经修饰脂联素多肽和其用途

经修饰脂联素多肽和其用途
【专利摘要】提供经修饰脂联素多肽和其用途。
【专利说明】经修饰脂联素多肽和其用途

【技术领域】
[0001] 本发明涉及经至少一种非天然编码氨基酸修饰的脂联素多肽。

【背景技术】
[0002] 脂联素是调节多个代谢过程的蛋白质，所述代谢过程包括葡萄糖调控和脂肪酸分 解代解。脂联素通过脂肪组织分泌到血流中并且在成人中，所述激素的血浆水平与体脂百 分比负相关。所述激素起抑制代谢紊乱的作用，代谢紊乱会引起2型糖尿病、肥胖、动脉粥 样硬化和非酒精性脂肪性肝病（NAFLD)。
[0003]脂联素也称为AdipoQ、apMl、GBP28 或Acrp30(谢勒（Scherer)等人， 生物化学杂志（JBiolChem)，270:26746-9, 1995 ;胡（Hu)等人，生物化学杂 志，271:10697-703, 1996;前田（Maeda)等人，生物化学与生物物理研究通讯（Biochem BiophysResCommun) ,221:286-9, 1996;以及中野（Nakano)等人，生物化学杂志（东 京），120:803-12, 1996)，是由N端胶原结构域和C端球状结构域组成的多肽。脂联素的血 清水平在肥胖和2型糖尿病两者当中显著降低，说明可能存在与胰岛素抗性相关的代谢作 用或关系。谢勒等人，生物化学杂志，270:26746-9, 1995 ;有田（Arita)等人，生物化学 与生物物理研究通讯，257:79-83, 1999。与此一致的是，弗鲁布斯（Fruebis)等人（美国国 家科学院院刊（ProcNatlAcadSciUSA) ,98:2005-10, 2001)的新近报导涉及脂联素的蛋 白水解片段作为肌肉脂肪酸氧化的急性刺激剂。其它新近报导显示脂联素在胰岛素抗性发 展中的可能的致因性作用。弗鲁布斯等人，美国国家科学院院刊，98:2005-10, 2001;山内 (Yamauchi)等人，自然医学（NatMed),NatMed, 7:941_6, 2001。
[0004] 虽然关于脂肪组织生理学的研究尚未提供糖尿病与肥胖之间的关系的根本机制 的清晰并且完整的解释，但是所述研究已经提供了用于探究发展这些病症的新治疗的若干 种新方法。
[0005] 调控剪接变异体的表达在信号转导分子的活性方面可以具有重要作用并且已 经涉及于若干疾病的发病机制中（卡奇吉安LM(KhachigianLM)等人（1992)病理学 (Pathology) 24:280-290)。举例来说，产生磺酰脲类受体基因的新剪接变异体的突变产生 具有家族持续性高胰岛素性低血糖的分离体（托马斯PM(ThomasPM)等人（1995)科学 (Science)268:426-429)。
[0006] 已经描述了小鼠OB-R的至少9种交替剪接形式（李（Lee)等人，同前文献）。剪 接变异体B219在小鼠卵黄囊、早期胎肝、富集的造血干细胞、各种淋巴造血细胞系中和在 成体生殖器官中表达并且可以直接参与造血和生殖（乔菲JA(CioffiJA)等人（1996)自 然医学（NatureMedicine) 2 ;585-589)。
[0007] 产生交替剪接转录物的OB-R突变负责db/db小鼠的重度肥胖表型（陈H(ChenΗ) 等人（1996)细胞（Cell)84:491-495)。基于人类染色体与小鼠染色体之间的同线性，OB-R 的人类版本可能映射到人类染色体1ρ31 (李等人，同前文献）。
[0008]对秀 _ 隐杆线虫（Caenorhabditiselegans)和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)基因组测序的努力已经分别披露了假定的开放式阅读框（0RF)C30B5.2和YJR044c(威尔逊R(WilsonR)等人，（1994)自然 368:32-38;黄ME(HuangME)等人 (1995)酵母（Yeast) 11:775-781)。YJR044c和C30B5. 2 在氨基酸序列方面 27%-致并且 71 %相似，并且共享相似的疏水性模式。YJR044C已经被描述为假定的膜相关蛋白（威尔逊 等人，同前文献）。C30B5. 2氨基酸序列关于磷脂酶A2具有共同模式（CCxxHxxC)，磷脂酶 A2是从甘油的第二个碳基团释放脂肪酸的酶家族。
[0009] 认为例如脂联素受体等许多信号转导分子的活性是通过所述分子的剪接变异体 的表达来调控。新的脂联素受体相关蛋白可以提供与信号转导事件相关的疾病病况的诊断 和治疗基础，所述信号转导事件与以下各者相关：代谢障碍，例如肥胖和糖尿病；代谢障碍 和生殖障碍，包括不孕症。
[0010] 共价连接亲水性聚合物聚（乙二醇）（缩写为PEG)是一种增加许多生物活性分子 (包括蛋白质、肽，尤其是疏水性分子）的水溶性、生物利用率；增加血清半衰期；增加治疗 半衰期；调节免疫原性；调节生物活性；或延长循环时间的方法。PEG已被广泛用于医药品 或人工移植物以及生物相容性、无毒和无免疫原性极为重要的其它应用中。为了使PEG的 所需特性最大化，与生物活性分子连接的PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高， 以便赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特征，例如增加的水溶性和循环半衰期，同时 不会不利地影响母体分子的生物活性。
[0011]PEG衍生物常常是通过反应性化学官能团（例如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、 N端和碳水化合物部分）与生物活性分子连接。蛋白质和其它分子通常具有少数反应位点 可供聚合物连接。通常，最适于通过聚合物连接而修饰的位点在受体结合中起到重要作用， 并且是保留分子的生物活性所必需的。因此，聚合物链与生物活性分子上的这类反应位点 的不加区别的连接常常导致经聚合物修饰分子的生物活性显著减少或甚至完全丧失。R.克 拉克（R.Clark)等人，(1996),牛物化学杂志，271:21969-21977。为形成聚合物分子量足 够赋予目标分子所需优势的结合物，现有技术方法通常涉及大量聚合物臂与所述分子的无 规连接，由此增加母体分子的生物活性减少或甚至完全丧失的风险。
[0012] 形成PEG衍生物与蛋白质的连接点的反应位点可由蛋白质的结构指示。蛋白质 (包括酶）是由各种α-氨基酸序列构成，这些序列的一般结构是H2N--CHR--COOtL-个 氨基酸的α氨基部分（H2N-)与相邻氨基酸的羧基部分（一C00H)连接以形成酰胺键，其 可表示为一(NH--CHR--CO)n--,其中下标"η"可等于数百或数千。R表示的片段可以含有 关于蛋白质生物活性和连接PEG衍生物的反应位点。
[0013] 举例来说，在氨基酸赖氨酸的情况下，在ε位以及α位中存在--NH2部分。 ε-NH2在碱性pH条件下可自由反应。经PEG衍生化的蛋白质领域中的许多技术一直针 对于发展用于与蛋白质中所存在的赖氨酸残基的ε--ΝΗ2部分连接的PEG衍生物。"用 于先进聚乙二醇化技术的聚乙二醇和衍生物（PolyethyleneGlycolandDerivatives forAdvancedPEGyIation),奈克塔分子工程目录（NektarMolecularEngineering Catalog) ,2003,第1-17页。然而，这些PEG衍生物都具有共有的局限性，S卩，无法将其选择 性地安装于蛋白质表面上存在的常见的多种赖氨酸残基上。在赖氨酸残基对于蛋白质活性 极为重要（例如存在于酶活性位点中）的情况下，或在赖氨酸残基对于介导蛋白质与其它 生物分子的相互作用起作用的情况下，如在受体结合位点的情况下，这将会成为显著的局 限性。
[0014] 现有蛋白质聚乙二醇化方法的另一同等重要的难题在于，PEG衍生物可与除所 需残基外的其它残基发生不必要的副反应。组氨酸含有反应性亚氨基部分，结构上表示 为--N(H)-，但许多与ε--NH2反应的化学反应性物质也可以与一N(H)--反应。相似地， 氨基酸半胱氨酸的侧链带有一个游离硫氢基，结构上表示为-SH。在一些情况下，针对赖氨 酸ε--NH2基团的PEG衍生物还与半胱氨酸、组氨酸或其它残基反应。这可产生经PEG衍 生化的生物活性分子的复杂不均匀混合物，并且有破坏作为目标的生物活性分子活性的风 险。需要开发出这样的PEG衍生物，其允许在蛋白质内的单一位点引入化学官能团，随后使 一或多种PEG聚合物能够在蛋白质表面上明确界定且可预测的特定位点与生物活性分子 选择性偶合。
[0015] 除赖氨酸残基外，所属领域中还曾就开发靶向其它氨基酸侧链（包括半胱氨酸、 组氨酸和N端）的活性PEG试剂进行了大量尝试。例如，参见以引用的方式并入本文中的 美国专利第6, 610, 281号，以及"用于先进聚乙二醇化技术的聚乙二醇和衍生物"，奈克塔 分子工程目录，2003,第1-17页。可以使用定点诱变和所属领域中已知的其它技术，将半 胱氨酸残基位点选择性地引入蛋白质结构中，并且可使所得游离硫氢基部分与带有硫醇反 应性官能团的PEG衍生物反应。但这种方法比较麻烦，因为引入游离硫氢基会使所得蛋白 质的表达、折叠和稳定性变得复杂。因此，需要具有一种将化学官能团引入生物活性分子中 的方式，其能使一或多种PEG聚合物与蛋白质选择性偶合，同时还与硫氢基以及蛋白质中 常见的其它化学官能团相容（即，不会与其发生不必要的副反应）。
[0016] 如从所属领域的抽样中可以看出，已经证明，已经开发出的用于连接到蛋白质 侧链上，尤其赖氨酸氨基酸侧链上的一NH2部分和半胱氨酸侧链上的-SH部分上的这些 衍生物中的多种在其合成和使用中有问题。一些衍生物与蛋白质形成不稳定键，这些键 将经历水解，并因此分解、降解，或者另外在水性环境（例如血流）中不稳定。参见派 德，S.C(Pedder,S.C)肝病论文集（SeminLiverDis.) 2003 ;23 增刊 1:19-22,关于在 PEG-Intron?中键稳定性的讨论。一些衍生物可形成较为稳定的键,但会在形成键之前经历 水解，这意味着PEG衍生物上的反应性基团可能会在连接蛋白质之前就失活。一些衍生物 略带毒性，并且因此不太适于体内使用。一些衍生物反应过慢而无法实际使用。一些衍生 物会因连接到负责蛋白质活性的位点而导致蛋白质活性丧失。一些衍生物对其将连接的位 点不具特异性，这也会导致丧失所需活性以及缺乏结果的可再现性。为了克服与用聚（乙 二醇）部分修饰蛋白质相关的问题，已经开发出更为稳定（例如，美国专利第6, 602, 498 号，以引用的方式并入本文中）或与分子和表面上的硫醇部分选择性反应（例如，美国专利 6,610, 281，以引用的方式并入本文中）的PEG衍生物。所属领域中无疑需要在生理环境中 具化学惰性，而只有在需要的情况下才选择性反应形成稳定化学键的PEG衍生物。
[0017] 近来，已经报导了蛋白质科学中的一种全新技术，这项技术有望克服与蛋白质 位点特异性修饰相关的众多局限。具体来说，已将新的组分加入到原核生物大肠杆菌 (Escherichiacoli，E.coli)(例如参见L,王（L,Wang)等人，(2001),科学292:498-500) 和真核生物酿酒酵母（Sacchromycescerevisia，S.cerevisiae)(例如J.秦（J.Chin)等 人，J^301:964-7 (2003))的蛋白质生物合成机器中，使得所述机器能够在体内将非基因 编码的氨基酸并入蛋白质中。已经使用这种方法，响应于琥珀密码子TAG，将具有新颖的化 学、物理或生物特性的多种新氨基酸（包括光亲和标记和光异构化氨基酸、酮氨基酸和糖 基化氨基酸）有效地并且高保真度地并入大肠杆菌和酵母中的蛋白质中。参见例如J.W.秦 (J.W.Chin)等人，（2002)，美国化学学会杂志（.TournaloftheAmericanChemical Society) 124:9026-9027 ：T.ff.秦和P.G.舒尔茨（P.G.Schultz)，(2002),化学牛物化学 (ChemBioChem) 11:1135-1137J.W.秦等人，(2002),美国国家科学院院刊（PNASUnited StatesofAmerica)99:11020-11024 :以及L.王和P.G.舒尔茨，(2002),化学通讯（Chem. Comm.).I-IQ0这些研究已经表明，有可能选择性地并且常规地引入例如酮基、炔基和叠氮 部分等化学官能团，这些化学官能团未见于蛋白质中，对见于20种常见的基因编码的氨基 酸中的所有官能团呈化学惰性并且可以用于有效地并且选择性地反应以形成稳定共价键。
[0018] 将非基因编码的氨基酸并入到蛋白质中的能力允许引入可提供天然存在的官能 团的有价值的替代物的化学官能团，例如赖氨酸的ε--NH2、半胱氨酸的硫氢基-SH、组氨 酸的亚氨基等。已知某些化学官能团对见于20种常见的基因编码氨基酸中的官能团是 惰性的但干净并有效地反应以形成稳定的键。例如所属领域中已知，叠氮基和乙炔基在 催化量铜存在下，可在水性条件中进行胡伊斯根（Huisgen) [3+2]环加成反应。例如，参 见托尔诺（Tornoe)等人，(2002)有机化学（Org.Chem. )67:3057-3064 :和罗斯托夫采夫 (Rostovtsev)等人，(2002)应用化学国际版（Angew.Chem.Int.Ed.)41:2596-2599。举例 来说，通过将叠氮部分引入到蛋白质结构中，能够并入对见于蛋白质中的胺、硫氢基、羧酸、 羟基呈化学惰性，但也与乙炔部分平稳并有效地反应以形成环加成产物的官能团。重要的 是，在不存在乙炔部分的情况下，叠氮基仍保留化学惰性，而且在其它蛋白质侧链存在时在 生理条件下不发生反应。
[0019] 本发明尤其解决了与脂联素多肽的活性和产生相关的问题，并且还解决了具有改 良的生物或药理特性的脂联素多肽的产生。


【发明内容】

[0020] 本发明提供包含一或多个非天然编码氨基酸的脂联素多肽。
[0021] 在一些实施例中，脂联素多肽包含一或多个翻译后修饰。在一些实施例中，脂联素 多肽与连接基团、聚合物或生物活性分子连接。在一些实施例中，脂联素多肽与双官能聚合 物、双官能连接基团或至少一种其它脂联素多肽连接。
[0022] 在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶 性聚合物包含聚（乙二醇）部分。在一些实施例中，聚（乙二醇）分子是一种双官能聚合 物。在一些实施例中，双官能聚合物与第二多肽连接。在一些实施例中，第二多肽是脂联素 多肽。
[0023] 在一些实施例中，脂联素多肽包含与包含聚（乙二醇）部分的水溶性聚合物连接 的至少两个氨基酸。在一些实施例中，至少一个氨基酸是非天然编码氨基酸。
[0024] 脂联素的核苷酸序列、氨基酸序列和二级结构区域是已知的并且另外，具有不同 官能团的多聚物包括在其所形成的较低分子量、中等分子量和较高分子量多聚物中（LMW、 MMW和HMW，并且更详细地讨论于以下参考文献中：胁H(WakiH)、山内T(YamauchiT)、加 门J(KamonJ)、伊藤Y(ItoY)、内田S(UchidaS)、基塔S(KitaS)、艾拉K(EaraK)、哈达 Y(HadaY)、瓦瑟尔F(VasseurF)、弗罗盖尔P(FroguelP)木村S(KimuraS)、长井R(Nagai R)和门胁T(KadowakiT).削弱与糖尿病相关的人类脂联素突变体的多聚化（Impaired multimerizationofhumanadiponectinmutantsassociatedwithdiabetes).月旨 联素的分子结构和多聚物形成（Molecularstructureandmultimerformationof adiponectin).生物化学杂志 2003 27840352-4036;外加A.A.理查兹（A.A.Richards)、 T.斯蒂芬斯（T.Stephens)、Η.K.查尔顿（Η.K.Charlton)、A.琼斯（A.Jones)、G.A.麦克 唐纳（G.A.Macdonald)、J.B.普林斯（J.B.Prins)和J.P.怀特黑德（J.P.Whitehead)脂 联素多聚化取决于胶原结构域中的保守赖氨酸：用于通过改变翻译后修饰来调控多聚化 的证据（AdiponectinMultimerizationIsDependentonConservedLysinesinthe CollagenousDomain!EvidenceforRegulationofMultimerizationbyAlterationsin PosttranslationalModifications)分子内分泌学（Mol.Endocrinol.)，7月I日，2006 ; 20(7) : 1673-1687,两者均以引用的方式并入本文中）。
[0025]在一些实施例中，在脂联素中的以下位置中的一或多者中并入一或多个非天然 编码氨基酸：在 1 位之前（即在N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、 133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、 152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、 171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、 190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、 228、229、230、231(g卩，在蛋白质的羧基端）（SEQIDN0:3或由SEQIDN0:2编码的相应 氨基酸）。在一些实施例中，在脂联素中的以下位置中的一或多者中并入一或多个非天然 编码氨基酸：在 1 位之前（即在N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、61、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、 133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、 152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、 171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、 190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、 228、229、230、231、232(g卩，在蛋白质的羧基端）（SEQIDN0:5或由SEQIDN0:4编码的相 应氨基酸）。在另一个实施例中，在脂联素中的以下位置中的一或多者中并入一或多个非天 然编码氨基酸：在 1 位之前（即在N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、 94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、 133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、 152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、 171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、 190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、 228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245(gp，在 蛋白质的羧基端）（SEQIDΝΟ:1)。
[0026] 在一些实施例中，一或多个非天然编码氨基酸在以下位置中的一或多者被取代： 在 1 位之前（即在N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36(SEQIDN0:3或由SEQIDN0:2编 码的相应氨基酸）。在一些实施例中，一或多个非天然编码氨基酸在以下位置中的一或多 者被取代：在 1 位之前（即在N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36(SEQIDN0:5或由SEQID N0:4编码的相应氨基酸）。在一些实施例中，一或多个非天然编码氨基酸在以下位置中的 一或多者被取代：在 1 位之前（即在N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35 和 36(SEQIDN0:1)。
[0027] 在一些实施例中，一或多个非天然编码氨基酸在以下位置中的一或多者被取代： 37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、 62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72和73(SEQIDN0:3或由SEQIDN0:2编码的相应氨基 酸）。在一些实施例中，一或多个非天然编码氨基酸在以下位置中的一或多者被取代：37、 38、 39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、 64、65、66、61、68、69、70、71、72和73(SEQIDN0:5或由SEQIDN0:4编码的相应氨基 酸）。在一些实施例中，一或多个非天然编码氨基酸在以下位置中的一或多者被取代：37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72和73(SEQIDN0:1)。
[0028] 在一些实施例中，一或多个非天然编码氨基酸在以下位置中的一或多者被取代： 74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、 99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109和110(SEQIDN0:3或由SEQIDN0:2 编码的相应氨基酸）。在一些实施例中，一或多个非天然编码氨基酸在以下位置中的一或 多者被取代：74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109 和 110(SEQIDN0:5 或由SEQ IDN0:4编码的相应氨基酸）。在一些实施例中，一或多个非天然编码氨基酸在以下位置中 的一或多者被取代：74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、 94、 95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109 和 110(SEQIDN0:1)。
[0029] 在一些实施例中，一或多个非天然编码氨基酸在以下位置中的一或多者被取代： 111、 112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、 130、 131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146 和 147(SEQ IDN0:3或由SEQIDN0:2编码的相应氨基酸）。在一些实施例中，一或多个非天然编码 氨基酸在以下位置中的一或多者被取代：111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、 121、 122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、 140、141、142、143、144、145、146和147(SEQIDN0:5或由SEQIDN0:4编码的相应氨基 酸）。在一些实施例中，一或多个非天然编码氨基酸在以下位置中的一或多者被取代：111、 112、 113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、 131、 132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146 和 147(SEQID N0:1)。
[0030] 在一些实施例中，一或多个非天然编码氨基酸在以下位置中的一或多者被取代： 148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、 167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、 186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196(SEQIDN0:3或由SEQIDN0:2编码的 相应氨基酸）。在一些实施例中，一或多个非天然编码氨基酸在以下位置中的一或多者被 取代：148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、 166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、 185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196(SEQIDN0:5 或由SEQIDN0:4 编 码的相应氨基酸）。在一些实施例中，一或多个非天然编码氨基酸在以下位置中的一或多 者被取代：148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、 165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、 184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196(SEQIDN0:1)。
[0031] 在一些实施例中，一或多个非天然编码氨基酸在以下位置中的一或多者被取代： 197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、 216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231(SP，在蛋白质的 羧基端）（SEQIDN0:3或由SEQIDN0:2编码的相应氨基酸）。在一些实施例中，一或多个 非天然编码氨基酸在以下位置中的一或多者被取代：197、198、199、200、201、202、203、204、 205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、 224、225、226、227、228、229、230、231、232(即，在蛋白质的羧基端）（SEQIDN0:5 或由SEQ IDN0:4编码的相应氨基酸）。在一些实施例中，一或多个非天然编码氨基酸在以下位置中 的一或多者被取代：197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、 212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、 231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245(SP，在蛋白质的羧基 端）（SEQIDN0:1)。
[0032] 在一些实施例中，一或多个非天然编码氨基酸在以下位置中的一或多者被取代： 122、 221、192、228、146、141、180、168、128、207、178、191、220(SEQIDN0:1)。在一些实施例 中，一或多个非天然编码氨基酸在以下位置中的一或多者被取代：108、207、178、214、132、 127、166、154、114、193、164、177、206(SEQIDN0:3或由SEQIDN0:2编码的相应氨基酸）。 在一些实施例中，一或多个非天然编码氨基酸在以下位置中的一或多者被取代：109、208、 179、215、133、128、167、155、115、194、165、178、207(SEQIDN0:5 或由SEQIDN0:4 编码的 相应氨基酸）。
[0033]在一些实施例中，非天然存在的氨基酸在这些位置中的一或多者与水溶性聚合物 连接，这些位置包括（但不限于）以下位置：在1位之前（即在N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、 127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、 146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、 165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、 184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、 203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、 222、223、224、225、226、227、228、229、230、231(SP，在蛋白质的羧基端）（SEQIDN0:3 或由 SEQIDNO: 2编码的相应氨基酸）。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸在这些位置中 的一或多者与水溶性聚合物连接，这些位置包括（但不限于）以下位置：在1位之前（即 在N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、61、68、69、70、71、72、73、74、75、76、 77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、 102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、 121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、 140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、 159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、 178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、 197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、 216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232(SP，在蛋白 质的羧基端）（SEQIDN0:5或由SEQIDN0:4编码的相应氨基酸）。在一些实施例中，非 天然存在的氨基酸在这些位置中的一或多者与水溶性聚合物连接，这些位置包括（但不限 于）以下位置：在 1 位之前（即在N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、 68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、 133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、 152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、 171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、 190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、 209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、 228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245(gp，在 蛋白质的羧基端）（SEQIDΝΟ:1)。
[0034] 在一些实施例中，非天然存在的氨基酸在这些位置中的一或多者与水溶性聚合物 连接，这些位置包括（但不限于）以下位置：在1位之前（即在N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35 和36(SEQIDN0:3或由SEQIDN0:2编码的相应氨基酸）。在一些实施例中，非天然存在 的氨基酸在这些位置中的一或多者与水溶性聚合物连接，这些位置包括（但不限于）以下 位置：在 1 位之前（即在N端）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36(SEQIDN0:5或由SEQIDN0:4 编码的相应氨基酸）。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸在这些位置中的一或多者与 水溶性聚合物连接，这些位置包括（但不限于）以下位置：在1位之前（即在N端）、1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35和36(SEQIDN0:1)。
[0035] 在一些实施例中，非天然存在的氨基酸在这些位置中的一或多者与水溶性聚合物 连接，这些位置包括（但不限于）以下位置：37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、 50、 51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72 和 73(SEQ IDNO: 3或由SEQIDNO: 2编码的相应氨基酸）。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸 在这些位置中的一或多者与水溶性聚合物连接，这些位置包括（但不限于）以下位置：37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、 63、64、65、66、67、68、69、70、71、72和73(SEQIDN0:5或由SEQIDN0:4编码的相应氨基 酸）。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸在这些位置中的一或多者与水溶性聚合物连 接，这些位置包括（但不限于）以下位置：37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51、 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72 和 73(SEQID N0:1)。
[0036] 在一些实施例中，非天然存在的氨基酸在这些位置中的一或多者与水溶性聚合物 连接，这些位置包括（但不限于）以下位置：74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、 109和110(SEQIDNO: 3或由SEQIDNO: 2编码的相应氨基酸）。在一些实施例中，非天然 存在的氨基酸在这些位置中的一或多者与水溶性聚合物连接，这些位置包括（但不限于） 以下位置：74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109 和 110(SEQIDN0:5 或由SEQ IDN0:4编码的相应氨基酸）。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸在这些位置中的一或 多者与水溶性聚合物连接，这些位置包括（但不限于）以下位置：74、75、76、77、78、79、80、 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、 105、106、107、108、109 和 110(SEQIDNO:1)。
[0037] 在一些实施例中，非天然存在的氨基酸在这些位置中的一或多者与水溶性聚合物 连接，这些位置包括（但不限于）以下位置：111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、 121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、 140、141、142、143、144、145、146和147(SEQIDN0:3或由SEQIDN0:2编码的相应氨基 酸）。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸在这些位置中的一或多者与水溶性聚合物连 接，这些位置包括（但不限于）以下位置：111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、 121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、 140、141、142、143、144、145、146和147(SEQIDN0:5或由SEQIDN0:4编码的相应氨基 酸）。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸在这些位置中的一或多者与水溶性聚合物连 接，这些位置包括（但不限于）以下位置：111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、 121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、 140、141、142、143、144、145、146 和 147(SEQIDNO:1)。
[0038] 在一些实施例中，非天然存在的氨基酸在这些位置中的一或多者与水溶性聚合物 连接，这些位置包括（但不限于）以下位置：148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、 158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、 177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、 196(SEQIDNO: 3或由SEQIDNO: 2编码的相应氨基酸）。在一些实施例中，非天然存在 的氨基酸在这些位置中的一或多者与水溶性聚合物连接，这些位置包括（但不限于）以下 位置：148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、 166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、 185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196(SEQIDN0:5 或由SEQIDN0:4 编 码的相应氨基酸）。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸在这些位置中的一或多者与水溶 性聚合物连接，这些位置包括（但不限于）以下位置：148、149、150、151、152、153、154、155、 156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、 175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、 194、195、196(SEQIDN0:1)。
[0039] 在一些实施例中，非天然存在的氨基酸在这些位置中的一或多者与水溶性聚合物 连接，这些位置包括（但不限于）以下位置：197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、 207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、 226、227、228、229、230、231(gp，在蛋白质的羧基端）（SEQIDN0:3或由SEQIDN0:2编码 的相应氨基酸）。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸在这些位置中的一或多者与水溶 性聚合物连接，这些位置包括（但不限于）以下位置：197、198、199、200、201、202、203、204、 205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、 224、225、226、227、228、229、230、231、232(即，在蛋白质的羧基端）（SEQIDN0:5 或由SEQ IDN0:4编码的相应氨基酸）。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸在这些位置中的一或 多者与水溶性聚合物连接，这些位置包括（但不限于）以下位置：197、198、199、200、201、 202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、 221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、 240、241、242、243、244、245(gp，在蛋白质的羧基端）（SEQIDN0:l)。
[0040] 在一些实施例中，非天然存在的氨基酸在这些位置中的一或多者与水溶性聚合物 连接，这些位置包括（但不限于）以下位置：122、221、192、228、146、141、180、168、128、207、 178、191、220(SEQIDN0:1)。在一些实施例中，非天然存在的氨基酸在这些位置中的一或 多者与水溶性聚合物连接，这些位置包括（但不限于）以下位置：108、207、178、214、132、 127、166、154、114、193、164、177、206(SEQIDN0:3或由SEQIDN0:2编码的相应氨基酸）。 在一些实施例中，非天然存在的氨基酸在这些位置中的一或多者与水溶性聚合物连接，这 些位置包括（但不限于）以下位置：109、208、179、215、133、128、167、155、115、194、165、 178、207(SEQIDN0:5或由SEQIDN0:4编码的相应氨基酸）。
[0041] 在一些实施例中，脂联素多肽包含调节脂联素多肽对脂联素多肽受体的亲和力的 取代、添加或缺失。在一些实施例中，脂联素多肽包含增加脂联素多肽的稳定性的取代、添 加或缺失。在一些实施例中，脂联素多肽包含选自由以下组成的群组的氨基酸取代：在脂联 素SEQIDNO: 1 中的Tyrl22、Arg221、Asnl92、Asn228、Serl46、Asnl41、Lysl80、Metl68、 Metl28、Val207、Lysl78、Glul91、Glu220或其任何组合。在一些实施例中，脂联素多肽包 含调节脂联素多肽对脂联素多肽受体的亲和力的取代、添加或缺失。在一些实施例中，月旨 联素多肽包含增加脂联素多肽的稳定性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，脂联素多 肽包含选自由以下组成的群组的氨基酸取代：在脂联素SEQID勵:3中的了71'108、4找207、 Asnl78、Asn214、Serl32、Asnl27、Lysl66、Metl54、Metll4、Vall93、Lysl64、Glul77、Glu206 或其任何组合。在一些实施例中，脂联素多肽包含调节脂联素多肽对脂联素多肽受体的亲 和力的取代、添加或缺失。在一些实施例中，脂联素多肽包含增加脂联素多肽的稳定性的 取代、添加或缺失。在一些实施例中，脂联素多肽包含选自由以下组成的群组的氨基酸取 代：在脂联素SEQIDN0:5 中的Tyrl09、Arg208、Asnl79、Asn215、Serl33、Asnl28、Lysl67、 Metl55、Metll5、Vall94、Lysl65、Glul78、Glu207或其任何组合。在一些实施例中，脂联素 多肽包含调节脂联素多肽的免疫原性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，脂联素多肽包 含调节脂联素多肽的血清半衰期或循环时间的取代、添加或缺失。
[0042] 在一些实施例中，脂联素多肽包含增加脂联素多肽的水溶性的取代、添加或缺失。 在一些实施例中，脂联素多肽包含增加在宿主细胞中所产生的脂联素多肽的可溶性的取 代、添加或缺失。
[0043] 在一些实施例中，可以用天然存在或非天然存在的氨基酸取代脂联素多肽中的氨 基酸，只要至少一个取代是用非天然编码氨基酸进行即可。
[0044] 在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、 置氣基或块基。
[0045] 在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码氨基 酸具有以下结构：
[0046]

【权利要求】
1. 一种脂联素多肽，其包含一或多个非天然编码氨基酸。
2. 根据权利要求1所述的脂联素多肽，其中所述脂联素多肽包含一或多种翻译后修 饰。
3. 根据权利要求1所述的脂联素多肽，其中所述多肽与连接基团、聚合物或生物活性 分子连接。
4. 根据权利要求3所述的脂联素多肽，其中所述多肽与水溶性聚合物连接。
5. 根据权利要求1所述的脂联素多肽，其中所述多肽与双官能聚合物、双官能连接基 团或至少一种其它脂联素多肽连接。
6. 根据权利要求5所述的脂联素多肽，其中所述双官能连接基团或双官能聚合物与第 二多肽连接。
7. 根据权利要求6所述的脂联素多肽，其中所述第二多肽是脂联素多肽。
8. 根据权利要求4所述的脂联素多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚（乙二醇）部分。
9. 根据权利要求4所述的脂联素多肽，其中所述水溶性聚合物与所述脂联素多肽中存 在的非天然编码氨基酸连接。
10. 根据权利要求1所述的脂联素多肽，其中所述脂联素多肽包含一或多个调节所述 脂联素多肽对脂联素受体的亲和力的氨基酸取代、添加或缺失。
11. 根据权利要求1所述的脂联素多肽，其中所述脂联素多肽包含一或多个提高所述 脂联素多肽的稳定性或可溶性的氨基酸取代、添加或缺失。
12. 根据权利要求1所述的脂联素多肽，其中所述脂联素多肽包含一或多个提高所述 脂联素多肽在重组宿主细胞中的表达或体外合成的氨基酸取代、添加或缺失。
13. 根据权利要求1所述的脂联素多肽，其中所述脂联素多肽包含一或多个提高所述 脂联素多肽的蛋白酶抗性的氨基酸取代、添加或缺失。
14. 根据权利要求1所述的脂联素多肽，其中所述非天然编码氨基酸对连接基团、聚合 物或生物活性分子具反应性，而所述连接基团、聚合物或生物活性分子另外对所述多肽中 的20种常见氨基酸中的任一者均不具反应性。
15. 根据权利要求1所述的脂联素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧 基、餅基、醜餅基、氣基脈基、置氣基或块基。
16. 根据权利要求15所述的脂联素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基。
17. 根据权利要求16所述的脂联素多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中η是0-10况是烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R2是H、烷基、芳基、经取代 烷基和经取代芳基；并且R3是H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团；并且R4是H、氨基酸、多 肽或羧基端修饰基团。
18. 根据权利要求15所述的脂联素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含氨氧基。
19. 根据权利要求15所述的脂联素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含酰肼基。
20. 根据权利要求15所述的脂联素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含肼基。
21. 根据权利要求15所述的脂联素多肽，其中所述非天然编码氨基酸残基包含氨基脲 基。
22. 根据权利要求15所述的脂联素多肽，其中所述非天然编码氨基酸残基包含叠氮 基。
23. 根据权利要求22所述的脂联素多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中η是0-10成是烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X是0、N、S或不存 在；m是0-10 ;R2是H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团；并且R3是H、氨基酸、多肽或羧基端 修饰基团。
24. 根据权利要求15所述的脂联素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含炔基。
25. 根据权利要求24所述的脂联素多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：
其中η是0-10成是烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X是0、N、S或不存在；m是 0-10 ;R2是H、氨基酸、多肽或氨基端修饰基团；并且R3是H、氨基酸、多肽或羧基端修饰基 团。
26. 根据权利要求4所述的脂联素多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量在约0. lkDa 与约lOOkDa之间。
27. 根据权利要求26所述的脂联素多肽，其中所述水溶性聚合物的分子量在约0. lkDa 与约50kDa之间。
28. 根据权利要求4所述的脂联素多肽，其是通过使包含含羰基氨基酸的脂联素多肽 与包含氨氧基、肼、酰肼或氨基脲基团的水溶性聚合物反应来制造。
29. 根据权利要求28所述的脂联素多肽，其中所述氨氧基、肼、酰肼或氨基脲基团通过 酰胺键与所述水溶性聚合物连接。
30. 根据权利要求4所述的脂联素多肽，其是通过使包含羰基的水溶性聚合物与包含 非天然编码氨基酸的多肽反应来制造，所述非天然编码氨基酸包含氨氧基、肼、酰肼或氨基 脲基团。
31. 根据权利要求4所述的脂联素多肽，其是通过使包含含炔氨基酸的脂联素多肽与 包含叠氮部分的水溶性聚合物反应来制造。
32. 根据权利要求4所述的脂联素多肽，其是通过使包含含叠氮基氨基酸的脂联素多 肽与包含炔部分的水溶性聚合物反应来制造。
33. 根据权利要求15所述的脂联素多肽，其中所述叠氮基或炔基通过酰胺键与水溶性 聚合物连接。
34. 根据权利要求4所述的脂联素多肽，其中所述水溶性聚合物是分支或多臂接枝聚 合物。
35. 根据权利要求34所述的脂联素多肽，其中所述分支聚合物的每一个分支的分子量 在约lkDa与约lOOkDa之间。
36. 根据权利要求1所述的脂联素多肽，其中所述多肽是脂联素拮抗剂。
37. 根据权利要求36所述的脂联素多肽，其中所述多肽包含一或多种翻译后修饰、连 接基团、聚合物或生物活性分子。
38. 根据权利要求37所述的脂联素多肽，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和 聚（乙二醇）组成的群组的部分。
39. 根据权利要求36所述的脂联素多肽，其中所述非天然编码氨基酸存在于所述脂联 素多肽的球状结构域之内。
40. 根据权利要求36所述的脂联素多肽，其中所述多肽防止脂联素受体的二聚化。
41. 根据权利要求1所述的脂联素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含糖部分。
42. 根据权利要求3所述的脂联素多肽，其中所述连接基团、聚合物或生物活性分子通 过糖部分与所述多肽连接。
43. -种经分离核酸，其包含编码脂联素多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含至少 一个选择密码子。
44. 根据权利要求43所述的经分离核酸，其中所述选择密码子选自由以下组成的群 组：琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子和四碱基密码子。
45. -种制造根据权利要求3所述的脂联素多肽的方法，所述方法包含使包含非天然 编码氨基酸的经分离脂联素多肽与包含与所述非天然编码氨基酸反应的部分的连接基团、 聚合物或生物活性分子接触。
46. 根据权利要求46所述的方法，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚（乙 二醇）组成的群组的部分。
47. 根据权利要求45所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼 基、餅基、氣基脈基、置氣基或块基。
48. 根据权利要求45所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基部分，并且所 述连接基团、聚合物或生物活性分子包含氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分。
49. 根据权利要求48所述的方法，其中所述氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分通过酰胺键 与所述连接基团、聚合物或生物活性分子连接。
50. 根据权利要求45所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸残基包含炔部分并且所 述连接基团、聚合物或生物活性分子包含叠氮部分。
51. 根据权利要求46所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸残基包含叠氮部分并且 所述连接基团、聚合物或生物活性分子包含炔部分。
52. 根据权利要求48所述的方法，其中所述叠氮基或炔部分通过酰胺键与连接基团、 聚合物或生物活性分子连接。
53. 根据权利要求46所述的方法，其中所述聚（乙二醇）部分的平均分子量在约 0. lkDa 与约 lOOkDa 之间。
54. 根据权利要求46所述的方法，其中所述聚（乙二醇）部分是分支或多臂接枝聚合 物。
55. -种组合物，其包含根据权利要求1所述的脂联素多肽和药学上可接受的载剂。
56. 根据权利要求55所述的组合物，其中所述非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连 接。
57. -种治疗患有由脂联素调节的病症的患者的方法，其包含向所述患者投与治疗有 效量的根据权利要求55所述的组合物。
58. -种细胞，其包含根据权利要求43所述的核酸。
59. 根据权利要求58所述的细胞，其中所述细胞包含正交tRNA合成酶或正交tRNA。
60. -种制造包含非天然编码氨基酸的脂联素多肽的方法，所述方法包含在允许所述 包含非天然编码氨基酸的脂联素多肽表达的条件下培养包含编码脂联素多肽并且包含选 择密码子的一或多个多核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA的细胞；并且纯化所述脂联素 多肽。
61. -种延长脂联素多肽的血清半衰期或循环时间的方法，所述方法包含用一或多个 非天然编码氨基酸取代所述脂联素多肽中的任何一或多个天然存在氨基酸。
62. -种脂联素多肽，其由多核苷酸编码，其中所述多核苷酸包含选择密码子，并且其 中所述多肽包含至少一个非天然编码氨基酸。
63. 根据权利要求62所述的脂联素多肽，其中所述非天然编码氨基酸与连接基团、聚 合物、水溶性聚合物或生物活性分子连接。
64. 根据权利要求63所述的脂联素多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚（乙二醇）部 分。
65. 根据权利要求64所述的脂联素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧 基、醜餅基、餅基、氣基脈基、置氣基或块基。
66. 根据权利要求64所述的脂联素多肽，其中所述聚（乙二醇）部分的分子量在约 0. lkDa 与约 lOOkDa 之间。
67. 根据权利要求64所述的脂联素多肽，其中所述聚（乙二醇）部分是分支或多臂接 枝聚合物。
68. 根据权利要求67所述的脂联素多肽，其中所述聚（乙二醇）部分的分子量在约 lkDa与约lOOkDa之间。
69. -种组合物，其包含根据权利要求63所述的脂联素多肽和药学上可接受的载剂。
70. -种脂联素多肽，其包含一或多个提高所述脂联素多肽在重组宿主细胞中的表达 的氨基酸取代、添加或缺失。
71. -种脂联素多肽，其包含通过共价键与所述脂联素多肽在单个氨基酸处连接的水 溶性聚合物。
72. 根据权利要求72所述的脂联素多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚（乙二醇）部 分。
73. 根据权利要求72所述的脂联素多肽，其中与所述水溶性聚合物共价连接的氨基酸 是非天然编码氨基酸。
74. 根据权利要求10所述的脂联素多肽，其中所述非天然编码氨基酸与聚（乙二醇） 分子连接。
75. -种脂联素多肽，其包含至少一个连接基团、聚合物或生物活性分子，其中所述连 接基团、聚合物或生物活性分子通过以核糖体方式并入到所述脂联素多肽中的非天然编码 氨基酸的官能团与所述脂联素多肽连接。
76. 根据权利要求75所述的多肽，其中所述多肽经单聚乙二醇化。
77. 根据权利要求75所述的多肽，其中所述多肽是脂联素多肽。
78. -种脂联素多肽，其包含与一或多个非天然编码氨基酸连接的连接基团、聚合物或 生物活性分子，其中所述非天然编码氨基酸在预先选择的位点处以核糖体方式并入所述多 肽中。
79. 根据权利要求78所述的多肽，其中所述多肽是脂联素多肽。
80. 根据权利要求1所述的脂联素多肽，其中所述脂联素多肽包含一或多个调节所述 脂联素多肽的免疫原性的氨基酸取代、添加或缺失。
81. 根据权利要求1所述的脂联素多肽，其中所述脂联素多肽包含一或多个调节所述 脂联素多肽的血清半衰期或循环时间的氨基酸取代、添加或缺失。
82. -种调节脂联素多肽的免疫原性的方法，所述方法包含用一或多个非天然编码氨 基酸取代所述脂联素多肽中的任何一或多个天然存在氨基酸。
83. -种脂联素多肽，其中所述脂联素多肽包含一或多个氨基酸取代、添加或缺失并且 其中所述脂联素多肽是多聚物。
84. 根据权利要求83所述的脂联素多肽，其中所述脂联素多肽是三聚物。
85. 根据权利要求83所述的脂联素多肽，其中所述脂联素多肽是六聚物。
86. 根据权利要求83所述的脂联素多肽，其中所述脂联素多肽是十二聚物。
【文档编号】C07K14/00GK104302659SQ201380021567
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年2月27日 优先权日:2012年2月29日
【发明者】瓦迪姆·克赖诺夫, 安娜-玛丽亚·A.·派特南 申请人:Ambrx公司