专利公开案涉及G-CSF :W0 8703689(以引用的方式并入本文中)描述产生人 G-CSF特异性单克隆抗体的杂交瘤和其用于纯化G-CSF的用途；W08702060(以引用的方式并入本文中)揭示了类人G-CSF的多肽及其制造方法；美国专利第4，810，643号(以引用的方式并入本文中)揭示了类人G-CSF的多肽、编码所述多肽的序列及其制造方法；以及WO 8604605和WO 8604506(以引用的方式并入本文中)揭示了编码人G-CSF的基因及含有人 G-CSF的感染抑制剂。h-GCSF的分离以及宿主细胞(例如大肠杆菌)中G-CSF的制造描述于例如美国专利第4，810，643号、第4，999，291号、第5，580，755号和第6，716，606号中， 这些专利都以引用的方式并入本文中。
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G-CSF是一种具有医药活性的蛋白质，其可调控中性粒细胞的增殖、分化和功能活化(米特卡夫(Metcalf)，血液学(Blood)67 =257(1986)；严(Yan)等人，血液学， 84(3) :795-799(1994)；本斯尼格(Bensinger)等人，血液学，81 (11) :3158-3163(1993)； 罗伯兹(Roberts)等人，实验血液学(Expt ‘ 1 Hematology) 22 :1156-1163 (1994)；尼本(Neben)等人，血液学，81 (7) :1960-1967(1993)；维尔特(Welte)等人，PNAS-USA 82 1526-1530(1985)；索泽(Souza)等人，科学(Science) 232 :61-65 (1986)；和盖博拉夫 J. (Gabrilove，J.)，血液学研讨会杂志(Seminars in Hematology) 26 :21-14 (1989))。从人膀胱癌细胞系5637的细胞培养物上清液中纯化出均质的G-CSF(维尔特(Welte)等人，美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci) (1985)82 :1526-30)。编码天然 hG_CSF 的 cDNA 序列自索泽(Souza)等人，科学(Science) (1986)232 :61-65获知。作为在第二个内含子中进行替代性剪接的结果，两种天然存在形式的hG-CSF具有204或207个氨基酸，其中前 30个氨基酸为信号肽(淋巴因子(Lymphokines)，IRL出版社，华盛顿哥伦比亚特区牛津 (Oxford, Washington D. C. )，D.梅尔(D.Male)和 C.瑞克伍德(C. Rickwood)编辑)。经显示，成熟蛋白质的分子量为约19kDa，并且具有5个半胱氨酸残基，可以形成分子间或分子内二硫桥。结合研究显示，hG-CSF结合于中性粒细胞。很少或没有观察到与红细胞样、淋巴样嗜酸性粒细胞系以及巨噬细胞的结合。在人血浆中可检测到内源性G-CSF(琼斯(Jones)等人，贝勒临床血液学 (Bailliere' s Clinical Hematology) 2 183-111 (1989) )。hG-CSF 是由纤维母细胞、巨噬细胞、T细胞、滋养母细胞、内皮细胞和上皮细胞产生，并且是由位于17号染色体上的4个外显子和5个内含子构成的单拷贝基因的表达产物。此基因座转录产生的mRNA物质以不同方式加工，由此产生两种形式的hG-CSFmRNA，一种型式编码具有177个氨基酸的蛋白质， 另一种编码具有174个氨基酸的蛋白质(永田等人，EMBO杂志，5 :575-581 (1986)),并且已经发现，这一包含174个氨基酸的形式的活体内生物活性具有最高特异性。hG-CSF为具有交叉反应性的物质，因此，当将人G-CSF投予例如小鼠、犬或猴等另一哺乳动物时，将引起持续的中性粒细胞增多(莫尔(Moore)等人，PNAS-USA 84:7134-7138(1987))。G-CSF可从多种来源获得并进行纯化。天然人G-CSF(nhG-CSF)可与培养的人肿瘤细胞系上清液分离。重组DNA技术的发展(例如参见美国专利第4，810，643号(索泽)，以引用的方式并入本文中)使得能制造工业规模量的糖基化形式的G-CSF作为真核宿主细胞表达产物，以及工业规模量的非糖基化形式的G-CSF作为原核宿主细胞表达产物。已经发现，G-CSF适用于治疗中性粒细胞增加将提供益处的适应症。G-CSF可动员来自骨髓的干细胞和前体细胞，并用于治疗粒细胞在化疗期间耗尽的患者，或者作为骨髓移植的序曲。例如，对于癌症患者，G-CSF宜作为选择性刺激中性粒细胞产生以补偿由化疗或放射疗法引起的造血缺陷的方式。其他适应症包括治疗各种感染性疾病和相关病状，例如脓毒病，其通常是由细菌代谢物引起。G-CSF也可单独使用，或与其他化合物(例如其他细胞因子)组合使用，以供培养中的细胞生长或扩增，例如用于骨髓移植。G-CSF受体(G-CSFR)是造血/细胞因子/生长因子受体家族的成员，这一家族包括数种其他生长因子受体，例如白细胞介素(IL)-3、IL-4和IL-6受体、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)受体、促红细胞生成素(EPO)受体，以及催乳激素和生长激素受体。参见贝赞(Bazan)，美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci USA)87 :6934-6938(1990) 细胞因子受体家族的成员含有4个保守半胱氨酸残基和刚好位于跨膜区外部的色氨酸-丝氨酸-χ-色氨酸-丝氨酸基元。所述保守序列被认为涉及蛋白质-蛋白质相互作用。例如参见千叶(Chiba)等人，生物化学与生物物理研究通讯(Biochem. Biophys. Res. Comm) 184 485-490(1992)。G-CSF受体由分子量为约150kD的单一肽链组成(尼科拉(Nicola)，今日免疫学(Immunol. Today) 8 (1987)，134)。已经将糖基化hG-CSF的稳定性随pH值和温度变化的情况与通过在活体外用神经氨酸酶和内切-α-Ν-乙酰半乳糖胺酶酶促消化制备的脱糖基化hG-CSF相比较(大江户 (Oh-eda)等人，1990，生物化学杂志(J. Biol. Chem.) 265 (20) :11432-3)。在 37°C 下培育 2 天后，溶解于含有0. 2M NaCl和0. 01 % Tween 20的20mM磷酸盐缓冲液中达到1 μ g/mL浓度的脱糖基化hG-CSF在约pH 7到约pH8的pH值范围内失活。相比之下，在相同条件下， 糖基化hG-CSF保留了超过80%的活性。此外，借助于生物分析和量热分析测量来评价两种形式hG-CSF的热稳定性表明，脱糖基化的hG-CSF的热稳定性不如天然形式的hG-CSF。已经采用了多种方法来提供医药学上可接受的稳定G-CSF组合物。一种改进 G-CSF组合物稳定性的方法涉及合成这种蛋白质的衍生物。美国专利第5，665，863号揭示了包含G-CSF与白蛋白偶合的重组嵌合蛋白的形成，其具有新颖药物动力学特性。美国专利第5，824，784号和美国专利第5，320，840号揭示了水溶性聚合物与蛋白质的化学连接， 此法将改进稳定性，并提供针对蛋白水解降解的保护，更具体点说，这两项专利揭示了载有以化学方式连接的聚合物(包括聚乙二醇)的N末端经修饰的G-CSF分子。已经借助于X射线衍射和NMR研究测定了多种细胞因子的结构，所述细胞因子包括G-CSF(辛克(Zink)等人，FEBS通讯，314 :435(1992)；辛克等人，生物化学 (Biochemistry) 33 :8453(1994)；希尔(Hill)等人，美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 90 :5167 (1993))、GM-CSF (戴德瑞奇斯 K. (Diederichs, K.)等人，科学(Science) 154 :1779-1782(1991)；沃尔特(Walter)等人，分子生物学杂志(J. Mol. Biol. )224 :1075-1085(1992))、IL-2(贝赞 J. F. (Bazan，J. F.)科学(Science) 257 410-411 (1992)；马克雷 D. B. (McKay, D. B.)，科学(Science) 257 :412 (1992))、IL-4 (雷德菲尔德(Redfield)等人，生物化学(Biochemistry) 30 :11029-11035 (1991)；鲍尔斯 (Powers)等人，科学(Science) 256 :1673-1677(1992))和 IL_5(米尔伯恩(Milburn)等人， 自然(NatUre)363 :172-176(1993)),且这些结构尽管缺乏显著的一级序列同源性，但仍展示GH结构惊人的保守。一种增加G-CSF在组合物中的稳定性的替代性方法涉及改变这种蛋白质的氨基酸序列。美国专利第5，416，195号揭示了组合物稳定性得到改进的经基因工程改造的 G-CSF类似物，其中一般可见于成熟多肽链17位的半胱氨酸残基、见于27位的天冬氨酸残基，以及见于65位和66位的串联脯氨酸残基中至少一者都经丝氨酸残基置换。美国专利第5，773，581号揭示了 G-CSF已经共价结合至水溶性聚合物的经基因工程改造的G-CSF类似物。适用于治疗或预防乳腺炎方法中的各种形式的人G-CSF(包括其制备和纯化)都详细描述于美国专利第4，810，643，号中，所述专利以引用的方式并入本文中。美国专利第 4，810，643号描述并主张含有G-CSF基因或经基因工程改造的G-CSF基因变异体的新颖基因区段、生物功能性重组质粒和病毒DNA载体，以及原核和真核宿主细胞。这些宿主细胞
16表达生物活性G-CSF或经基因工程改造的G-CSF变异体。美国专利第5，849，883号和WO 89/10932描述在牛中利用人G-CSF进行的各种研究。进行的这些研究旨在评价牛的呼吸系统疾病(溶血性巴斯德氏菌)、对细菌激发(肺炎克氏杆菌)的反应或大肠杆菌型乳腺炎 (大肠杆菌)。美国专利第5，849，883号(以全文引用的方式并入本文中)提供了成熟牛 G-CSF(bG-CSF)的聚核苷酸和多肽序列，并且描述克隆、分离和纯化所述多肽及其类似物的方法。成熟b-GCSF为174个氨基酸长(SEQ ID NO :1)，与hG_CSF具有82%的同源性。具有起始甲硫氨酸氨基酸残基的bG-CSF多肽如SEQ ID N0:2所示。编码SEQ ID NO :1的聚核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。编码SEQ ID NO :2的聚核苷酸序列如SEQ ID NO 4 所示。贺达瑞(Heidari)等人在兽医免疫学和免疫病理学(Veterinary Immunology and Immunopathology) (2001) (81 :45-57)中描述 bG-CSF 的表达、纯化和生物活性。共价连接亲水性聚合物聚(乙二醇)(缩写为PEG)是一种增加许多生物活性分子 (包括蛋白质、肽，尤其是疏水性分子)的水溶性、生物利用率；增加血清半衰期；增加治疗半衰期；调节免疫原性；调节生物活性；或延长循环时间的方法。PEG已被广泛用于医药品或人工移植物以及生物相容性、无毒和无免疫原性极为重要的其他应用中。为了使PEG的所需特性最大化，与生物活性分子连接的PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高以赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特征，例如增加的水溶性和循环半衰期，同时不会不利地影响母体分子的生物活性。PEG衍生物常常是通过反应性化学官能团(例如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、 N末端和碳水化合物部分)与生物活性分子键。蛋白质和其他分子通常具有少数反应性位点可供聚合物连接。通常，最适于经由聚合物连接而修饰的位点在受体结合中起到重要作用，并且为保留分子的生物活性所需。因此，不加选择地将聚合物链与生物活性分子上的这些反应性位点连接通常会使经聚合物修饰的分子的生物活性显著降低或甚至完全丧失。 R.克拉克(R. Clark)等人，(1996)，生物化学杂志(J. Biol. Chem.), 271 :21969_21977。为了形成赋予目标分子所需优势的具有足够聚合物分子量的结合物，现有技术方法通常涉及将多个聚合物臂与分子随机连接，由此增加了降低或甚至完全丧失母体分子生物活性的风险。形成用于连接PEG衍生物与蛋白质的基因座的反应性位点可由蛋白质的结构指示。蛋白质(包括酶)是由各种α-氨基酸序列构成，这些序列的一般结构为 H2N--CHR--C00H。一个氨基酸的α氨基(H2N--)与相邻氨基酸的羧基部分(一C00H)连接形成酰胺键，其可表示为一(NH--CHR--CO)n--,其中下标“η”可等于数百或数千。R表示的片段可含有蛋白质生物活性和连接PEG衍生物的反应性位点。举例来说，在氨基酸赖氨酸的情况下，在ε位以及α位中存在一NH2部分。 ε -NH2在碱性ρΗ条件下自由反应。用PEG使蛋白质衍生化的领域中的大部分技术都是针对开发供连接至蛋白质中存在的赖氨酸残基的ε-NH2部分的PEG衍生物。"用于先进聚乙二醇化技术的聚乙二醇禾口 行生物(Polyethylene Glycol andDerivatives for Advanced PEGy Iat ion)"，奈克塔分子工程目录(Nektar MolecularEngineering Catalog)，2003，第 1-17页。然而，这些PEG衍生物都具有共同的局限性，S卩，无法将其选择性地安装于蛋白质表面上存在的常见的多种赖氨酸残基上。在例如存在于酶活性位点中的赖氨酸残基对于蛋白质活性极为重要的情况下，或者在赖氨酸残基对于介导蛋白质与其他生物分子的相互作用起作用的情况下，以及在受体结合位点的情况下，这将会成为显著的局限性。现有蛋白质聚乙二醇化方法的另一同等重要的新增难题在于，PEG衍生物可与除所需残基外的其他残基发生不必要的副反应。组氨酸含有结构以一N(H)--表示的反应性亚氨基部分，而许多与ε -NH2K应的化学反应性物质也可与一N(H)--反应。类似地，氨基酸半胱氨酸的侧链具有游离硫氢基，结构以-SH表示。在一些情况下，针对赖氨酸ε--ΝΗ2 基团的PEG衍生物也与半胱氨酸、组氨酸或其他残基反应。这可产生经PEG衍生化的生物活性分子的复杂不均勻混合物，并且有破坏作为目标的生物活性分子活性的风险。需要开发出这样的PEG衍生物，其允许在蛋白质内的单一位点引入化学官能团，随后使一种或一种以上PEG聚合物能够在蛋白质表面上明确界定且可预测的特定位点与生物活性分子选择性偶合。除赖氨酸残基外，此项技术中还曾针对靶向其他氨基酸侧链(包括半胱氨酸、组氨酸和N末端)的活性PEG试剂的开发作出了大量尝试。例如参见美国专利第6，610，281 号，以引用的方式并入本文中；和"用于先进聚乙二醇化技术的聚乙二醇和衍生物 (Polyethylene Glycol and Derivatives for AdvancedPEGylation)"，奈克塔分子工禾呈目录(Nektar Molecular Engineering Catalog)，2003，第 1-17 页。可以使用定点诱变和此项技术中已知的其他技术，将半胱氨酸残基位点选择性地引入蛋白质结构中，并且可使由此得到的游离硫氢基部分与具有硫醇反应性官能团的PEG衍生物反应。但这种方法比较麻烦，因为引入游离硫氢基会使所得蛋白质的表达、折叠和稳定性变得复杂。因此，需要具有一种将化学官能团引入生物活性分子中的方式，其能使一种或一种以上PEG聚合物与蛋白质选择性偶合，同时还与硫氢基以及蛋白质中常见的其他化学官能团相容(即，不会与之发生不必要的副反应)。从此项技术的取样(sampling)中可以了解到，所开发的用于连接蛋白质侧链，尤其赖氨酸氨基酸侧链上的一NH2部分和半胱氨酸侧链上的-SH部分的许多此类衍生物经证实在其合成和使用方面存在问题。一些衍生物与蛋白质形成不稳定键，这些键将经历水解， 并因此分解、降解，或者另外在水性环境(例如血流)中不稳定。一些衍生物形成较为稳定的键，但会在形成键之前经历水解，这意味着PEG衍生物上的反应性基团可能会在连接蛋白质之前就失活。一些衍生物略带毒性，因此不太适于活体内使用。一些衍生物会因反应过慢而实际无法使用。一些衍生物会因连接至负责蛋白质活性的位点而导致蛋白质活性丧失。一些衍生物对其将连接的位点不具特异性，这也会导致丧失所需活性以及缺乏结果可再现性。为了克服与用聚(乙二醇)部分修饰蛋白质相关的问题，已经开发出更为稳定(例如，美国专利第6，602，498号，以引用的方式并入本文中)或与分子和表面上的硫醇部分选择性反应(例如，美国专利6，610，观1，以引用的方式并入本文中)的PEG衍生物。此项技术中无疑需要在生理环境中具化学惰性，而只有在需要的情况下才选择性反应形成稳定化学键的PEG衍生物。已经揭示了羟烷基淀粉，尤其是羟乙基淀粉(hydroxyethylstarch，HES)共价连接至多肽的结合物的使用，以便潜在地改变多肽的免疫原性和/或变应原性。HES化是一项替代性技术，其揭示于让渡于费森尤斯卡比公司(Fresenius KabiAB)的一系列专利申请案中，包括美国专利公开案第20050063943号、第20060121073号、第20010100163号、第20050234230 号、第 20050238723 号、第 20060019877 号、第 20070134197 号、第 20070087961 号，以及美国专利第7，观5，661号，所有这些专利都以引用的方式并入本文中。HES是一种经修饰的天然聚合物，在临床上用作血浆增量剂，而HES化表示将原料药与HES衍生物偶合以改变药物特征(诸如药物动力学或水溶性)的技术。这项技术还还包括经由增加分子稳定性和降低肾清除率来延长蛋白质血浆循环，由此引起生物活性的增加。此外，也可能降低免疫原性或变应原性。通过改变不同的参数，例如HES的分子量，可以定制多种HES结合物。 尽管如此，羟乙基淀粉仍与所有其他当前可用的聚合物共有共同的缺点其多分散性。聚合物结合物是分子量分布在平均值周围的分子的混合物。此均质性的缺乏会引起较低水平的化学和生物化学特性表征，并且会阻止医药活性组分到达其作用位点(受体、酶等)。在这些情况下，活性药物需要以其原始的未经结合的形式递送，由此需要借助代谢反应使聚合物裂解以获得其医药功效。近来，已经报导了蛋白质科学中的全新技术，此项技术有望克服与蛋白质位点特异性修饰相关的众多局限。具体点说，已将新颖组分加到原核生物大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli)(例如参见 L.王(L.Wang)等人，Q001)，科学(Science) 292 :498-500)和真核生物酿酒酵母菌(Sacchromyces cerevisia，S. cerevisiae)(例如 J.秦(J. Chin)等人， 1^301 :964-7(2003))的蛋白质生物合成机器中，使得所述机器能够在活体内将非基因编码氨基酸并入蛋白质中。使用这一方法，已对琥珀密码子TAG起反应，以高保真度将大量具有新颖化学、物理或生物特性的新氨基酸有效地并入大肠杆菌和酵母中的蛋白质中，所述氨基酸包括光亲和性标记和光敏异构化氨基酸、光交联氨基酸(例如参见秦J. W. (Chin, J. W.)等人 Q002)美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.) 99 :11020-11024 ； 和秦J. W.等人，Q002)美国化学协会杂志(丄Am. Chem. Soc.) 124 :9026-9027)、酮基氨基酸、含有重原子的氨基酸和糖基化氨基酸。例如参见J. W.秦(J. W. Chin)等人，(2002)，羞国化学协会杂志(Journal of the AmericanChemical Society) 124 :9026-9027 ;J. W.泰和 P.G.查鲁兹(P. G. Schultz)，Q002)，化学与生物化学(ChemBioChem) 3 (11) :1135-1137 ； J. W.秦等人，(2002)，美国国家科学院院刊(PNAS United States of America) 99 11020-11024 ；和 L.王(L.Wang)和 P. G.查鲁兹(P. G. khultz)，(2002)，化学通讯(Chem. ComnkIa =I-Il0所有参考文献的全文都以引用的方式并入本文中。这些研究已证实，有可能选择性地以常规方式引入未见于蛋白质中、对可见于20种常见的基因编码氨基酸中的所有官能团具化学惰性且可用于有效选择性反应而形成稳定共价键的化学官能团，诸如酮基、炔基和叠氮部分。将非基因编码氨基酸并入蛋白质的能力允许引入可向天然存在的官能团(例如赖氨酸的ε-NH2、半胱氨酸的硫氢基-SH、组氨酸的亚氨基等)提供有价值的替代选择的化学官能团。已知某些化学官能团对20种常见基因编码氨基酸中所见的官能团呈惰性，但能完全有效地反应以形成稳定键。此项技术中已知，叠氮基和乙炔基例如在催化量铜存在下可在水性条件下进行胡伊斯根(Huisgen) [3+2]环加成反应。例如参见托尼诺(Tornoe) 等人，(2002)有机化学杂志(J. OrR. Chem. ) 67 =3057-3064 ；和罗斯托瑟夫(Rostovtsev)等人，(2002)德国应用化学(AnSew. Chem. Int. Ed. )41 :2596-2599。举例来说，通过将叠氮部分引入蛋白质结构中，就能够并入对蛋白质中所见的胺、硫氢基、羧酸、羟基具化学惰性，但也可与乙炔部分平稳且有效地反应而形成环加成产物的官能团。重要的是，在不存在乙炔部分的情况下，叠氮仍保留化学惰性，而且在其他蛋白质侧链存在下且在生理学条件下不具反应性。本发明将特别解决与bG-CSF多肽的活性和制备有关的问题，而且还致力于具有改进的生物或药理学活性和/或改进的治疗半衰期的bG-CSF多肽的制备。
发明内容
本发明提供包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的bG-CSF多肽。在一些实施例中，bG-CSF多肽包含一个或一个以上翻译后修饰。在一些实施例中， bG-CSF多肽与连接子、聚合物或生物活性分子连接。在一些实施例中，bG-CSF多肽与双官能聚合物、双官能连接子或至少另一种bG-CSF多肽连接。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，非天然编码氨基酸通过连接子与水溶性聚合物连接或与水溶性聚合物键接。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子是一种双官能聚合物。在一些实施例中，双官能聚合物与第二多肽连接。在一些实施例中，所述第二多肽是bG-CSF多肽。在一些实施例中，bG-CSF多肽包含至少两个氨基酸连接至包含聚乙二醇部分的水溶性聚合物。在一些实施例中，至少一个氨基酸是非天然编码氨基酸。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入bG-CSF中的以下一个或一个以上位置1 位前(即力末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、 133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、 152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、 171、172、173、174、175(即，蛋白质的羧基末端)，以及其任何组合(SEQ ID NO :1，或SEQ ID NO 2的相应氨基酸，或者另一 bG-CSF多肽中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入bG-CSF中的以下一个或一个以上位置:SEQ ID NO 1 中的 3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、124、125、 133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何组合，或者 SEQ ID NO 2 中的相应氨基酸。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入bG-CSF中的以下一个或一个以上位置3、7、33、43、58、62、67、69、99、123、124、133、134、141、166，以及其任何组合 (SEQ ID N0:1，或SEQ ID NO :2中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入bG-CSF中的以下一个或一个以上位置SEQ ID NO :1中的3、7、62、 133、166，以及其任何组合，或SEQ ID NO :2中的相应氨基酸。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入bG-CSF中的以下一个或一个以上位置62、133，以及其任何组合(SEQ ID NO :1，或SEQ ID NO :2中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入bG-CSF的62位(SEQ ID NO :1，或SEQ ID NO :2中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然编码氨基酸并入bG-CSF的133位(SEQ ID NO :1，或SEQ ID NO :2中的相应氨基酸)。在一些实施例中，本发明的多肽包含一个或一个以上天然氨基酸取代、添加或缺失。在一些实施例中，将一个或一个以上非天然氨基酸并入在SEQ ID N0:l、2或者其他bG-CSF序列的N或C末端的前导序列或信号序列中。在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，这些位置包括(但不限于)以下位置1位前(即，N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18，19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、 127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、 146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、 165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175( SP，蛋白质的羧基末端)，以及其任何组合(SEQ ID NO :1，或SEQ ID NO :2中的相应氨基酸，或者另一 bG-CSF多肽中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，这些位置包括(但不限于)以下位置3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、 124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何组合(SEQ ID NO :1，或 SEQ ID NO 2中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，这些位置包括(但不限于)以下位置3、7、33、43、58、62、67、69、 99、123、124、133、134、141、166，以及其任何组合(SEQ ID N0:1，或 SEQ ID NO :2 中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，这些位置包括(但不限于)以下位置3、7、62、133、166，以及其任何组合(SEQ ID NO :1，或SEQ ID N0:2中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将一个或一个以上所述位置的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接，这些位置包括(但不限于)62、133，以及其任何组合(SEQ ID NO :1，或SEQ ID NO :2中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将62位的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接(SEQ ID NO :1，或SEQ ID NO :2中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将133位的非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接(SEQ ID NO :1，或SEQ ID N0:2中的相应氨基酸)。在一些实施例中，将在SEQ ID NO :1、2或者其他bG-CSF序列的N 或C末端的信号序列或前导序列中的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，bG-CSF多肽包含取代、添加或缺失，其可调节bG-CSF多肽对受体或结合搭配物(包括(但不限于)蛋白质、多肽、小分子或核酸)的亲和力。在一些实施例中，bG-CSF多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应bG-CSF稳定性相比较时，所述取代、添加或缺失将增加bG-CSF多肽的稳定性。稳定性和/或溶解性可以使用所属领域技术人员已知的多种不同分析来测量。所述分析包括(但不限于)SE-HPLC 和RP-HPLC。在一些实施例中，bG-CSF多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应bG-CSF的免疫原性相比较时，所述取代、添加或缺失将调节bG-CSF多肽的免疫原性。在一些实施例中，bG-CSF多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应bG-CSF的血清半衰期或循环时间相比较时，所述取代、添加或缺失将调节bG-CSF多肽的血清半衰期或循环时间。在一些实施例中，bG-CSF多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应bG-CSF的水溶性相比较时，所述取代、添加或缺失将增加bG-CSF多肽的水溶性。在一些实施例中，bG-CSF多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应bG-CSF 的溶解性相比较时，所述取代、添加或缺失将增加宿主细胞中产生的bG-CSF多肽的溶解性。在一些实施例中，bG-CSF多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应 bG-CSF在宿主细胞中的表达或其在活体外的合成相比较时，所述取代、添加或缺失将增加 bG-CSF多肽的表达或合成。包含此取代的bG-CSF多肽保留了激动剂活性，并且保持或改进了在宿主细胞中的表达水平。在一些实施例中，bG-CSF多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应bG-CSF的蛋白酶抗性相比较时，所述取代、添加或缺失将增加 bG-CSF多肽的蛋白酶抗性。在一些实施例中，bG-CSF多肽包含取代、添加或缺失，当与受体与无取代、添加或缺失的相应bG-CSF多肽相互作用时的信号转导活性相比较时，所述取代、添加或缺失将调节受体的活性。在一些实施例中，bG-CSF多肽包含取代、添加或缺失， 当与无取代、添加或缺失的相应bG-CSF多肽与另一分子(例如受体)的结合相比较时，所述取代、添加或缺失将调节bG-CSF多肽的结合。在一些实施例中，bG-CSF多肽包含取代、 添加或缺失，与无取代、添加或缺失的相应bG-CSF多肽的造血作用相比较，所述取代、添加或缺失将调节造血作用。在一些实施例中，bG-CSF多肽包含取代、添加或缺失，与无取代、 添加或缺失的相应bG-CSF多肽的中性粒细胞增殖相比较，所述取代、添加或缺失将调节中性粒细胞的增殖。在一些实施例中，bG-CSF多肽包含取代、添加或缺失，与无取代、添加或缺失的相应bG-CSF多肽的中性粒细胞的成熟相比较，所述取代、添加或缺失将调节中性粒细胞的成熟。在一些实施例中，bG-CSF多肽包含取代、添加或缺失，当与无取代、添加或缺失的相应bG-CSF与医药用防腐剂(例如间甲酚、苯酚、苯甲醇)的相容性相比较，所述取代、添加或缺失将增加bG-CSF多肽的相容性。此增加的相容性将使保存的医药调配物制剂能够在存储期间保持蛋白质的物理化学特性(physiochemical property)和生物活性。在一些实施例中，利用一个或一个以上非天然氨基酸产生一个或一个以上经工程改造的键。分子内键可以多种方式产生，包括(但不限于)在适合条件下，蛋白质中的两个氨基酸之间发生反应(一个或两个氨基酸可以为非天然氨基酸)；在适合条件下，两个氨基酸与连接子、聚合物或其他分子发生反应，这两个氨基酸各自可为天然编码或非天然编码的，等等。在一些实施例中，可以用一个或一个以上天然存在或非天然存在氨基酸取代 bG-CSF多肽中的一个或一个以上氨基酸。在一些实施例中，可以用天然存在或非天然存在氨基酸取代bG-CSF多肽中的氨基酸，只要至少一处取代是用非天然编码氨基酸进行即可。 在一些实施例中，可以用一个或一个以上天然存在氨基酸取代bG-CSF多肽中的一个或一个以上氨基酸，并且另外用非天然编码氨基酸进行至少一处取代。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、乙酰基、氨氧基、胼基、酰胼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构
权利要求
1.一种bG-CSF多肽，其包含一个或一个以上非天然编码氨基酸。
2.根据权利要求1所述的bG-CSF多肽，其中所述bG-CSF多肽包含一个或一个以上翻译后修饰。
3.根据权利要求1所述的bG-CSF多肽，其中所述多肽与连接子、聚合物或生物活性分子连接。
4.根据权利要求3所述的bG-CSF多肽，其中所述多肽与水溶性聚合物连接。
5.根据权利要求1所述的bG-CSF多肽，其中所述多肽与双官能聚合物、双官能连接子或至少另一种bG-CSF多肽连接。
6.根据权利要求5所述的bG-CSF多肽，其中所述双官能连接子或聚合物与第二多肽连接。
7.根据权利要求6所述的bG-CSF多肽，其中所述第二多肽为bG-CSF多肽。
8.根据权利要求4所述的bG-CSF多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
9.根据权利要求4所述的bG-CSF多肽，其中所述水溶性聚合物与所述b-GCSF多肽中存在的非天然编码氨基酸连接。
10.根据权利要求1所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组成的群组的位置取代1位前(即，N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、 92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、 113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、 132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、 151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、 170、171、172、173、174、175(即，所述蛋白质的羧基末端)，以及其任何组合(SEQ ID N0:1， 或SEQ ID NO 2中的相应氨基酸)。
11.根据权利要求10所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组成的群组的位置取代SEQ ID NO 1 中的 3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、 124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何组合，或者 SEQ ID NO 2 中的相应氨基酸。
12.根据权利要求10所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组成的群组的位置取代3、7、33、43、58、62、67、69、99、123、124、133、134、141、166，以及其任何组合(SEQ ID NO :1，或SEQID NO 2中的相应氨基酸)。
13.根据权利要求10所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组成的群组的位置取代3、7、62、133、166，以及其任何组合(SEQ ID NO :1，或SEQ ID NO 2中的相应氨基酸)。
14.根据权利要求10所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸在62位(SEQID NO 1，或SEQ ID NO 2中的相应氨基酸)取代。
15.根据权利要求10所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸在133位(SEQID NO :1，或SEQ ID NO :2中的相应氨基酸)取代。
16.根据权利要求4所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组成的群组的位置取代1位前(即，N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、 92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、 113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、 132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、 151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、 170、171、172、173、174、175(即，所述蛋白质的羧基末端)，以及其任何组合(SEQ ID N0:1， 或SEQ ID NO 2中的相应氨基酸)。
17.根据权利要求16所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组成的群组的位置取代SEQ ID NO 1 中的 3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、 124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何组合，或 SEQ ID NO 2 中的相应氨基酸。
18.根据权利要求16所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组成的群组的位置取代3、7、33、43、58、62、67、69、99、123、124、133、134、141、166，以及其任何组合(SEQ ID NO :1，或SEQID NO 2中的相应氨基酸)。
19.根据权利要求16所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组成的群组的位置取代3、7、62、133、166，以及其任何组合(SEQ ID NO :1，或SEQ ID NO 2中的相应氨基酸)。
20.根据权利要求16所述的M-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸在62位(SEQID NO 1，或SEQ ID NO 2中的相应氨基酸)取代。
21.根据权利要求4所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸在133位(SEQID NO 1，或SEQ ID NO 2中的相应氨基酸)取代。
22.根据权利要求1所述的bG-CSF多肽，其中所述bG-CSF多肽包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失，所述取代、添加或缺失将调节所述bG-CSF多肽对bG-CSF受体的亲和力。
23.根据权利要求1所述的bG-CSF多肽，其中所述bG-CSF多肽包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失，所述取代、添加或缺失将增加所述bG-CSF多肽的稳定性或溶解性。
24.根据权利要求1所述的bG-CSF多肽，其中所述bG-CSF多肽包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失，所述取代、添加或缺失将增加重组宿主细胞中所述bG-CSF多肽的表达或所述bG-CSF多肽的活体外合成。
25.根据权利要求1所述的bG-CSF多肽，其中所述bG-CSF多肽包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失，所述取代、添加或缺失将增加所述bG-CSF多肽的蛋白酶抗性。
26.根据权利要求1所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸对连接子、聚合物或生物活性分子具反应性，且另外对所述多肽中的20种常见氨基酸中的任一种不具反应性。
27.根据权利要求1所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰胼基、胼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
28.根据权利要求27所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基。
29.根据权利要求观所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构
30.根据权利要求27所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含氨氧基。
31.根据权利要求27所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含酰胼基。
32.根据权利要求27所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含胼基。
33.根据权利要求27所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。
34.根据权利要求27所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。
35.根据权利要求34所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构
36.根据权利要求27所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含炔基。
37.根据权利要求36所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构
38.根据权利要求4所述的bG-CSF多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量介于约 0. IkDa 与约 IOOkDa 之间。
39.根据权利要求38所述的bG-CSF多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量介于约 0. IkDa与约50kDa之间。
40.根据权利要求4所述的bG-CSF多肽，其是通过使包含含羰基氨基酸的bG-CSF多肽与包含氨氧基、胼基、酰胼基或氨基脲基的水溶性聚合物反应而制成。
41.根据权利要求40所述的bG-CSF多肽，其中所述氨氧基、胼基、酰胼基或氨基脲基经由酰胺键与所述水溶性聚合物连接。
42.根据权利要求4所述的bG-CSF多肽，其是通过使包含羰基的水溶性聚合物与包含非天然编码氨基酸的多肽反应而制成，所述非天然编码氨基酸包含氨氧基、胼基、酰胼基或氨基脲基。
43.根据权利要求4所述的bG-CSF多肽，其是通过使包含含炔氨基酸的bG-CSF多肽与包含叠氮部分的水溶性聚合物反应而制成。
44.根据权利要求4所述的bG-CSF多肽，其是通过使包含含叠氮氨基酸的bG-CSF多肽与包含炔部分的水溶性聚合物反应而制成。
45.根据权利要求27所述的bG-CSF多肽，其中所述叠氮基或炔基经由酰胺键与所述水溶性聚合物连接。
46.根据权利要求4所述的bG-CSF多肽，其中所述水溶性聚合物为分支或多臂聚合物。
47.根据权利要求46所述的bG-CSF多肽，其中所述水溶性聚合物各分支的分子量介于约IkDa与约IOOkDa之间。
48.根据权利要求1所述的bG-CSF多肽，其中所述多肽为M-CSF拮抗剂。
49.根据权利要求48所述的bG-CSF多肽，其中所述多肽包含一个或一个以上翻译后修饰、连接子、聚合物或生物活性分子。
50.根据权利要求49所述的bG-CSF多肽，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)组成的群组的部分。
51.根据权利要求48所述的bG-CSF多肽，其中所述多肽阻止所述bG-CSF受体活化。
52.根据权利要求1所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含糖部分。
53.根据权利要求3所述的bG-CSF多肽，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子经由糖部分与所述多肽连接。
54.一种分离的核酸，其包含在严格条件下与SEQ ID NO :3或4或者编码SEQ ID NO 1或2的聚核苷酸序列杂交的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸包含至少一个选择密码子。
55.根据权利要求M所述的分离的核酸，其中所述选择密码子选自由以下各密码子组成的群组琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子和四碱基密码子。
56.一种制备根据权利要求3所述的bG-CSF多肽的方法，所述方法包含使包含非天然编码氨基酸的分离的bG-CSF多肽与连接子、聚合物或生物活性分子接触，所述连接子、聚合物或生物活性分子包含与所述非天然编码氨基酸反应的部分。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)组成的群组的部分。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰胼基、胼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
59.根据权利要求56所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基部分，且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含氨氧基、胼、酰胼或氨基脲部分。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述氨氧基、胼、酰胼或氨基脲部分经由酰胺键与所述连接子、聚合物或生物活性分子连接。
61.根据权利要求56所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含炔部分，且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含叠氮部分。
62.根据权利要求56所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含叠氮部分，且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含炔部分。
63.根据权利要求58所述的方法，其中所述叠氮或炔部分经由酰胺键与连接子、聚合物或生物活性分子连接。
64.根据权利要求57所述的方法，其中所述聚(乙二醇)部分的平均分子量介于约 0. IkDa 与约 IOOkDa 之间。
65.根据权利要求57所述的方法，其中所述聚(乙二醇)部分为分支或多臂聚合物。
66.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的bG-CSF多肽和医药学上可接受的载剂。
67.根据权利要求66所述的组合物，其中所述非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。
68.一种治疗患有受bG-CSF调节的病症的动物的方法，其包含对所述动物投予治疗有效量的根据权利要求66所述的组合物。
69.一种细胞，其包含根据权利要求M所述的核酸。
70.根据权利要求69所述的细胞，其中所述细胞包含正交tRNA合成酶或正交tRNA。
71.一种制备包含非天然编码氨基酸的bG-CSF多肽的方法，所述方法包含，在允许表达所述包含非天然编码氨基酸的bG-CSF多肽的条件下，培养包含一个或一个以上编码 bG-CSF多肽且包含选择密码子的聚核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA的细胞；以及纯化所述bG-CSF多肽。
72.—种调节bG-CSF多肽的血清半衰期或循环时间的方法，所述方法包含用一个或一个以上非天然编码氨基酸取代所述bG-CSF多肽中任一个或一个以上天然存在氨基酸。
73.一种bG-CSF多肽，其是由具有SEQ ID NO :3或4中所示的序列或者编码SEQ ID NO :1或2所示的多肽的聚核苷酸所编码，其中所述聚核苷酸包含选择密码子，且其中所述多肽包含至少一个非天然编码氨基酸。
74.根据权利要求73所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸与连接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子连接。
75.根据权利要求74所述的bG-CSF多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
76.根据权利要求73所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组成的群组的位置取代1位前(即，N末端)、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、 67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、 92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、 113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、 132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、 151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、 170、171、172、173、174、175(即，所述蛋白质的羧基末端)，以及其任何组合(SEQ ID NO :1， 或SEQ ID NO 2中的相应氨基酸)。
77.根据权利要求76所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组成的群组的位置取代SEQ ID NO 1 中的 3、7、11、33、43、58、62、67、69、98、99、123、 124、125、133、134、136、141、159、166、169、170、173，以及其任何组合，或 SEQ ID NO 2 中的相应氨基酸。
78.根据权利要求76所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组成的群组的位置取代3、7、33、43、58、62、67、69、99、123、124、133、134、141、166，以及其任何组合(SEQ ID NO :1，或SEQID NO 2中的相应氨基酸)。
79.根据权利要求76所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸在选自由以下残基组成的群组的位置取代3、7、62、133、166，以及其任何组合(SEQ ID NO :1，或SEQ ID NO 2中的相应氨基酸)。
80.根据权利要求76所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸在62位(SEQID NO :1，或SEQ ID NO :2中的相应氨基酸)取代。
81.根据权利要求73所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸在133位(SEQ ID NO :1，或SEQ ID NO :2中的相应氨基酸)取代。
82.根据权利要求73所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰胼基、胼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。
83.根据权利要求75所述的bG-CSF多肽，其中所述聚(乙二醇)部分的分子量介于约 0. IkDa 与约 IOOkDa 之间。
84.根据权利要求75所述的bG-CSF多肽，其中所述聚(乙二醇)部分为分支或多臂聚合物。
85.根据权利要求84所述的bG-CSF多肽，其中所述聚(乙二醇)部分的分子量介于约 IkDa与约IOOkDa之间。
86.—种组合物，其包含根据权利要求73所述的bG-CSF多肽和医药学上可接受的载剂。
87.—种bG-CSF多肽，其包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失，所述取代、添加或缺失将增加重组宿主细胞中所述bG-CSF多肽的表达。
88.—种bG-CSF多肽，其包含经由共价键与所述bG-CSF多肽的单一氨基酸连接的水溶性聚合物。
89.根据权利要求88所述的bG-CSF多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。
90.根据权利要求88所述的bG-CSF多肽，其中所述与所述水溶性聚合物共价连接的氨基酸为非天然编码氨基酸。
91.根据权利要求10所述的bG-CSF多肽，其中所述非天然编码氨基酸与聚(乙二醇) 分子连接。
92.一种bG-CSF多肽，其包含至少一个连接子、聚合物或生物活性分子，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子通过经核糖体并入所述多肽中的非天然编码氨基酸的官能团与所述多肽连接。
93.根据权利要求92所述的bG-CSF多肽，其中所述bG-CSF多肽为单聚乙二醇化的。
94.一种bG-CSF多肽，其包含与一个或一个以上非天然编码氨基酸连接的连接子、聚合物或生物活性分子，其中所述非天然编码氨基酸是经核糖体并入所述多肽中预先选择的位点。
95.根据权利要求94所述的bG-CSF多肽，其中所述bG_CSF多肽包含一个所述连接子、 聚合物或生物活性分子。
96.根据权利要求1所述的bG-CSF多肽，其中所述bG-CSF多肽包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失，所述取代、添加或缺失将在投予所述多肽后调节动物的造血作用。
97.根据权利要求1所述的bG-CSF多肽，其中所述bG-CSF多肽包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失，所述取代、添加或缺失将调节所述bG-CSF多肽的血清半衰期或循环时间。
98.根据权利要求1所述的bG-CSF多肽，其中所述bG-CSF多肽包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失，所述取代、添加或缺失将在投予所述多肽后调节动物的中性粒细胞增殖。
99.根据权利要求1或4所述的bG-CSF多肽，其中所述多肽包含天然编码氨基酸取代。
100.根据权利要求1所述的bG-CSF多肽，其中所述bG-CSF多肽包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失，所述取代、添加或缺失将在投予所述多肽后调节动物的中性粒细胞成熟。
101.根据权利要求1所述的bG-CSF多肽，其中所述bG-CSF多肽包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失，所述取代、添加或缺失将在投予所述多肽后调节动物的中性粒细胞功能。
102.一种治疗患有受bG-CSF调节的感染的动物的方法，其包含对所述动物投予治疗有效量的根据权利要求66所述的组合物。
103.根据权利要求4所述的bG-CSF多肽，其中所述水溶性聚合物经由肟键与所述多肽连接。
104.一种预防动物感染的方法，其包含对所述动物投予治疗有效量的根据权利要求 66所述的组合物。
全文摘要
本发明提供经修饰的牛G-CSF多肽和其用途。
文档编号A61K38/00GK102159230SQ200980137170
公开日2011年8月17日 申请日期2009年7月22日 优先权日2008年7月23日
发明者安娜-玛莉亚·A.·海斯·蒲楠, 尼克·克努森, 席雅·诺曼, 彼德·C.·康宁, 爱伦·柯钦, 瓦迪姆·克赖诺夫, 莉莲·何 申请人:Ambrx公司, 美国礼来公司