专利名称：一种用于骨修复的矿化多肽材料及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于骨修复的矿化多肽材料及其制备方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
目前临床骨修复所用到的自体骨和异体骨存在来源短缺、免疫排斥和感染疾病的危险。生物骨组织的主要成分是胶原和羟基磷灰石。纯的羟基磷灰石具有优异的生物相容性、骨传导性和生物活性，已被广泛用于整形外科手术和齿科手术。但是纯的羟基磷灰石脆性大，韧性差，并且易从植入部位脱落，在临床上限制了它的使用。在已有技术中，本申请人曾经提出了名称为“纳米相钙磷盐/胶原/聚乳酸骨复合多孔材料的制备方法”、申请号为00107493.8、公开号为CN 1272383A的专利申请，该多孔材料对骨缺陷和骨折有良好的医疗效果。但由于目前所用胶原主要来源于动物，存在病毒隐患和免疫反应的风险。
与动物源胶原相比，多肽不仅具有胶原的固有特性，如生物相容性、生物降解性、生物粘附性、促新细胞形成和促上皮细胞形成，而且具有无病毒隐患、可加工性和低排异反应等特点，可被广泛应用于医学、美容、保健品和化妆品等多个行业。所以采用基因工程方法生产的多肽制备骨修复材料可以解决以往骨修复材料的病毒隐患和免疫排斥反应问题。
发明内容
本发明的目的是提出一种用于骨修复的矿化多肽材料及其制备方法，用人工合成的多肽材料替代已有技术中的胶原，以避免病毒隐患和免疫反应。
本发明提出的用于骨修复的矿化多肽材料，其微结构为附着钙磷盐晶体的多肽纤维的三维网络，其中的纤维由包裹着纳米钙磷盐晶体的多肽组成。
上述矿化多肽材料中的多肽的氨基酸序列具有重复的Gly-X-Y结构，其中Gly代表甘氨酸，X、Y分别为甘氨酸之外的任何一种氨基酸。
上述矿化多肽材料中的纳米钙磷盐晶体可以为羟基磷灰石、二水合磷酸氢钙、磷酸氢钙或磷酸八钙中的任何一种。
本发明提出的制备上述用于骨修复的矿化多肽材料的方法，包括以下步骤(1)在浓度为1.5×10-4-1.5×10-2g/ml的多肽的酸溶液或水溶液中边搅拌边滴加含有钙离子的溶液，滴加量为每克多肽滴加钙离子0.003～0.053mol，其中酸为盐酸、乙酸、硝酸中的一种；(2)在步骤(1)的溶液中边搅拌边缓慢滴加含有磷酸根离子的水溶液，加入的磷酸根离子与钙离子的摩尔比为Ca∶P＝1-2∶1；(3)在步骤(2)的溶液中边搅拌边滴加碱液，调节pH值为7.4-10；(4)将步骤(3)的溶液搅拌后静置，待沉淀与上清分层后，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水洗涤去除其中的可溶性盐分，使洗涤液呈中性；(5)将沉淀物放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨，即得所述的矿化多肽材料。
本发明提出的用于骨修复的矿化多肽材料，含有多肽和纳米钙磷盐，其中的多肽可以替代以往广泛用于骨修复材料的胶原，由于多肽由人工合成，因此可以大大减小病毒隐患和免疫排斥反应。本发明的矿化多肽材料，成份和结构接近天然骨，其钙磷盐晶体为纳米尺寸，具有良好的生物活性、生物相容性和生物降解性，可促进骨再生，并随新骨的生成最终降解。而且本发明解决了以往骨材料存在病毒隐患和免疫反应的问题，在治疗骨缺损和骨折等骨修复中可达到自体骨的效果，是一种具有优异的骨诱导性能和广泛应用前景的新型骨材料。
图1为本发明方法制备的矿化多肽材料的扫描电镜(SEM)照片。
图2为图1所示的矿化多肽材料的透射电镜(TEM)和选区电子衍射(SAED)图。
具体实施例方式
本发明提出的用于骨修复的矿化多肽材料，其微结构为附着钙磷盐晶体的多肽纤维的三维网络，其中的纤维由包裹着纳米钙磷盐晶体的多肽组成。其中的多肽的氨基酸序列具有重复的Gly-X-Y结构，其中Gly代表甘氨酸，X、Y分别为甘氨酸之外的任何一种氨基酸。其中的纳米钙磷盐晶体可以为羟基磷灰石(HA)、二水合磷酸氢钙(DCPD)、磷酸氢钙(DCP)、磷酸八钙(OCP)和其他存在于天然骨中的矿物。
本发明提出的制备上述用于骨修复的矿化多肽材料的方法，包括以下步骤(1)在浓度为1.5×10-4-1.5×10-2g/ml的多肽的酸溶液或水溶液中边搅拌边滴加含有钙离子的溶液，滴加量为每克多肽滴加钙离子0.003～0.053mol，其中酸为盐酸、乙酸、硝酸中的一种；(2)在步骤(1)的溶液中边搅拌边缓慢滴加含有磷酸根离子的水溶液，加入的磷酸根离子与钙离子的摩尔比为Ca∶P＝1-2∶1；(3)在步骤(2)的溶液中边搅拌边滴加碱液，调节pH值为7.4-10；(4)将步骤(3)的溶液搅拌后静置，待沉淀与上清分层后，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水洗涤去除其中的可溶性盐分，使洗涤液呈中性；(5)将沉淀物放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨，即得所述的矿化多肽材料。
在上述制备方法中，步骤(1)所述的含钙离子的溶液为氢氧化钙和钙盐中的任何一种，钙盐优选为硝酸钙、氯化钙；在上述制备方法中，步骤(2)所述的含磷酸根离子的溶液为磷酸和磷酸盐的任何一种，磷酸盐优选为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二氨、磷酸二氢氨。
本发明中用到的多肽首选合成多肽，如利用重组DNA技术，通过适合的表达宿主如细菌(例如大肠杆菌)获得的多肽。
本发明的实施例中所用的多肽为发酵的大肠杆菌中获得的多肽，这种水溶性的多肽是西安巨子生物技术股份有限公司生产的，其氨基酸序列为HDP VVL QRR DWE NPG VTQ LNR HLA HAH PPF ASD HPM GAPGPA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAPGPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPPGAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAPGPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPAGPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GAL GAHGPA GPL GPA GPP GSA GAP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAHGPA GPL GAH GPA GPL GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPAGPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAPGPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPPGAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAPGPA GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAPGPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPPGAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAPGPA GPP GSA GAP GPP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPAGPL GAH GPA GPL GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GSA GAP GPP GAP GPAGPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPPGSA GAP GPP GAP GPA GPP GSA GAP GPP GAP GPA GPP GSAGAP GPP GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAH GPA GPL GAM GAPGAT GLS AGA THG LVT CGL以下介绍
具体实施例方式
实施例11)将60g固含量1％的液态多肽溶于300ml去离子水中，滴加40ml浓度为0.5mol/L的CaCl2溶液后，继续缓慢加入浓度为0.5mol/L的H3PO4溶液24ml，滴加的同时用磁力搅拌器混合均匀。
2)在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值稳定为7.4。
3)将上述体系搅拌、静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到中性后，放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨制得干粉。
实施例21)将70g固含量1％的液态多肽溶于4500ml去离子水中，加入10ml浓度为0.2mol/L的Ca(NO3)2溶液后，继续缓慢滴加浓度为0.2mol/L的Na2HPO4溶液10ml，滴加的同时用磁力搅拌器混合均匀。
2)在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加NaOH溶液，直至pH值稳定为10.0。
3)将上述体系搅拌、静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到中性后，放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨制得干粉。
实施例31)将1.5g固态多肽溶于100ml去离子水中，加入浓度为2mol/L的Ca(NO)3溶液40ml，继续缓慢滴加40ml浓度为1mol/L的KH2PO4溶液后，滴加的同时用磁力搅拌器混合均匀。
2)在上述第一步的溶液中边搅拌边缓慢滴加KOH溶液，直至pH值为8.0。
3)将上述体系搅拌、静置，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水反复洗涤去掉其中的盐分并达到中性后，放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨制得干粉。
图1为由本发明方法的实施例1制备的矿化多肽材料的扫描电镜(SEM)照片。图中的标尺为1微米(1μm，图中显示为“um”)。这些纤维大约为30nm宽、500nm长，由覆盖着纳米羟基磷灰石的多肽构成。
图2显示了图1所示的矿化多肽骨材料的透射电镜(TEM)和选区电子衍射(SAED)图。从图中可以看出，矿化的多肽纤维由直径约6nm长度不等的纳米棒组成，这些纳米棒排列起来形成图1所示的纤维。
在选区电子衍射花样中，环形衍射对应羟基磷灰石的211晶面。两对弧形衍射分别对应羟基磷灰石的002和004晶面，意味着羟基磷灰石的c轴为择优取向。矿化多肽的这个特点与天然骨类似。在骨中，羟基磷灰石的c轴大致平行于胶原纤维长轴。
这些图片证明该材料中的多肽是矿物形核和生长的模板，本发明确实对天然骨的微结构进行了仿生。
序列表<160>1<210>1<211>1071<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1His Asp Pro Val Val Leu Gln Arg Arg Asp Trp Glu Asn Pro Gly Val1 5 10 15Thr Gln Leu Asn Arg His Leu Ala His Ala His Pro Pro Phe Ala Ser20 25 30Asp His Pro Met Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro35 40 45Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly50 55 60Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala65 70 75 80Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala85 90 95
Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly100 105 110Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro115 120 125Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala130 135 140Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly145 150 155 160Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala165 170 175Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro180 185 190Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly195 200 205Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala210 215 220Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala225 230 235 240
Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly245 250 255Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro260 265 270Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala275 280 285Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala His Gly290 295 300Pro Ala Gly Ala Leu Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Pro305 310 315 320Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Ala His Gly Pro Ala325 330 335Gly Pro Leu Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Gly340 345 350Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala355 360 365Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro370 375 380Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly
385 390 395 400Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala405 410 415Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala420 425 430Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly435 440 445Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro450 455 460Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala465 470 475 480Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly485 490 495Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala500 505 5l0Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro515 520 525Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly530 535 540
Pro Pro Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Gly Pro545 550 555 560Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala His565 570 575Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Ser Ala Gly580 585 590Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser595 600 605Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro610 615 620Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly625 630 635 640Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro645 650 655Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro660 665 670Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly675 680 685
Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro690 695 700Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro705 710 715 720Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly725 730 735Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser740 745 750Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro755 760 765Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly770 775 780Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala His Gly Pro785 790 795 800Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala His805 810 815Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly820 825 830
Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro835 840 845Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro850 855 860Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly865 870 875 880Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser885 890 895Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro900 905 910Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly915 920 925Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala930 935 940Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ser Ala945 950 955 960Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly965 970 975Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala Gly Pro
980 985 990Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Pro Ala995 1000 1005Gly Pro Pro Gly Ser Ala Gly Ala Pro Gly Pro Pro Gly Ala His1010 1015 1020Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu1025 1030 1035Gly Ala His Gly Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ala Met Gly Ala Pro1040 1045 1050Gly Ala Thr Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr His Gly Leu Val Thr1055 1060 1065Cys Gly Leu1070
权利要求
1.一种用于骨修复的矿化多肽材料，其特征在于该多肽材料的微结构为附着钙磷盐晶体的多肽纤维的三维网络，其中的纤维由包裹着纳米钙磷盐晶体的多肽组成。
2.如权利要求1所述的矿化多肽材料，其特征在于其中所述的多肽的氨基酸序列具有重复的Gly-X-Y结构，其中Gly代表甘氨酸，X、Y分别为甘氨酸之外的任何一种氨基酸。
3.如权利要求1所述的矿化多肽材料，其特征在于其中所述的纳米钙磷盐晶体为羟基磷灰石、二水合磷酸氢钙或磷酸八钙中的任何一种。
4.一种制备如权利要求1所述的用于骨修复的矿化多肽材料的方法，其特征在于该方法包括以下步骤(1)在浓度为1.5×10-4-1.5×10-2g/ml的多肽的酸溶液或水溶液中边搅拌边滴加含有钙离子的溶液，滴加量为每克多肽滴加钙离子0.003～0.053mol，其中酸为盐酸、乙酸、硝酸中的一种；(2)在步骤(1)的溶液中边搅拌边缓慢滴加含有磷酸根离子的水溶液，加入的磷酸根离子与钙离子的摩尔比为Ca∶P＝1-2∶1；(3)在步骤(2)的溶液中边搅拌边滴加碱液，调节pH值为7.4-10；(4)将步骤(3)的溶液搅拌后静置，待沉淀与上清分层后，除去上清，离心分离出沉淀，用去离子水洗涤去除其中的可溶性盐分，使洗涤液呈中性；(5)将沉淀物放入冻干机内冷冻干燥，随后将干燥物研磨，即得所述的矿化多肽材料。
全文摘要
本发明涉及一种用于骨修复的矿化多肽材料，属于生物工程技术领域。其微结构为附着钙磷盐晶体的多肽纤维的三维网络，其中的纤维由包裹着纳米钙磷盐晶体的多肽组成。其中多肽的氨基酸序列具有重复的Gly－X－Y结构，其中Gly代表甘氨酸，X、Y分别为甘氨酸之外的任何一种氨基酸，其中纳米钙磷盐晶体可以为羟基磷灰石、二水合磷酸氢钙等。本发明的矿化多肽材料，成份和结构接近天然骨，其钙磷盐晶体为纳米尺寸，具有良好的生物活性、生物相容性和生物降解性，可促进骨再生，并随新骨的生成最终降解。本发明解决了以往骨材料存在病毒隐患和免疫反应，在治疗骨缺损和骨折等骨修复中可达到自体骨的效果，具有优异的骨诱导性能。
文档编号A61L27/54GK1958082SQ20061011299
公开日2007年5月9日 申请日期2006年9月14日 优先权日2006年9月14日
发明者崔福斋, 王玉, 胡堃 申请人:清华大学, 北京奥精医药科技有限公司