专利名称：成骨生长肽在促进造血方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及成骨生长肽(Osteogenic Growth Peptide，OPG)在促进造血方面的应用。
背景技术：
成骨生长肽(0steogenic Growth Peptide)是1988年Bab等在人和动物体内发现的一种能够促进骨细胞生长的14-氨基酸多肽。当机体骨折或骨髓损伤后，除了在骨折或受损骨髓的局部有成骨反应外，还伴有全身的成骨反应[Bab I，et al.(1985)Calcif Tissue Int.37551-555；Foldes J，et al.(1989)J Bone Miner Res.4643-646]。经深入的实验研究表明，愈合的骨髓组织能释放几种促进成骨的因子进入血循环而致全身成骨反应增强，经研究证实并分离、提纯，有一种因子被称为成骨生长肽(OsteogenicGrowth Peptide，OGP)[Bab I，et al.(1988)Endocrinology 123345-352；Bab I，et al.(1992)EMBO J 111867-1873]。进一步的研究表明，OGP的氨基酸序列为ALKRQRGTLYGFGG，与H4组蛋白C-末段的氨基酸序列相同，含有T细胞受体β链v区和枯草杆菌(Bacillus subtilis)outB区的5个残基序列[Kayne PS，et al.，(1988)Cell 5527-39；Bab I，et al.(1992)EMBO J 111867-1873]，其进化高度保守，人、鼠同源且作用特性相同。
在生理状态下，OGP存在于人和哺乳动物的血清中，主要以结合的形式，即OGP-OGP结合蛋白(OGPBP)复合物的形式存在，约占OGP总量的80％-97％[Greenberg Z，et al.(1995)JCE&M.80(8)2330-2335]。有关OGPBP的分子结构目前尚未完全明确，从有关文献报道认为可能是α2-巨球蛋白，与其他多肽调节因子相类似，OGPBP的作用可能是保护血清中的OGP以免被降解，因而能调节OGP活性部分在血清中的水平。
由于人和动物血清中天然OGP同源，进化高度保守，提示OGP可能具有重要的生理功能，对其生物活性的研究主要集中在它的成骨活性方面。从OGP与骨髓造血、骨形成之间的关系分析，OGP可能有促进骨髓造血的功能。现有的实验认为，OGP能促进正常小鼠的骨髓造血；对骨髓移植的小鼠，则能促进外源骨髓的植入和造血重建，起到辅助治疗作用。然而，这些研究还认为，OPG主要是通过促进移植的干细胞的增殖，从而增加包括红细胞和血小板在内的造血细胞的可供量。
目前肿瘤发病率高，临床上采用放疗、化疗治疗恶性肿瘤，放、化疗剂量越大，对肿瘤细胞的杀伤力越强，治愈率越高。但同时伴有严重的副作用，主要导致骨髓抑制或损伤，造成造血功能低下，免疫力下降，限制了放、化疗剂量的提高。所以促进肿瘤患者造血功能恢复，对于提高肿瘤治愈率，降低感染发生率、肿瘤复发率和死亡率非常关键。
临床上主要应用重组人粒系集落刺激因子(rhG-CSF，惠尔血)和/或重组人粒单系集落刺激因子(rhGM-CSF，升白能)促进造血功能的恢复。它们直接刺激粒系造血祖细胞增殖，缩短了白细胞和中性粒细胞恢复的时间，疗效高，但价格昂贵，工薪阶层不胜负担。
此外，rhG-CSF和rhGM-CSF的临床使用还存在一些问题(1)肿瘤和白血病细胞具有CSF的正常受体，用药后可能通过提高宿主残余肿瘤细胞的增殖增加肿瘤的复发率；(2)CSF直接刺激无自我更新能力的造血祖细胞的增殖，导致造血祖细胞的耗竭；(3)选择性促进粒系祖细胞的增殖，对红系和巨核细胞系无促进作用；(4)临床使用需密切监测白细胞的变化，严防幼稚细胞增生。
因此，本领域迫切需要开发能有效促进造血细胞增殖而对肿瘤细胞无刺激增殖作用的药物。
发明内容
本发明的目的就是提供一种促进以粒系为主的造血细胞增殖的新的促造血因子，而对部分肿瘤细胞无刺激增殖作用。
本发明的另一目的就是提供一种用于促进以粒系为主的造血细胞增殖的药物组合物。
在本发明的第一方面，提供了一种成骨生长肽(OGP)的用途，它被用于制备促进以粒细胞为主的造血细胞增殖的药物组合物。
在一优选例中，所述的药物组合物治疗以下病症或状况(1)治疗放射损伤引起的造血功能低下；(2)治疗化疗药物引起的造血功能低下；(3)促进人骨髓粒系造血祖细胞的增殖；(4)治疗白细胞减少症。
在另一优选例中，所述的药物组合物含有成骨生长肽和选自下组的促造血因子G-CSF、GM-CSF、TPO或其混合物。
在另一优选例中，OPG被用于制备促进粒细胞增殖的药物组合物。
在另一优选例中，所述的药物组合物在放疗、化疗的之前、之中、或之后使用。
在本发明的第二方面，提供了一种体外促进粒系祖细胞生长的方法，它包括步骤在适合粒系祖细胞生长的培养基中培养粒系祖细胞，其中所述的培养基含有10-14-10-5mol/L的成骨生长肽。
在本发明的优选例中，所述的培养基含有10-13-10-5mol/L的成骨生长肽，更佳地所述的培养基含有10-12-10-5mol/L的成骨生长肽。
图1显示了sOGP对小鼠4Gy照射后不同时间白细胞(WBC)数的影响。
图2显示了不同剂量sOGP对小鼠4Gy照射后第8天白细胞(WBC)数的影响。
图3显示了不同剂量sOGP对小鼠4Gy照射后第8天骨髓有核细胞数的影响。
图4显示了不同剂量sOGP对小鼠7.5Gy照射后CFU-S和脾系数的影响。
图5显示了不同剂量sOGP对正常小鼠白细胞(WBC)数的影响图6显示了不同剂量sOGP对正常小鼠骨髓有核细胞数的影响。
图7显示了不同剂量sOGP对离体正常人骨髓粒系祖细胞集落形成的作用。
图8显示了不同剂量sOGP对红白血病TF-1细胞增殖的影响。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过体外试验研究显示，sOGP能促进正常人骨髓粒系祖细胞的增殖，体外培养粒系祖细胞集落形成率在一定浓度范围内随sOGP浓度的增加而增高，呈现明显的剂量效应关系。
此外，本发明的体内实验研究也显示，sOGP能促进放射损伤和化疗药物导致的造血功能低下的恢复，小鼠4Gy照射后皮下注射sOGP能加快外周血白细胞数和骨髓有核细胞数的恢复，显著高于照射对照组，在一定剂量范围内呈剂量-效应关系；sOGP还能使7.5Gy照射小鼠的CFU-S和相应的脾系数显著高于照射对照组，促进髓外造血。而且，sOGP能促进注射化疗药物环膦酰胺小鼠的骨髓有核细胞数和外周血白细胞数的恢复，与环膦酰胺对照组相比差别显著。
本发明的动物实验研究还发现，sOGP能促进正常小鼠的骨髓有核细胞数增加15～20％，使外周血WBC数增加30～40％，血小板和红细胞增加约10％，表明sOGP以促进粒系造血为主，红系和血小板系亦有增加趋势。本发明的这些研究表明，OGP可认为是一种有效的促造血因子，可以有临床的应用前景。
此外，恢复正常造血及骨髓移植成功的先决条件之一是存在组成造血微环境的功能性基质细胞和组织，它决定了残余造血干细胞的增殖和注入的造血干细胞从外周血循环植入到骨髓组织，并支持造血。在体外骨髓长期培养中，包含基质组织的骨髓能够维持造血干细胞存活。在此培养体系中加入适量有促进造血作用的sOGP则有助于造血干细胞在体外的扩增，为移植提供更多的造血干细胞。将体内、体外方法相结合将为骨髓移植提供更为有效的解决办法。
研究认为，sOGP在体内通过刺激骨髓间质干细胞增殖，改善造血微环境(主要包括纤维组织、骨和骨细胞)，促进自然发生或诱发的骨髓抑制或损伤的造血功能恢复，并能刺激骨髓移植后的造血重建。
本文所用的OGP定义包括OPG的天然多肽、人工合成多肽、所有同系物、同分异构体或遗传变异体和所有其它变异体。
实验数据表明，OGP是一种有确定序列的单一多肽(Ala-Leu-Lys-Arg-Gln-Gly-Arg-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly)。OGP的同系物，同分异构体或遗传变异体是指含有天然OGP氨基酸序列至少约40％的保守序列，含至少约60％的保守序列的多肽优先受到保护，含至少约75％的保守序列的更为优先。较佳地，用于本发明的成骨生长肽具有如下氨基酸序列Ala-Leu-Lys-Arg-Gln-Gly-Arg-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly。
需要说明的是，OGP的其它变异体也包括在本发明的范围内。尤其包括仅通过取代保守氨基酸而获得的不同于天然OGP的任何变异体。本发明还包括各种OGP及其片段，只要纯化的多肽在体内外显现促成骨作用和促造血作用。OGP片段可能是含有6个或多于6个氨基酸的小的肽类。比OGP大的、具有促进成骨和造血作用的多肽，也包括在本发明范围内。
OGP可以通过分离、重组、和人工合成的方法制备。在本发明的优选例中，采用生化方法人工合成的sOPG与血清中天然存在的OGP结构相一致，具有促进成骨和造血的作用。
在本发明的另一方面提供了包含上述OGP多肽的药物组合物，所说的药物组合物含有作为基本活性成分的OGP多肽和药学上可接受的载体或赋形剂。该OGP多肽的药物组合物宜是无毒和剂型稳定的。
本发明所述的药物组合物具有提高人和哺乳动物造血干/祖细胞的增殖活性，促进造血重建，可用于治疗放、化疗引起或自然发生的骨髓损伤造成的造血功能低下，促进骨髓移植中外源性造血细胞的植入，缩短恢复时间，并且对部分肿瘤细胞无刺激增殖作用。
与目前临床上普遍使用的重组人粒系集落刺激因子rhG-CSF，rhGM-CSF相比较，本发明的OGP药物组合物通过促进骨髓间质干细胞增生，改善造血微环境，以利造血干/祖细胞的增殖，加快外周血细胞恢复，具有作用缓和，双向调节，易于控制等优点，且对人TF-1等白血病细胞无促进增殖作用。另外，本发明的OGP的药物组合物中发挥药效作用的主要成分具有与天然存在的人OGP相同的结构，从而显著避免了长期使用后可能造成的免疫原性。
此外，生化合成或用重组DNA技术制得的OGP肽还可用各种已知方法制成其药学上可接受的盐，特别是碱加成盐。例如，可按本领域技术人员熟知的方法，用适当的碱处理这些肽，制得酸性氨基酸的碱加成盐。
可按制药领域已知的常规方法，将OGP多肽制成适合临床上特定给药方式的药物组合物。例如可在OGP中加入适当的载体或稀释剂，如水、生理盐水、等渗葡萄糖溶液以制成可经胃肠道以外途径给药的溶液剂、注射剂、乳剂、滴鼻剂、滴眼剂。也可加入淀粉、乳糖、滑石粉、蔗糖、葡萄糖或甘油、液体石蜡、脂质体或明胶等赋形剂或载体，将OGP制成可经胃肠道途经给药的栓剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂或脂质体包裹剂。这些制剂中除含有活性成分和适当的载体或赋形剂外，还可根据需要添加其他一些辅助成分，例如一种或多种稀释剂、填充剂、乳化剂、防腐剂、表面活性剂、吸收促进剂、缓冲剂、香味剂及着色剂。
本发明的OGP药物组合物可通过各种常规给药途径给药，例如可经胃肠道内、皮下、皮内、鼻内、静脉内、肌肉内、直肠内、眼内等途径给药，但其中优选的给药途径是肌肉内注射、皮下注射、鼻喷雾或口服给药。此外，本发明的OPG药物组合物还可以在任何时候给药，例如在放疗、化疗的之前、之中、或之后使用。
综上所述，基于本发明的新发现，预期可将本发明的OGP肽或其盐或含有这些肽或其盐的药物组合物用于治疗放、化疗引起或自然发生的骨髓损伤造成的造血功能低下，加快骨髓移植的植入，促进造血重建。具体而言，OGP可应用于以下方面1.加快放射损伤致造血功能低下时以粒系为主的血细胞的恢复。
2.促进化疗药物引起造血功能低下时以粒系为主的血细胞的恢复。
3.促进人骨髓粒系造血祖细胞的增殖。
4.加快骨髓移植后的造血重建。
5.通过刺激骨髓间质干细胞、基质细胞增生，发挥造血重建的作用；6.增加供者外周血造血干细胞和造血祖细胞的数量。
7.促进长期体外骨髓培养的造血干细胞的增殖，以利于骨髓移植。
8.与其他促进造血的因子(如G-CSF，GM-CSF，TPO等)联用或配合使用，提高疗效。
9.在血液病基因治疗中起协同作用；10.在治疗骨质疏松，促骨折愈合和软骨修复的同时促进造血。
此外，随着社会的进步和经济的发展，人的寿命延长，世界正在进入老龄化社会，骨质疏松症在老年人中占有很高比例，且老年人的造血机能减退。OGP在治疗骨质疏松症，促进骨折愈合和软骨修复的同时又能促进造血，提高免疫力，改善患者的生存质量。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1成骨生长肽在放射损伤动物模型中的促造血作用该实施例的目的是观察sOGP对白细胞减少症的治疗作用，为治疗肿瘤患者放、化疗后骨髓损伤造成造血功能低下，找到安全有效的药物。
方法采用清洁级ICR小鼠，♂，体重18～20g，随机分组，每组10只。采用2种照射剂量，分2批实验进行。实验分组如下A组正常对照组，未经照射；B组照射对照组；C组惠尔血阳性药对照组，100μg/kg/天；D组OGP用药组，分为9个剂量点，(1)0.00078nmol/鼠/天；(2)0.00156nmol/鼠/天；(3)0.00625nmol/鼠/天；(4)0.025nmol/鼠/天；(5)0.10nmol/鼠/天；(6)0.40nmol/鼠/天；(7)1.60nmol/鼠/天；(8)6.40nmol/鼠/天；(9)12.80nmol/鼠/天。
实验1.
4.0Gy137Csγ射线一次照射小鼠后，连续14天皮下注射(sc)不同剂量的sOGP，检测如下指标①骨髓有核细胞数(BMNC)；②白细胞(WBC)计数于照射后第5，8，12和15天检测；实验2.
7.5Gy137Csγ射线一次照射小鼠后，连续7天sc不同剂量的sOGP，检测指标如下①内源性脾结节(CFU-S)；②脾系数；统计学处理各项数据均以x±s表示，实验数据经方差齐性检验后，采用方差分析或t检验。
结果1.sOGP对小鼠4Gy照射后不同时间外周血白细胞数的影响由图1可见，照射后第5天，100μg/kg惠尔血(即rhG-CSF)仅使小鼠WBC数比照射对照组略有增加，无显著差别，sOGP0.10和0.50nmol/鼠/天2个剂量组无作用；照射后第8天，sOGP0.10和0.50nmol/鼠剂量组和惠尔血组作用相近，均使外周血WBC数显著高于照射对照(P＜0.001)；照射后第12天，惠尔血的作用仍非常显著(P＜0.001)，sOGP也有明显的效果(P＜0.05)；照射后第15天，sOGP使WBC数增加虽仍高于照射对照，但差别不够显著。
由此可见，采用小鼠4Gy照射后第8天检测外周血白细胞数，能较好的反映sOGP促进造血的作用。
2.不同剂量的sOGP对4Gy照射小鼠外周血白细胞数的影响从图2可以看出，小鼠4.0Gy照射后第8天，外周血中WBC显著下降(P＜0.001)。连续皮下注射0.00078～12.80nmol/鼠/天不同剂量的sOGP后第8天，从0.00156nmol/鼠/天剂量组开始，随着sOGP剂量的增加，外周血WBC恢复明显加快(P＜0.01～0.001)，且在一定的剂量范围内呈剂量-效应关系。
3.sOGP对4Gy受照小鼠骨髓有核细胞数的影响由图3可见，小鼠4Gy照射后皮下注射sOGP14天，0.025～12.80nmol/鼠剂量组使骨髓有核细胞数增加显著高于照射对照(P＜0.01～0.001)，与惠尔血的作用相近。
4.sOGP对7.5Gy照射小鼠CFU-S和脾系数的影响如图4所示，亚致死剂量7.5Gy照射小鼠后第8天的脾结节测定表明，照射对照组CFU-S数较正常对照组明显增加，脾系数则显著降低。连续7天给予不同剂量的sOGP，0.02～2.5nmol/鼠/天剂量组的CFU-S显著高于照射对照组(P＜0.05～0.01)，脾系数相应也有显著增加(P＜0.05)，与惠尔血的效果相近似。
该结果提示，sOGP能保护残存的造血干细胞，促进髓外造血。
实施例2sOGP对正常小鼠造血系统的作用本实施例的目的是观察sOGP能否促进正常小鼠的造血功能，为今后临床上在治疗骨质疏松症和骨折的同时提高造血功能提供依据，以利于增强免疫力，增进治疗效果。
方法采用清洁级ICR小鼠，♂，体重18～20g，随机分组，每组10只。实验分组如下
A组空白对照组；B组sOGP用药组，分为3个剂量点，(1)0.02nmol/鼠/天；(2)0.10nmol/鼠/天；(3)0.50nmol/鼠/天。
正常小鼠连续sc sOGP14天，检测以下指标①外周血象WBC，Plt，RBC②BMNC数，③骨髓细胞分类计数。
结果1.sOGP对正常小鼠外周血白细胞、红细胞和血小板数的影响正常小鼠sc sOGP3个不同剂量0.02、0.10和0.50nmol/鼠14天后，3个剂量组使外周血WBC数比空白对照组显著增加30～40％(图5)，血小板和红细胞增加约5～10％，表明sOGP以促进粒系造血为主，红系和血小板系亦有增加趋势。
2.sOGP对正常小鼠骨髓有核细胞数及分类的影响如图6所示，sOGP3个剂量组的BMNC数比空白对照组显著增加15～20％。骨髓细胞分类计数表明，sOGP组骨髓细胞3系分类比例与空白对照小鼠相同，但sOGP组分裂指数2/6≥2，表明OGP组骨髓细胞增生较空白对照组活跃。用药组粒红比值与对照组相比，前者5/6＞1，后者3/6＞1，粒系增生较显著。OGP使骨髓的变化与外周血象相一致，促进以粒系为主的造血。
实施例3成骨生长肽的体外促造血活性本实施例的目的是观察sOGP能否在体外促进人骨髓粒系祖细胞的集落形成，为sOGP促进造血细胞增殖提供依据。
方法采用骨髓细胞半固体集落培养法。先制备骨髓细胞悬液，用RPMI-1640调节细胞浓度为1×106个/ml，在培养体系中加入不同浓度的sOGP和惠尔血，在37℃，5％CO2条件下培养11天，显微镜下计数CFU-G集落数(50个细胞以上为1个集落)。实验分为三组，即阴性对照组(不含sOGP和G-CSF)、惠尔血(G-CSF)阳性对照组和不同浓度的sOGP实验组，每实验点重复3-4皿。
结果由图7可见，sOGP各浓度梯度组使体外培养骨髓细胞形成的CFU-G集落数均明显高于阴性对照组(P＜0.05)，且集落数随着浓度的升高而增加(P＜0.05)，呈明显的剂量效应关系。惠尔血在1.33×10-4nmol/ml浓度时，粒系祖细胞集落形成数为60个左右，作用较强，与体内实验结果相对应，表明两者作用机制可能不同，惠尔血直接刺激粒系祖细胞增殖，而OGP可能通过刺激骨髓间质干细胞、改善造血微环境以及其他机制而发挥其促造血活性。
实施例4成骨生长肽对GM-CSF(升白能)依赖性人红白血病骨髓瘤细胞增殖的影响本实施例的目的是观察sOGP对GM-CSF依赖性红白血病骨髓瘤细胞(TF-1细胞株)有无增殖作用。
方法采用MTT比色法，设置阴性对照组(不含sOGP和GM-CSF)、升白能阳性对照和sOGP实验组，具体步骤如下1.细胞悬液制备细胞清洗后，以1640+20％FBS调整浓度为4×105个/ml，备用；2.96孔板加药适当稀释的sOGP和生白能对半稀释法依次加入各孔，体积50μl；3.96孔板加细胞细胞悬液50μl加入各孔；4.阴性对照孔加入1640+20％FBS，100μl。
5.培养48小时；6.MTT溶液各孔加5mg/ml的MTT液10μl，继续培养4-6小时；7.各孔加入细胞裂解液，孵育过夜；
8.比色以空白孔调零，570nm波长测A值。
结果如图8所示，升白能阳性对照组的OD值随其浓度的增加而明显升高，而在升白能低浓度段，OD值与阴性对照组极为接近，表明升白能在一定的浓度范围内，能明显促进人红白血病TF-1细胞的增殖且有明显的剂量效应关系。而sOGP各浓度梯度组的OD值与阴性对照组相近，表明在此浓度范围内，sOGP对CSF依赖性TF-1红白血病细胞无促进增殖作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.成骨生长肽的用途，其特征在于，用于制备促进以粒细胞为主的造血细胞增殖的药物组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物治疗以下病症或状况(1)治疗放射损伤引起的造血功能低下；(2)治疗化疗药物引起的造血功能低下；(3)促进人骨髓粒系造血祖细胞的增殖；(4)治疗白细胞减少症。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物含有成骨生长肽和选自下组的促造血因子G-CSF、GM-CSF、TPO或其混合物。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，用于制备促进粒细胞增殖的药物组合物。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物在放疗、化疗的之前、之中、或之后使用。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的成骨生长肽具有如下氨基酸序列Ala-Leu-Lys-Arg-Gln-Gly-Arg-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly。
7.一种体外促进粒系祖细胞生长的方法，其特征在于，在适合粒系祖细胞生长的培养基中培养粒系祖细胞，其中所述的培养基含有10-14-10-5mol/L的成骨生长肽。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的培养基含有10-13-10-5mol/L的成骨生长肽。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的培养基含有10-12-10-5mol/L的成骨生长肽。
全文摘要
成骨生长肽(Osteogenic Growth Peptide，OGP)是在人和动物体内发现的一种含14个氨基酸的多肽，它对成骨细胞生长呈双向调节作用。本发明研究结果表明，OGP除增强成骨效应外，还是一种有效的促进以粒细胞为主的造血细胞增殖的促造血因子。本发明提供了成骨生长肽在用于制备促进以粒细胞为主的造血细胞增殖的药物组合物方面的用途。还提供了利用OGP在体外促进粒系祖细胞生长的方法。与其他粒/粒－单集落刺激因子所不同的是，OGP对人TF－1等白血病细胞无刺激增殖作用。
文档编号C07K7/08GK1421244SQ0113227
公开日2003年6月4日 申请日期2001年11月23日 优先权日2001年11月23日
发明者程文英, 陈统一, 崔大敷, 陈红红, 施德源, 刘智慧, 邵云潮, 李默漪, 罗伟华, 徐萍, 岳麓 申请人:上海益众生物技术有限公司