作为造血刺激物的成骨生长寡肽的制作方法

专利名称：作为造血刺激物的成骨生长寡肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种相当于OGP C-末端部分的寡肽的应用，该寡肽可作为造血刺激物。更具体地说，上述寡肽能增进骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循环干细胞的数量，尤其是在化疗和放疗后。此外，本发明还提供一些应用上述寡肽及含有上述寡肽的药物组合物的方法。
背景技术：
骨与骨髓之间的生物学和生物化学相互作用尚远未被完全了解。但是，新近研究确定了骨髓衍生的成骨细胞在支持造血细胞发育中的作用[Teichman，R.S.，et al.，Hematol.4421-426(2000)]。
骨髓移植研究证实了上述两个系统间双向的相互作用。骨髓切除或放疗损伤可引发初期的局部短暂性的成骨反应[Amsel，S.，et al.，Ana t.Rec.164101-111(1969)；Patt，H.M.，and Maloney，M.A.，Exp.Hematol.3135-148(1975)]。在该成骨阶段中，小梁在骨髓腔中形成。小梁的存在是暂时的，并且在造血骨髓的重建过程中被再吸收。此外，在人骨髓捐赠者中，在切除了髂骨骨髓的大部分后，可记录到血清中骨形成标志骨钙素和碱性磷酸酶的增加[Foldes，J.，etal.，J.Bone Miner.Res.4643-646(1989)]。人成骨细胞支持人造血祖细胞的假说是相当引人感兴趣的这些细胞在不添加外源性生长因子的情况下即可产生直接刺激造血集落形成的因子。事实上，成骨细胞分泌多种细胞因子，包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)以及白介素6(IL-6)。除此之外，培养的成骨细胞还有助于维持造血干细胞中的未成熟的表型[Taichman，et al.，Blood 87518-524(1996)]。
若干这些生长因子能够在高剂量的化疗后能够增强体内的骨髓再增殖和外周干细胞的动员。其中，G-CSF、GM-CSF、IL-3(白介素3)以及SCF(干细胞因子)已经被详尽地评价过了[Bungart，B.，et al.，Br.J.haematol.76174(1990)；Lant，T.，et al.，Blood 85275(1995)；Brugger，W.，et al.，Blood 791193(1992)；Molinex，G.，et al.，Blood 78961(1991)]，而许多其他一些生长因子，如FLT-3，目前正处于临床应用的研究中[Ashihara，E.，et al.，Europ.J.Haematol.6086(1998)]。近年来，该领域中取得的一些进展使得了解骨髓的若干生理学方面的功能成为可能。此外，调控造血前体分化和增殖的活性是更具创新性的疗法的依据，这些疗法包括外周血干细胞移植、基因转染，以及离体的干细胞扩增等。尽管有这些重大的进步，但干细胞生理学的诸多方面还没有完全被阐明，并且有些因子，包括可溶性因子或细胞膜相关因子，都被认为可能参与骨髓细胞的生理学或病理学的增殖/分化。数量不断增加的显示出能够调节造血作用的药剂证明了关于造血调节物的冗余性和微妙性的关键问题[Metcaff，D.，et al.，Blood 823515(1993)]。
除了经典定义的生长因子的作用外，一些生物学试剂和细胞类型也能够改善或修饰体内和体外的治疗策略。人骨髓衍生的内皮细胞可以支持髓细胞和巨核细胞祖细胞的长期增殖和分化[Rafii，S.，et al.，Blood 863353(1995)]；辅助细胞可有助于骨髓移植后的血液恢复[Bonnet，D.，et al.，Bone Marrow Transpl.23203(1991)]；以及，对当前目标来说更让人感兴趣的是，成骨细胞可以增强小鼠中HLA非相关的骨髓移植后的植入[EL-Badri，N.S.，et al.，Exp.Hematol.26110(1998)]。
现已研究了许多化学结构以估计其在骨髓生理学上的可能作用。举例来说，粘多糖的作用已经在白血病衍生的细胞系中[Volpi，N.，etal.，Exp.Cell Res.215119(1994)]和在人脐带血衍生的干细胞的克隆源性试验中[Da Prato，I.，et al.，Leuk.Res.231015(1999)]得以评价。甚至已经合成出一些短肽用以获得血液调节和多谱系的作用，这些作用可能是通过增加基质细胞产生的细胞因子来实现的[King，A.G..，et al.，Exp.Hematol.20(4)531(1992)；Pelus，L.M.，etal.，Exp.Hematol.22239(1994)]。
特发性骨髓纤维化(IMF)是极为少见的并导致最坏的慢性骨髓纤维化疾病的预后。最初的发病过程是纯系造血干细胞的失调，其结果是导致贫血、非典型巨核细胞增生、脾肿大以及各种程度的髓外造血。相比之下，典型的基质增殖是一种反应性的现象，是由不恰当的释放巨核细胞/血小板衍生的生长因子导致的，这些因子包括血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)以及钙调蛋白[Groopman，J.，Ann.Intern.Med.92857-858(1980)；Chvapil，M.，Life Sci.161345-1361(1975)]。IMF患者的存活中值约为4年。IMF的治疗策略仍然主要是辅助地和直接地针对减轻症状和改善生活质量。最常用的方法是输血法、雄性激素和诸如羟基脲等减细胞剂。骨髓移植正日益被考虑到，但该技术仍然被认为是一种试验性方法。干扰素α(IFN-α)已经在IMF的高度增殖早期显示出很好的结果，但在该疾病的较晚期却没有或只有很小的疗效。
一些发明者以前已经证实，成骨生长肽(OGP)，一种含有14个氨基酸的高度保守的H4组蛋白相关肽，能够增加小鼠血液和骨髓的细胞含量，并增进骨髓移植物的植入[Bab，I.A.，Clin.Orthop.31364(1995)；Gurevitch，O.，et al.，Blood 884719(1996)和美国专利5,461,034]。已经从切除后骨髓再生的成骨阶段分离出OGP[Bab，I.，et al.，Endocrinology，128(5)2638(1991)]，并且在生理条件下大量存在于血液中，主要与α2-巨球蛋白(α2-M)作为一种复合物存在[Gavi sh，H，et al.，Biochemistry，3614883-14888(1997)]。体内给药后，OGP可增进骨形成和增加小梁骨量；体外给药后，OGP可刺激成骨细胞系的增殖和其中碱性磷酸酶的活性；此外，还可增强成骨细胞的有丝分裂[Grennberg，Z.，et al.，Biochim.Biophys.Acta.1178273(1993)]。除了在骨再生、造血细胞激活和成纤维细胞增殖方面的活性外，OGP在体内还能够诱导白细胞(WBC)计数的平衡增加，并且诱导接受骨髓清除辐射和同源或半同源的骨髓移植的小鼠中全部骨髓的细胞含量[Gurevitch，O.，et al.，ibid(1996)]。
OGP C-末端的五肽，命名为OGP(10-14)，该五肽可能是从与α2-M的失活的复合物上解离的全长OGP通过蛋白水解产生的，以高水平存在于哺乳动物的血清和成骨细胞培养物中[Bab，I.，et al.，J.Pept.Res.54408(1999)]。
N-末端经修饰的OGP在细胞增殖方面保留了类似OGP的剂量依赖性效应，并且现在认为羧基末端的五肽负责与可能的OGP受体结合[Gr ennberg，Z.，et al.，ibid(1993)]。此外，发明者之前已经证实在成骨MC3T3 E1细胞中，OGP(10-14)而非OGP的促有丝分裂剂量能够以时间和剂量依赖性方式增强MAP的激酶活性。这些发现表明OGP(10-14)负责下游信号传递[Gabarin，et al.，J.Cell Biol.81594-603(2001)]。此外，还证明了OGP的活性形式是其羧基末端的五肽OGP(10-14)。让人感兴趣的是，OGP(10-14)不与α2-M或其它OGPBP(OGP结合蛋白)形成复合物[Bab，I.，J.Peptide.Res.54408-414(1999)]。
因此，本发明中对合成的类似于天然OGP C-末端区域的寡肽可能存在的造血活性进行了评价。有关一些此类具有成骨活性的特定肽的描述参阅美国专利5,814,610。sOGP(10-14)被认为具有阿片或其镇痛剂的活性[Kharchenko et al.，Vepr.Med.Khim.，5(2)106-109，(1989)]。
重要的是，本发明证实了先前已知的成骨活性寡肽能够作为造血系统的刺激物。举例来说，合成的OGP衍生的被命名为OGP(10-14)的五肽在小鼠中具有多种性质，例如增加血液和骨髓的细胞含量，并增进骨髓移植的植入。在环磷酰胺(CFA)诱导再生障碍后，该五肽在外周血细胞恢复过程中显示出显著活性，并且该五肽在干细胞动员中也显示出显著活性。此外，来自IMF患者的骨髓组织样品中也可检测到合成OGP(10-14)的离体活性，并证实其离体活性能够增强造血细胞数量显著的总体增加。此外，OGP(10-14)的效应强度与IMF的严重程度直接相关。这些结果表明OGP(10-14)可能会刺激血细胞形成和挽救造血作用。
因此，本发明的一个目标是将OGP衍生的寡肽作为红细胞生长因子加以应用。本发明的这一目标和其它目标将在以下部分详细说明。
发明概述在第一个方面，本发明涉及一种药物组合物，该组合物包含至少一种作为有效成分的寡肽，该寡肽具有刺激造造血的活性。根据本发明，所使用的寡肽的分子量为200-1,000Da，并且该寡肽包含Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly、Tyr-Gly-Phe-His-Gly、Gly-Phe-Gly-Gly和Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly中任一种氨基酸序列。本发明的药物组合物可任选包含一种可药用载体、稀释剂或赋形剂。
在本方面的一项优选实施方案中，本发明的药物组合物包含一种寡肽，该寡肽是一种分子式为Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly的五肽(命名为OGP(10-14))，以及一种可药用载体。
在另一项实施方案中，本发明的药物组合物包含一种寡肽，该寡肽是一种分子式为Tyr-Gly-Phe-His-Gly的五肽。
在另一项实施方案中，本发明的药物组合物包含一种寡肽，该寡肽是一种分子式为Gly-Phe-Gly-Gly的四肽，以及一种可药用载体。
在另一项实施方案中，本发明的药物组合物包含一种含有氨基酸序列Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly的寡肽和一种可药用载体，其中优选的是，将蛋氨酸残基酰基化，即该寡肽的分子式为Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly。
本发明的药物组合物意在用于增进骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循环干细胞的数量。
在另一项实施方案中，本发明的药物组合物意在用于增进骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循环干细胞的数量，尤其是在接受化疗或放疗的患者中。
本发明的药物组合物中所用的寡肽增加循环的多谱系祖细胞的百分比。这些多谱系祖细胞是循环的早期前体CD34阳性细胞。
此外，本发明的药物组合物中所用的作为有效成分的寡肽可以增强未成熟细胞和单核细胞的恢复，并且能够选择性地增加BFU-E和GEMM中任一项的集落形成单位(CFU)。
因此，本发明的药物组合物意在用于增加白细胞(WBC)、循环的造血干细胞，以及总体的骨髓和血液的细胞含量。
在一项特别优选的实施方案中，本发明的组合物意在用于支持骨髓移植。该作用是由于寡肽在增加造血干细胞数量、加速骨髓移植中造血功能的重建，以及增加整个骨髓的细胞含量方面的活性。
根据另一项特别优选的实施方案，本发明的药物组合物意在用于对患有血液病、实体肿瘤、免疫病和/或再生障碍性贫血等疾病的接受骨髓移植的病人进行治疗。更具体地说，血液病可以是淋巴瘤、白血病、霍奇金病以及骨髓增生性疾病。具体地说，骨髓增生性疾病可以是特发性骨髓纤维化(IMF)。
在第二个方面，本发明涉及一种寡肽在药物组合物的制备中的应用，该寡肽包含Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly、Tyr-Gly-Phe-His-Gly、Gly-Phe-Gly-Gly和Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly中任一氨基酸序列，该组合物意在用于增进骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循环干细胞的数量。
在一项特定实施方案中，本发明的寡肽被用于制备一种药物组合物，该药物组合物意在用于增进骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循环干细胞的数量，尤其是在接受放疗或化疗的受试者中。
根据一项优选实施方案，上述特定寡肽被用于制备本发明的药物组合物以增加循环的多谱系祖细胞的数量。这些多谱系祖细胞是循环的早期CD34阳性前体细胞。
此外，用于制备本发明的药物组合物的寡肽可以增强未成熟细胞和单核细胞的恢复，并选择性地增加BFU-E和GEMM中任一种集落形成单位(CFU)。
因此，这种寡肽可用于制备药物组合物，该药物组合物意在用于增加白细胞(WBC)、循环的造血干细胞的数量，和/或总体的骨髓细胞含量。
更具体地说，本发明提供这些寡肽在制备一种药物组合物中的应用，该药物组合物用于支持骨髓移植。该作用是由于寡肽在增加干细胞数量、加速骨髓移植中造血功能的重建，以及增加骨髓的细胞含量方面的活性。
根据另一项特别优选的实施方案，本发明涉及将上述寡肽用于制备一种药物组合物，该药物组合物意在用于对患有血液病、实体肿瘤、免疫病和/或再生障碍性贫血等疾病的受试者进行治疗。更具体地说，血液病可以是淋巴瘤、白血病、霍奇金病或骨髓增生性疾病，尤其是特发性骨髓纤维化(IMF)。
在第三个方面，本方面提供一种用于增进骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖以及增加循环干细胞数量的方法。该方法包括将有效量的一种寡肽或本发明的组合物给药于有需要的受试者的步骤，该寡肽具有前文所述的刺激造造血的活性。可以根据一项用于增进接受放疗或化疗的患者中骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖以及增加循环干细胞数量的优选实施方案来应用本发明的这种方法。
根据这一方面的特定实施方案，本发明涉及一种用于治疗患有血液病、实体肿瘤、免疫病或再生障碍性贫血等病痛的受试者的方法。本发明的这种方法包括将治疗有效量的一种寡肽或一种含有相同成分的组合物给药于病人，该寡肽具有前文所述的刺激造造血的活性。
在另一项特定实施方案中，该方法可用于帮助对受试者进行的骨髓移植治疗。
更具体地说，上述血液病可以是淋巴瘤、白血病、霍奇金病或骨髓增生性疾病，尤其是是特发性骨髓纤维化(IMF)。
一项优选实施方案涉及一种增加造血干细胞/前体细胞数量的方法。根据本发明，该方法包括将上述细胞暴露于有效量的一种寡肽或一种含有该寡肽的组合物的步骤。该寡肽具有前文所述的刺激造造血的活性。
在一项特别优选的实施方案中，本发明的方法意在用于增强CD34阳性细胞的增殖。
在一项特别优选的实施方案中，上述细胞存在于细胞培养物中，并且该方法可离体或体外应用。
作为选择，本发明的方法可作为优选的是哺乳动物，尤其是人的体内治疗方法。
接受治疗的受试者是患有或易于血细胞水平降低的受试者，该疾病可能是由化疗、放射性疗法或骨髓移植疗法导致的。
在另一项优选实施方案中，本发明涉及一种用于在体外或离体维持和/或扩增存在于血样中的造血干细胞的方法。该方法包括从血样中分离外周血细胞、富集表达CD34抗原的血液祖细胞、在适宜条件下分散已富集的血液祖细胞，以及用前文所述的具有刺激造造血活性的一种寡肽或含有该寡肽的一种组合物处理上述细胞。
根据本发明，体内治疗涉及一种用于再增殖哺乳动物中的血细胞的方法。该方法包括将治疗有效量的一种寡肽或含有该寡肽的一种组合物给药于上述哺乳动物的步骤，该寡肽具有前文所述的刺激造造血的活性。这些造血细胞可以是红细胞系、髓细胞系或淋巴细胞系的细胞。
附图简述

图1在接受联合清除性放射疗法/BMT后的小鼠中，用sOGP(10-14)预处理对股骨髓细胞总数的一种剂量依赖性效应将OGP(10-14)以指示剂量对雌性C57 BL小鼠每天进行皮下注射，为期12天。在开始OGP(10-14)治疗后的第8天，上述小鼠接受900Rad的X射线辐射，然后将105个同源的未经选择的骨髓细胞对其进行静脉给药。在开始治疗后第14天，将上述小鼠处死并将其股骨髓细胞冲洗到磷酸盐缓冲液中。通过将制品多次抽吸以使其穿过分级注射器针头来制备单细胞悬液。用血细胞计数器进行细胞计数。对C-对照小鼠仅用磷酸盐缓冲液进行注射。由每一条件下的至少7只小鼠中获得的平均值±SD来记录数据。
缩写Fem(股骨)，MarrC(骨髓细胞)，D(天)，mou(小鼠)，premed(术前用药)，stimu(刺激)和cellu(细胞含量)。
图2A-C在造血组织受到化学清除的小鼠中，OGP(10-14)以剂量和时间依赖性方式刺激血细胞计数用环磷酰胺(CFA)以5mg/只小鼠的剂量对每只称重为25gm的雄性ICR小鼠进行化学清除，在第0天和第一天每天进行一次腹膜内注射。将OGP(10-14)溶解在“注射用灭菌水”中，并且分别在第-7至-1天和第+2至+8天，每天在颈背处以0.1ml的指示剂量或仅以水(载体)进行皮下给药。由每一条件下的20只动物中获得的平均值+SD来记录数据。*显著超过CFA+载体，P＜0.05；**显著超过1nmol的OGP(10-14)组，P＜0.05。
图2A显示总白细胞的计数。
图2B显示总单核细胞计数。
图2C显示总未成熟细胞计数。
缩写cout(对照，未处理)，veh(载体)，ce(细胞)，T(时间-天)图3在造血组织受到化学清除的小鼠中，OGP(10-14)刺激循环的CD34+/Sca-1+双阳性细胞的数量用环磷酰胺(CFA)以5mg/只小鼠的剂量对每只称重为25gm的雄性ICR小鼠进行化学清除，在第0天和第一天每天进行一次腹膜内注射。将OGP(10-14)以100nmol/ml的浓度溶解在“注射用灭菌水”中，并且分别在第-7至-1天和第+2至+8天，每天在颈背处以0.1ml的该溶液或仅以水(载体)进行皮下给药。以第+2至+8天经106UI/0.1ml的G-CSF进行CFA清除的小鼠作为阳性对照。由每一条件下的33只动物中获得的平均值±SD来记录数据。
缩写veh(载体)，T(时间-天)，*显著超过CFA+载体，P＜0.01。
图4A-COGP(10-14)治疗方案对来自造血组织受到化学清除的小鼠的骨髓的离体的集落形成单位的影响用环磷酰胺(CFA)以5mg/只小鼠的剂量对每只称重为25gm的雄性ICR小鼠进行化学清除，在第0天和第一天每天进行一次腹膜内注射。将OGP(10-14)以100nmol/ml的浓度溶解在“注射用灭菌水”中，并且在指示期内，每天在颈背处以0.1ml的该溶液或仅以水(载体)进行皮下给药。在第9天收集骨髓并分析其集落形成单位。由每一条件下的10只动物中获得的平均值±SD来记录数据。
图4A显示CFU-GM图4B显示CFU-GEMM图4C显示BFU-E缩写Colo/di(集落/平皿)，veh(载体)图5A-B骨髓活体解剖的显微摄影图5A显示，在不含OGP(10-14)的情况下经过14天的离体培养，来自特发性骨髓纤维化(IMF)患者骨髓标本的两个部分的显微摄影。
图5B显示，在含有10-8M OGP(10-14)的条件下经过14天的离体培养，来自特发性骨髓纤维化(IMF)患者骨髓标本的两个部分的显微摄影。注意经OGP(10-14)培养的标本中细胞密度增加。
图6A-B骨髓活体解剖的显微摄影图6A显示，在不含OGP(10-14)的情况下经过14天的离体培养，来自特发性骨髓纤维化(IMF)患者骨髓标本的两个部分的网状组织染色切片的显微摄影。
图6B显示，在含有10-8M OGP(10-14)的条件下经过14天的体外培养，来自特发性骨髓纤维化(IMF)患者骨髓标本的两个部分的网状组织染色切片的显微摄影。注意经OGP(10-14)处理过的组织的正常外观。
图7对IMF的回归分析特发性骨髓纤维化(IMF)患者中，血红蛋白水平和用OGP(10-14)处理的比上未处理的样品中的造血细胞数量的离体比率(T/C比)之间进行回归分析，表明IMF的严重程度与OGP(10-14)的作用具有直接关系。
缩写Hem(血红蛋白)，Hemato(造血的)，rat(比率)，cellu(细胞含量)发明详述由于许多细胞生物学领域和肽化学领域的方法已为本领域技术人员所熟知，在此就不进行详细描述了。这些方法包括肽合成和结构分析、差示细胞计数、细胞分类分析、集落形成试验，等等。关于此类方法描述的教科书有，例如，《免疫学最新技术》，Coligan etal.(eds)，John Wiley & Sons.Inc.，New York，NY，以及Stewart，J.M.and Young J.D.的《固相肽合成》，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL，pp.1-175(1984)上述出版物在此完整引入作为参考。此外，由于许多免疫学技术已为本领域技术人员所熟知，在此就不一一进行详细描述了。
文中使用的缩写词如下OGF(s)-成骨生长多肽OGPBP(s)-成骨生长多肽结合蛋白sOGF-合成的成骨生长多肽WBC-(白细胞)PBL-(外周血)CFA-(环磷酰胺)
BMT-(骨髓移植)IMF-(特发性骨髓纤维化)若干细胞药剂或可溶性药剂能够在骨与骨髓细胞的相互作用中起作用。这种相互作用可能对造血干细胞和祖细胞的定型、增殖以及分化非常重要。
OGP能够增强成骨作用和增加骨髓的细胞含量[Greenberg，Z.，etal.，ibid.(1993)；Gurevitch，O.，et al.，ibid.(1996)]。此外，OGP对成骨细胞、成纤维细胞以及骨髓基质细胞来说是一种强有丝分裂原[Greenberg，Z.，et al，J.Cellular Biochem，65359-367(1997)；Robinson，D.，et al.，J.Bone Min.Res.，10690-696(1995)]。
新近报导，在成骨细胞系中，通过百日咳毒素敏感的G蛋白，OGP能够激活有丝分裂原活化的蛋白激酶。这些活性可能限制在C-末端五肽OGP(10-14)中，因此认为OGP(10-14)是OGP的生物活性形式[Bab，I.，et al.，ibid(1999)]。鉴于上述肽在体内应用的可能性，考虑到其没有免疫原性和毒性，以及相对简单的生产方法和操作，OGP(10-14)是非常引人瞩目的。
以前的研究已经证实，用0.1-10nmol的OGP每日对正常小鼠进行为期两周的皮下注射后，该肽可诱导WBC计数增加50％以上，并可使总体的骨髓细胞含量增加大约40％[Gurevitch，O.，et al.，ibid.，(1996)]。不同细胞类型的比例不会因处理而发生改变，这一点证明对造血的多谱系活性。有趣的是，文中描述的试验中，在将CFA(环磷酰胺)给药以诱导出可逆的发育不全后，用OGP(10-14)处理过的小鼠比仅以安慰剂注射的小鼠恢复地更快，并且在所用剂量下未检测到任何毒性。
因此，在第一个方面，本发明涉及一种药物组合物，该组合物包含至少一种作为有效成分的寡肽，该寡肽具有刺激造造血的活性，并且优选的是该寡肽包含用SEQ ID Nos1，2，3和4表示Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly、Tyr-Gly-Phe-His-Gly、Gly-Phe-Gly-Gly或Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly中任一氨基酸序列，以及一种可药用载体通过骨髓中细胞的分裂而使得红细胞和白细胞更换的血细胞形成过程就称为造血作用。有关造血的综述参阅Dexter and Spooncer[Ann.Res.Cell Biol.，3423-441(1987)]。
血细胞有许多种不同的类型，这些类型属于各种不同的细胞系。在各种细胞系中，这些细胞处于不同的成熟阶段。成熟的血细胞被特化以执行不同的功能。例如，红细胞涉及O2和CO2的运输；T淋巴细胞和B淋巴细胞分别涉及细胞和抗体介导的免疫应答；血小板是负责血液凝集；而粒细胞和巨噬细胞通常作为体内的清道夫和辅助细胞。粒细胞还能够进一步分为嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和肥大细胞。
在本发明的一项特别优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含一种寡肽，该寡肽是一种分子式为Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly，用SEQ IDNO1表示的五肽。该五肽在整个本申请书中都被称为OGP(10-14)。
在另一项实施方案中，本发明的药物组合物包含一种寡肽，该寡肽是分子式为Tyr-Gly-Phe-His-Gly，用SEQ ID NO2表示的五肽。
在另一项实施方案中，本发明的药物组合物包含一种寡肽，该寡肽是分子式为Gly-Phe-Gly-Gly，用SEQ ID NO3表示的四肽。
在另一项实施方案中，本发明的药物组合物包含一种寡肽，该寡肽是分子式为Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly，用SEQ ID NO4表示的六肽，其中蛋氨酸残基可以被酰基化。
上述这些作为本发明药物组合物的有效成分的寡肽是根据已知的有机化学方法合成的。有关这种合成方法的描述参阅，例如，上述美国专利5,814,610。
根据本发明的一项优选实施方案，本发明的药物组合物意在用于增进骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循环干细胞的数量。
根据另一项实施方案，本发明的药物组合物意在用于增进接受化疗和放疗的受试者中骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循环干细胞的数量。
造血干细胞提供终生产生全部血细胞系的能力是通过在干细胞的可塑性，即产生能够生成特定血细胞系的定向祖细胞，和干细胞在未分化阶段的复制(自我更新)之间的平衡来实现的。很难确定体内调控造血干细胞的可塑性和自我更新的机制。但是，主要的作用因子都表明了细胞内在因素和环境的联合影响[Morrison，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9210302-10306(1995)]。通过使用长期的骨髓培养系统证实了造血作用微环境的重要性，该系统中，在基质组织上培养造血细胞以维持HSCs的生长，虽然频率较低[Fraser，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)；Wineman，et al.，Blood81365-372(1993)]。
造血细胞能够在培养基中维持生长的确定，使得研究工作致力于鉴定候选的“干细胞”因子。研究造血细胞因子在干细胞维持生长中的作用的方法是，在体外的干细胞群培养物中直接添加纯化的因子，然后将该培养细胞移植[Meunch，et al.，Blood 813463-3473(1993)；Wineman et al.，ibid.(1993)；Rebel，et al.，Blood83128-136(1994)]。大多已知的“早期作用”细胞因子，如IL-3、IL-6和KL，已经被证实能够刺激更定型的祖细胞的增殖，并同时维持能够长期多谱系再增殖的细胞的生长，但不能增强其增殖[综述见Williams，Blood 81(12)3169-3172(1993)；Muller-Sieburg andDeryugina，Stem Cells，13477-486(1995)]。尽管这些结果显示细胞的可塑性和再增殖功能可能是通过细胞因子的作用保持的，但是增强这些多能细胞自我更新的分子仍然是未知的。
用于本发明的药物组合物的多肽被证实能够增加循环的多谱系祖细胞的百分比。这些多谱系祖细胞是循环的早期前体CD34阳性细胞。
在人和小鼠中，原始的成熟造血祖细胞经鉴定属于一类表达被命名为CD34的表面抗原的细胞。这些细胞被称为CD34阳性细胞。在小鼠中，CD34+/Sca±双阳性细胞是一种CD34阳性造血细胞的早期亚类。在人中，类似的Sca-1细胞表面抗原是F1k2。因此，可以认为人的CD34+/F1k2双阳性细胞等同于小鼠的CD34+/Sca±双阳性细胞。
本文中，表达CD34抗原和/或F1k2受体的人造血祖细胞被称为“原始祖细胞”。相反的，既不表达CD34抗原也不表达F1k2受体的造血细胞被称为“成熟祖细胞”。因此，作为优选的实施方案，多谱系祖细胞是循环的早期前体CD34/F1k2双阳性细胞。
在此使用的“祖细胞”是指任何具有通过分化和增殖产生完全分化的、功能性的后代的能力的体细胞。祖细胞包括来自任何的组织或器官系统的祖细胞，包括，但不局限于，血液、神经、肌肉、皮肤、肠道、骨、肾脏、肝脏、胰腺、胸腺，等等。祖细胞不同于“分化细胞”，分化细胞的定义是可以具有或可以不具有增殖，即自我复制能力的细胞，但在正常的生理条件又不能经过进一步的分化以形成不同细胞类型。此外，祖细胞与异常细胞诸如癌细胞，特别是淋巴细胞也不相同，异常细胞可以增殖(自我复制)，但通常不再进一步分化，尽管表现出未成熟或未分化的状态。
祖细胞是根据其后代细胞进行定义的，例如，粒细胞/巨噬细胞集落形成祖细胞(GM-CFU)分化成为嗜中性粒细胞或巨噬细胞；原始红细胞母细胞形成单位(BFU-E)分化成为红细胞集落形成单位(CFU-E)，后者再产生成熟的红细胞。类似地，Meg-CFU、GEMM-CFU、Eos-CFU和Bas-CFU的祖细胞能够分别地分化成为巨核细胞、粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。
已经对其它多种造血祖细胞进行了性质鉴定。例如，造血祖细胞包括那些能够进行连续的分化和增殖周期以产生出八种不同的成熟造血细胞系的细胞。在造血谱系的最原始或未分化端，造血祖细胞包括造血“干细胞”。这些稀少的细胞，在骨髓中每10,000-100,000个细胞中存在一个，均具有产生超过1013个所有谱系的成熟血细胞的能力，并且在生物体生命的全过程负责维持血细胞的生产。它们在骨髓中最初是以静止状态存在，并且可通过所谓的自我更新产生完全相同的后代细胞。由此，这种未定型的祖细胞可以被描述为“全能性”细胞，即同时具有产生所有类型成熟血细胞的必要条件和充分条件。保留了产生所有血细胞系的功能，但不能够进行自我更新的祖细胞被称为“多潜能性(pluripotent)”细胞。能够产生某些血细胞系，但不能产生所有的血细胞系和不能进行自我更新的细胞被称为“多能性(multipotent)”细胞。
本发明所使用的寡肽可有效用于保持任何上述祖细胞，包括单能性祖细胞、多潜能性祖细胞和/或全能性祖细胞。上述寡肽，尤其是OGP(10-14)，已被证实对保持造血祖细胞特别有效。
在另一项优选实施方案中，作为本发明药物组合物中的有效成分的寡肽能够增强未成熟单核细胞的恢复，并选择性地增加EFU-E和GEMM中任意一种的集落形成单位(CFU)。
下文的实施例3对来自OGP(10-14)处理小鼠的造血集落形成和对照处理小鼠的造血集落形成的离体评定进行了描述。其结果表明，来自OGP(10-14)处理小鼠的培养物与仅以载体处理的对照小鼠的培养物相比，GEMM-CFU和BFU-CFU均有所增加，而阳性的G-CSF对照诱导出GM-CFU的显著增加。似乎只有当治疗开始于化学清除之前7天，处理小鼠的培养物中集落形成才会增加。用OGP(10-14)得出的体内和离体结果证实了以前报导的全长OGP与各种细胞因子相比的多谱系活性。与其他的生长因子和动员因子不同[Fleming，W.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 903760(1993)]，sOGP(10-14)能够增加外周血中造血干细胞的数量，并且不会减少骨髓干细胞的腔隙。
因此，本发明的药物组合物意在用于增加白细胞(WBC)和循环的造血干细胞的数量，以及总体的骨髓细胞含量。
在一项特别优选的实施方案中，本发明的药物组合物意在用于帮助骨髓的移植。该作用是由于寡肽在增加造血干细胞数量、加速骨髓移植中造血功能的重建，以及增加整个骨髓的细胞含量方面的活性。
如实施例1中的描述，本发明的寡肽被发现具有增进强骨髓移植物的植入，并增强造血作用的重建。骨髓移植(BMT)已经逐渐并迅速地成为治疗恶性血液病的选择，这些恶性血液病包括淋巴瘤、霍奇金病、急性白血病以及实体肿瘤，尤其是黑体瘤和乳腺癌。最近，BMT逐渐被考虑用来治疗诸如IMF(特发行骨髓纤维化)的骨髓增生性疾病。随着技术的进步，可能BMT还可以用来治疗其他灾害性疾病-AIDS、再生障碍性贫血以及自身免疫病。所有BMT的目的都是替换宿主因化疗、放疗或疾病而损伤的造血干细胞、全能性细胞和多潜能性细胞。这些干细胞可能够反复复制并分化产生所有的存在于血液中的各种细胞，即红细胞、血小板和WBC，WBC又包括淋巴细胞、单核细胞和噬中性细胞。此外，定居的巨核细胞和成骨细胞也是来自造血全能干细胞。随着干细胞的分化，它们逐渐定向定型于特定的谱系，直到这些细胞只能够形成一种上述细胞为止。
因此，根据另一项特别优选的实施方案，本发明的药物组合物可用于治疗患有血液病、实体肿瘤、免疫病或再生障碍性贫血的骨髓移植病人。更具体地说，上述血液病可以是淋巴瘤、霍奇金病或急性白血病以及骨髓增生性疾病，尤其是特发性骨髓纤维化(IMF)。
在IMF中，骨髓的红细胞发生出现进行性障碍，而异位造血发展并增长。纤维的病理性钙化和骨小梁的结构变化可能导致成骨细胞分泌的因子的绝对或相对不足，因此至少部分地造成骨髓功能受损。
在实施例4中描述的结果有力地证明了OGP(10-14)能够增加IMF患者骨髓片断培养物中骨髓造血细胞的密度，如此短的时间内，未改变纤维化。细胞的增加似乎是平衡的，但不是由于非典型细胞的增殖造成的。当然，有一点不能排除，与没有用五肽培养的样品中发现的结果相比，OGP(10-14)的确保持了培养物中IMF样品的骨髓结构和细胞含量。但是，与天然样品中发现的结果相比，在某些OGP(10-14)培养的样品中保持或甚至增加的细胞含量证实上述肽的增殖活性。但是现在还不是很清楚，究竟OGP是直接作用于血液前体细胞还是经由基质细胞或不同的细胞群，但是，至少在形态学水平上，其活性可能不依赖于微环境的显著重构。
事实上，该观察结果的一个结论就是OGP(10-14)能够体外增强人造血细胞的三种谱系的扩增。
本发明的药物组合物包含一种存在于可药用载体、赋形剂或稳定剂中的作为有效成分的前文所述的寡肽或该寡肽的混合物，以及任选的其它治疗性组分。可接受载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度上对受体是无毒的，并且包括缓冲剂，例如磷酸盐缓冲盐水和类似的生理可接受缓冲液，以及本领域已知的更常用的所有适当的载体、赋形剂和稳定剂，例如，为了在药物组合物中加入味道、颜色、润滑度等目的而添加的载体、赋形剂和稳定剂。
载体可以包括淀粉及其衍生物，纤维素酶及其衍生物，例如微晶纤维素酶、黄原胶，等等。润滑剂可以包括氢化蓖麻油等。
优选的缓冲液是磷酸盐缓冲的盐溶液(PBS)，该溶液仍需要调节摩尔渗透压浓度。
优选的药物制剂不包含载体。优选的是，通过包括静脉内注射在内的注射将该剂型用于给药。
药物组合物的制备为本领域所熟知，并在很多文章和教科书中都有描述，参阅，例如，《雷明顿药物科学》，Gennaro A R.ed.，MackPublishing Company，Eastan，Pennsylvania，1990，尤其是其中的第1521-1721页。
可以将本发明的药物组合物以单位剂型配制。该剂型还可以包括持续释放装置。可以用药学领域所熟知的任何方法制备上述组合物。这类剂型包括既无内源毒性也无疗效的生理相容性载体。这类载体的实例包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、外源凝集素、血清蛋白，如人血清白蛋白、缓冲物质，如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、中和植物脂肪酸的不饱和甘油酯、水、盐，或电解质，如硫酸精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素酶的物质，以及PEG。用于这些寡肽的局部或基于凝胶的形式的载体包括多糖，如羧甲基纤维素钠或甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸脂、聚氧乙烯嵌段聚合物、PEG，以及木醇。对所有的给药来说，适合使用传统的储存形式。这些储存形式包括，例如，微胶囊、纳米胶囊、脂质体、膏剂、吸取形式、鼻喷剂、舌下片剂和持续释放的制剂。
适当的持续释放的制剂的实例包括含有本发明寡肽的半渗透的固态疏水性聚合物基质，该基质以成形物的方式存在，例如，薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶、如美国专利No.3,377,919描述的聚交酯、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如LupronDepotsTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)，以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。某些水凝胶释放蛋白的时间较短，而诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能够使分子的释放时间超过100天。当胶囊包裹后，肽能够在体内可维持很长时间，肽暴露在37□的潮湿条件下可发生变性或聚集，导致其生物活性的丧失并有可能改变其免疫原性。可根据涉及的机制设计合理的策略以维持蛋白稳定性。例如，如果发现聚集机制是通过巯基-二硫键互换形成分子间S-S键所导致，获得稳定性的方法有，通过对含有巯基的残基进行修饰、从酸性溶液中冻干、控制湿度、使用适当的添加剂，以及开发特殊的聚合物基质组合物。
此外，持续释放的寡肽，特别是sOGP1-14组合物还可包括脂质体捕获的多肽。包含这些多肽的脂质体可由本领域已知的方法进行制备，例如，在Eppstein，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA823688-3692(1985)；Hwang，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA774030(1980)；美国专利Nos.4,485,045和4,544,545中的描述。通常，脂质体是小(大约200-800埃)单层型，其中的脂含量大于约30mol.％胆固醇，根据最适的多肽疗法来调整所选择的比例。美国专利No.5,013,556中公开了具有延长的循环时间的脂质体。
制备用于储存的上述寡肽的治疗性制剂的方法是，将具有所需纯度的这些寡肽与任选的生理可接受载体、赋形剂或稳定剂混合[《雷明顿药物科学》，第16版，Osol，A，Ed.，(1980)]为冻干块形式或水性溶液形式。可接受载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对受者是无毒的，并且包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于大约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖，以及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇和山梨醇；盐形成反离子，如钠；和/或非离子型表面活性剂，如Tween、PluronicsTM或聚乙二醇(PEG)。
此外，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或者在巨乳剂中，还可以将上述寡肽捕获在微囊体中，方法是，例如，通过凝聚技术或界面聚合(例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基甲基丙烯酸酯)微胶囊体)。这类技术公开于《雷明顿药物科学》，ibid中。
优选的是，将该药物组合物每日为所需受试者使用一次，并且优选的是，包含活性成分的剂量约为0.001-50nmol，更优选的是约为0.05-25nmol，最优选的约为0.1-10nmol。
应该明白的是，除了描述的寡肽外，本发明的移植支持组合物还可以任选包括其它治疗性组分。这类组分可以是一种或多种已知的细胞因子，例如，IL-3、IL-4、IL-5、G-CSF、GM-CSF(粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子)。当上述另外的组分掺入到组合物中时，该组合物在支持骨髓移植方面的作用能够协同增强。
作为第二个方面，本方面涉及上文所述的任一寡肽，具体为分别用SEQ ID Nos1、2、3和4表示的Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly、Tyr-Gly-Phe-His-Gl、Gly-Phe-Gly-Gly或Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly，在制备用于增进骨髓移植物的植入、造血作用重建、骨髓再增殖以及增加循环的干细胞数量的药物组合物中的应用。
此外，在此描述的寡肽还可用于制备药物组合物，该药物组合物用于加速骨髓移植物的植入、增强移植干细胞的增殖，并由此增加包括红细胞在内的全部造血细胞类型的可获得性，从而避免至少要在数周内为宿主提供这些细胞的要求；该药物组合物还可通过增加基质细胞数目和/或增强来自基质细胞的造血辅助因子的表达来改善基质造血的微环境；该药物组合物还可以增强造血干细胞表达针对造血辅助因子的受体；增强静脉给药的骨髓移植物“回巢”至宿主骨髓；增强BMT后血液细胞含量的恢复；使得可用更少的细胞数成功进行移植，从而(成倍地)减少来自供体的骨髓提取物数量，使得用少至10-15ml的移植物(替代以往的1000ml)成为可能；增加了供体外周血中造血全能性干细胞和/或多潜能性干细胞的数量，从而增加移植来自外周血的干细胞的可行性；增加了用作为移植物的体外长期骨髓培养物中造血干细胞的数量，并且还提供一种方法，用于抑制白血病患者自体移植物中肿瘤细胞的生长；增强化疗和/或放疗后骨髓和血液细胞含量的内源性恢复；并且还可增强BMT或化疗和/或放疗后定居的巨噬细胞种群的恢复。
当然，寡肽或本发明的药物组合物的治疗剂量的大小可随受试者的类群(年龄、性别等)和所要治疗疾病的性质而变化，剂量大小还可随具体使用的寡肽及其给药途径而变化。无论如何，治疗剂量都要由主治医师来进行确定。
可采用任何适宜的给药途径将本发明多肽的一种有效剂量提供给哺乳动物，特别是人。优选的是静脉给药、皮下给药以及口服给药。
作为一种优选的具体实施方案，这些寡肽被用来制备药物组合物以增加循环的多谱系祖细胞的百分比。这些多谱系祖细胞是循环的早期前体CD34阳性细胞，而优选的是，CD34/F1k2双阳性细胞。
以上说描述的“造血干细胞/祖细胞”或“原始造血细胞”是一种能够进行分化从而形成更为定型或更加成熟的血细胞类型的细胞。“造血干细胞”或“干细胞”是一种具有使受到致死性放疗的宿主进行长时间移植物植入功能的细胞。
“CD34+细胞群”可对造血干细胞进行富集。CD34+细胞群可由脐带血或骨髓中获得，例如，可根据生产商的指导，使用Miltenyi(Calforina)所销售的免疫磁珠来筛选人脐带血CD34+细胞。
此外，用于制备本发明的药物组合物的寡肽还可增强未成熟细胞和单核细胞的恢复，并还可选择性地增加BFU-E和GEMM中任意一种的集落形成单位(CFU)。
由此，可将上述寡肽应用于制备增加白细胞(WBC)和循环造血干细胞数量以及总体的骨髓细胞含量的药物组合物。
更特别的是，本发明提供了上述多肽在制备支持骨髓移植的药物组合物中的应用。这一效应是由于寡肽增加干细胞数量、加速骨髓移植中造血功能的重建以及增加骨髓细胞含量的活性。
根据另一特定优选实施方案，本发明涉及上述寡肽在用以治疗患有血液病、实体肿瘤、免疫病以及再生障碍性贫血的患者的药物组合物的制备中的应用。更具体的是，血液病可以是淋巴瘤、白血病、霍奇金病以及骨髓增殖性疾病，特别是特发性骨髓纤维化(IMF)。
在第三个方面，本发明提供了一种方法用于增强骨髓移植物的植入、造血功能的重建，骨髓的再增殖以及增加循环干细胞的数量。该方法包括以有效量的具有上文中所描述的对造血具有刺激活性的一种寡肽或本发明药物组合物对有需要的受试者进行给药。
根据本发明的另一特定实施方案，本发明还提供了一种方法用以增强接受了化疗或放疗的患者骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再殖以及增加患者循环干细胞的数量。
在另一项实施方案中，在哺乳动物中，可应用有效量的本发明的寡肽或药物组合物，于由其外周血获得造血祖细胞之前，增强骨髓移植中移植物的植入或刺激造血干细胞的动员和/或扩增。
根据此方面的一个特定实施方案，本发明涉及到一种以治疗有效量的对造血细胞具有刺激效应的寡肽或包含该寡肽的药物组合物对受试者进行给药来治疗患有血液病、实体肿瘤、免疫病以及再生障碍性贫血的受试者的方法。
在另一特定实施方案中，可使用此方法支持通过骨髓移植受试者的治疗。
在治疗性应用中，可将本发明的寡肽或药物组合物以生理可接受的剂型，包括可作为药丸形式或在一段时间内连续输注对人进行静脉内给药的剂型来对哺乳动物，优选的是人进行给药。可选的给药途径包括有肌肉内途径、腹膜内途径、脑脊髓内途径、皮下途径、关节内途径、滑膜内途径、鞘内途径、口腔途径以及局部途径。本发明的寡肽或药物组合物还适用于以肿瘤内途径、肿瘤周围途径、病变内途径或病变周围途径进行给药或对淋巴进行给药来发挥局部和全身的治疗性效应。
用于进行体内给药的寡肽或药物组合物必须是无菌的，这一要求可以通过在冻干和重配之前或之后，使用无菌的滤膜进行过滤而容易地实现。可将寡肽储存于溶液中。治疗性寡肽组合物通常可放置于带有无菌入口的容器中，例如，一种带有可被皮下注射针头可穿透的塞子的静脉溶液袋或药瓶。
在治疗中所使用的任何一种本发明的寡肽或药物组合物的“有效量”依赖于，例如，治疗对象、给药途径以及患者的情况。因此，治疗师有必要对剂量进行浓度测定和根据要求调整给药途径以得到最适的治疗效果。典型的是，临床医生可将寡肽进行给药直到达到获得所需的治疗效果的剂量。根据前文提及的因素，用于全身治疗的标准的每日剂量可以是约0.001nmol/Kg-50nmol/Kg或更多。
另一特定实施方案涉及对携带移植物的患者进行的治疗，其中中可采用一种离体方法。在这一方法中，在将意在用于移植的细胞进行移植前，将其暴露于有效量的本发明的寡肽或组合物。
为获得足够量的用于进行移植的造血干细胞，现在可采用的最通常的方法是在供体骨的多个位点用针头和注射器抽提1升或更多的骨髓组织，这是一个要求进行全身麻醉的复杂过程。异源BMT供体通常是组织类型相容的患者同胞，有时还可以是与受体HLA表型相匹配的无血缘供体。自体移植可免除HLA匹配的要求，可用于治疗为根除实体肿瘤而接受清除性化放疗的患者。还可在出生时由脐带血中获得自体干细胞，并对其进行保存以用于未来的给药中。
在移植后和供体衍生的功能性骨髓建立之前，接受骨髓移植的患者会出现短暂而显著的全血细胞减少症，这使得患者易受感染。细菌感染和真菌感染的发病率与全血细胞减少症的严重程度和持续时间有关系[Slavin，S.Nagler，A.，《移植》(1992)]。由于同样的原因，还可使CSF不能支持红细胞生成和血小板形成。
能够支持造血的寡肽在其它方面也被证实是有效的。一些研究者已经发现，将外周血干细胞添加到骨髓干细胞中可显著地增加移植物植入的比率。由外周血中提取足够数量的干细胞是一个复杂的过程。可将上述多肽给药于供体以增加由外周血移植干细胞的可行性[Golde，D.W.，Sci.Am.36 December(1991)]。
造血和由此成功的MBT的前提是功能性基质细胞和基质组织的存在，基质细胞和基质组织能够调和造血微环境、保证注射的干细胞由循环到骨髓的回巢以及支持造血[Watson，J.D.和McKenna，H.J.Int.J.Cell Clong 10144(1992)]。骨髓衍生的基质组织还能够为在体外进行的长时间骨髓培养提供条件以用来维持干细胞。目前这一技术已足够用来维持干细胞的存活。将适宜的造血寡肽添加到这些培养基中可以在体外帮助扩增干细胞群，这样可提高用于移植细胞的数量。
体外/体内的组合方法可以为前景策略的提供基础，前景策略是关于(i)由供体的血液或骨髓中获得小量的干细胞制品以及(ii)健康的个体拥有自身的干细胞直到可能需要用这些细胞来治疗一种严重的疾病，由此可回避应用异源MBT所带来的复杂性。
因此，应用小肽诸如本申请中所描述的寡肽的治疗价值在于其可通过在体内、离体以及体外增强主要成分为纤维性组织、骨以及骨细胞的造血微环境来刺激BMT后造血功能的重建。这些肽还能够支持天然存在的或诱导的骨髓抑制状态下的造血，该状态下不一定涉及BMT。
本申请中所描述的寡肽和优选的五肽OGP(10-14)似乎直接作用于早期造血祖细胞(也就是说，造血干细胞/祖细胞)水平。这一扩增的干细胞群可以作为髓细胞生成、红细胞生成(例如，脾脏红细胞生成)以及淋巴细胞生成的细胞来源。因此，可在体外或体内，用这些寡肽来刺激和/或维持造血干细胞/祖细胞的增殖(例如，用来治疗血液病或血液病症)。
因此，一种优选实施方案涉及一种用来增强造血干细胞/祖细胞的增殖的方法。根据本发明，此方法包含将造血干细胞/祖细胞暴露于有效量的对造血干细胞具有刺激活性的寡肽或上文所描述的含有该寡肽的组合物的步骤。根据本发明，这样的暴露有效地增强上述细胞的增殖。
术语“增强细胞增殖”包括在体外或体内增加细胞相对于未处理的细胞的生长和/或增殖的程度的步骤。可通过在细胞暴露于所关注分子之前和之后对细胞数量进行计数来检测细胞培养物中细胞增殖的增长情况。可通过对汇合程度的显微镜检测来对增殖的程度进行定量。还可通过胸腺嘧啶核苷或BrdU掺入分析对细胞增殖进行定量。
在一项特别优选的实施方案中，本发明的方法意在用于增强一种CD34阳性细胞，优选的是F1k2阳性细胞的增殖。
本发明的寡肽或组合物可以用于在哺乳动物体内或离体增加造血干细胞/祖细胞的数目、和/或增强造血干细胞/祖细胞的增殖和/或分化、和/或维持造血干细胞/祖细胞、扩增这些细胞以及增强这些细胞和多谱系血细胞的增殖。
在一项特别优选的实施方案中，上述细胞处于细胞培养物中，因此该实施方案可以作为一种离体/体外的方法。
可选择的，本发明的方法可在被治疗细胞存在于哺乳动物中的病例中，作为一种体内的治疗方法。
“治疗”指的是治疗性疗法以及保护性或预防性措施。有需要的对象包括已经具有疾病或病症的个体和将要对疾病或病症进行预防的个体。
治疗目标的“哺乳动物”指的是可归类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养和农场动物以及动物园动物、体育运动动物或宠物，例如狗、马、猫、牛等。优选的哺乳动物是人。
在一项特定的实施方案中，应用本发明的方法进行治疗的哺乳动物是患有或易患血细胞水平减少的动物，血细胞水平可能是由于进行化疗、放疗、骨髓移植治疗或任何医原性因素或自然因素所导致的。
在癌症患者中，化疗和放疗可引起血细胞群的显著减少。每年在美国和欧洲至少有500,000癌症患者接受化疗和放疗，另外在日本每年有200,000癌症患者接受化疗和放疗。对再生障碍性贫血、原发性免疫缺陷以及急性白血病和实体肿瘤(接受全身放疗后)有价值的骨髓移植治疗已经日益为医疗团体所广泛实践。每年至少有15,000名美国人接受了骨髓移植。其它一些疾病可引起全部血细胞系或选择的某些血细胞系的减少。这些状况的例子包括贫血(包括巨细胞贫血和再生障碍性贫血)、血小板减少症、免疫性(自体免疫)血小板减少性紫癜(ITP)以及HIV诱导的ITP。
所需的药物制品能够增强这些患者的血细胞群的重建。
因此，本发明的一个目标是提供一种方法以用于增强原始造血细胞的增殖和/或分化和/或维持。这一方法可用于增强造血干细胞的增殖，并可以使血细胞系成熟。该方法对因疾病、放疗或化疗而导致造血细胞或成熟血细胞减少的哺乳动物是令人满意的。该方法还可用于由这些造血细胞离体产生这些干细胞和成熟血细胞系的扩增细胞群。
在另一项更为优选的实施方案中，本发明涉及一种方法以用于在体外/离体维持和/或扩增干细胞。该方法包括由血样中分离外周血细胞、富集表达CD34抗原的血液祖细胞、在适宜的条件下分散已富集的血液祖细胞，以及使用对造血细胞具有刺激活性的寡肽，或使用本发明的包含有作为有效成分的对造血细胞具有刺激活性的寡肽的组合物，对上述细胞进行处理。
在一项特定的实施方案中，本发明的方法可包括进一步的将已处理细胞与细胞因子接触的步骤。作为非局限性的例子，这些细胞因子可选自TPO(血小板生成素)、EPO(红细胞生成素)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、IL-1(白介素-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、LIF(白血病抑制因子)以及KL(kit配体)。
作为一项用于体内治疗的实施方案，本发明涉及一种方法以用于在哺乳动物中增殖血细胞。该方法包括使用有效量的对造血细胞具有刺激活性的本发明的寡肽或组合物对上述的哺乳动物进行给药的步骤。这些造血细胞可以是红细胞系、髓细胞系以及淋巴细胞系的细胞中的任意一种。
“淋巴细胞系”是指可以分化从而形成淋巴细胞(B-细胞或T-细胞)的造血祖细胞。同样的，“淋巴细胞生成”是指淋巴细胞形成的过程。
“红细胞系”是指可以分化从而形成红细胞的造血祖细胞，而“造血”是指红细胞形成的过程。
“髓细胞系”，在此包括除上文定义的淋巴细胞系和红细胞系之外全部的造血祖细胞，而“髓细胞生成”包括血细胞的形成(除淋巴细胞生成和红细胞生成之外)。
应该理解，由于程序步骤和材料可以略为变动，本发明所公开和描述的内容不局限于文中所公开的特定的实施例、程序步骤和材料。还应该理解，由于本发明的范围仅可通过所附权利要求及等同物加以限定，文中所使用的术语仅意在对特定的实施方案进行描述，而不意味着仅限与此。
还应该注意的是，除非额外明确规定的内容，说明书和权利要求中所使用的单数形式“一个”、“一种”以及“该”包括复数的对象。
贯穿下面的说明书和权利要求，除非额外要求的内容，单词“包括”以及其变形如“包含”和“包含有”，应被理解成仅意味着包含有一种确定的整数或步骤，或包含有一组确定的整数或步骤，但不排除包含有任何其它整数或步骤，也不排除包含有任何其它一组组分或步骤。
下文的实施例是发明者在实现本发明的各个方面时所使用的具有代表性的技术。应该意识到，所有这些技术都是用于本发明实践的具有代表性的优选实施方案，依据现有公开内容，本领域技术人员应可意识到，在不偏离本发明的精神和预期范围的基础上可对这些技术进行大量的改进。
实施例试剂1.成骨生长肽的C-末端五肽(10-14)[sOGP(10-14)]Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly；M.W.499.7(SEQ ID NO1)由PolypeptidesLaboratories Inc.(Torrance，California 90503，USA Batch No.9712-006)提供。
2.CFA-环磷酰胺(CFA，SIGMA，5mg/小鼠)用于诱导骨髓清除。
3.类Dexter培养基含有12.5％胎牛血清(FBS，Hyclone，Holland)、12.5％马血清(HS，Sigma，St Louis，MO)、0.8％必需氨基酸和0.4％非必需氨基酸(Gibco-Life technologies，USA)、1％谷氨酰胺(Sigma，St Louis，MO)、包括胆碱、叶酸、肌醇、烟碱、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素、D-泛酸钙在内的0.4％维生素(Gibco-Life technologies，USA)、1％两性霉素B(Fungizone，Bristol-Myers Squibb)、1％庆大霉素和10-6M氢化可的松的McCoy’sMedium(Gibco-Life technologies，USA)，以及存在重组人干细胞因子(50ng/mL rhSCF，Calbiochem，USA)、重组人粒细胞-单核细胞集落刺激因子(rhGM-CSF 10ng/mL，Calbiochem，USA)重组人白介素-3(rhIL-310ng/mL，Calbiochem，USA)和重组人促红细胞生长素(rhEpo2单位/mL，Sigma，St Louis，MO)，含有或不含10-8MsOGP(10-14)(Abiogen Pharma SpA Research Laboratories)的McCoy’s培养基(Gibco-Life technologies，USA)。
4.E.D.T.A酸性缓冲液(Miedodec，Bio Optica，Milan，Italy)动物*ICR雄性小鼠购自Charles River’s(Italy)，并且在特定的无病原体的条件下饲养。
*CV57Black雌性小鼠购自Hebrew Universith Medical School的动物研究室(Jerusalem，Israel)。每株小鼠在到达本发明人的实验室时称量体重为25g。
统计分析利用Fisher’s PLSD、阶乘或重复测定的方差分析(ANOVA)对组之间的差异进行比较。对集落测定使用Mann-Whitney检验。
实施例实施例1OGP(10-14)对骨髓移植物的植入的作用材料和方法用CV57 Black雌性小鼠来研究OGP(10-14)对骨髓移植物植入的可能作用。12天内每日将10μl的溶解于磷酸盐缓冲液的OGP(10-14)通过皮下注射进行给药。日剂量为每只小鼠0.001-10nmol。对照小鼠仅仅接受磷酸盐缓冲的盐水。在OGP(10-14)治疗开始后第8天，使用60Co钴源，令小鼠接受全身的单次900拉德剂量的X-射线辐射(PickerC-9，102.5拉德/分钟)。接着立即将105个随意选定的同源骨髓细胞进行静脉注射。在OGP(10-14)治疗开始后第14天处死动物，切开其股骨并除去干骺端。在磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中清洗骨髓。通过以带有刻度的注射针头对制剂进行数次抽吸制备单细胞悬浮液，并在血细胞计数器中对细胞进行计数。
结果图1显示OGP(10-14)对放疗后/移植后全部股骨髓细胞数量的刺激性作用。该作用表现出剂量依赖性，在三种最高的剂量下，统计结果显著，与PBS对照相比，细胞计数增加2倍。
实施例2OGP(10-14)毒性评定如上所示，OGP(10-14)被发现可增强骨髓移植物的植入。因此，接下来在对上述肽的药学活性进一步详细分析前，对上述肽可能存在的毒性进行评定。
在10nmol/小鼠剂量下经过15天皮下给药的55只小鼠被用来对OGP(10-14)可能存在的相关毒性进行评定，将结果与由30只用安慰剂进行治疗的对照小鼠中获得的结果相比较。没有发现存活率、行为、体重增加和肉眼可见的相关差异。在造血功能参数方面，用该肽的报导剂量进行给药不会诱导白细胞(WBC)数量、红细胞(RBC)数量、血小板(PLT)数量或血红蛋白(Hb)水平任何显著的改变。
实施例3在骨髓化学清除后OGP(10-14)刺激造血功能恢复材料和方法在这一组试验中，通过连续两天(称为“第0天”和“第一天”)在腹膜内注射环磷酰胺(CFA，SIGMA，5mg/小鼠，溶解在150ml无菌的PBS中)来诱导骨髓清除。该方法已被证实能够诱导强烈的可逆的L.D.＜30的白细胞减少症[Spangrude，G.J.et al，Science，24158(1988)]。在第一次注射后6天记录骨髓的最低细胞计数。
通过每日皮下注射0.1ml不含OGP(10-14)的载体或包含不同剂量的OGP(10-14)的载体来处理小鼠，如图2所示，用以评定OGP(10-14)对WBC差示细胞计数的影响，并且确定在进一步实验中使用的OGP(10-14)的“选择剂量”。留出一组参考基线对照不进行处理，并且既不接受CFA，也不接受含有或不含OGP(10-14)的无菌水载体(图2)。在第-12、-4、+3、+7、+14、+14、+21和第+24天通过眶后出血收集血样(图2C)。使用Coulter计数器(Sysex微细胞计数器F-800)进行差示细胞计数。
从第-7天至第+7天，每日用10nmol OGP(10-14)处理CFA清除的小鼠，将第+5、+7和+15天所采集血样接受流式细胞测量术以检测OGP(10-14)与G-CDF相当的对血液中CD34+/Sca-1+双阳性细胞的作用。在第+2-+8天将G-CSF给药。
对于细胞流式术，将从小鼠中得到的三组血样合并，并通过梯度离心得到单核细胞，将其以1×106/ml的浓度重悬在PBS中。然后，在存在特异性单克隆抗体(终稀释度1∶10)的条件下4℃孵育细胞30分钟。纯化的大鼠抗小鼠的单克隆抗体(Pharmingen，Ram34)作为底层用以检测CD34+细胞。三次清洗后，将细胞重悬于PBS，并以一种FITC多克隆山羊抗大鼠抗体(Pharmingen)孵育细胞。将样品在PBS中进一步清洗三次，并以来自Caltag的大鼠抗小鼠Sca-1(Ly.6A.2)FE行孵育。用一种无关的免疫球蛋白替代第一抗体来作为特定的对照。使用Lysis II软件，用FAC-Scan(tm)(Becton Dickinson)流式细胞仪对数据采集和分析进行评价(图3)。
如图4所示，令化学清除小鼠每日接受OGP(10-14)的治疗，用以评定OGP(10-14)不同的剂量方案。在第+15天处死小鼠，冲洗股骨髓，对单细胞悬浮液进行体外的祖细胞(集落形成)测定。将OGP(10-14)对CFU-GM、CFU-GEMM和BFU-E的作用与G-CSF对它们的作用进行比较(图4)。
祖细胞测定所有组的骨髓细胞在CFA注射后+10天恢复。将细胞在含有2％FBS的Iscove’s改进的Dulbecco Medium(IMFM)中稀释至2×106/ml，并根据制造商的建议(MethoCult，StemCell Technologies Inc，Vancouver，Canada)将细胞加入甲基纤维素培养基中。在每次鉴定中将2×104的细胞铺板。使用M3434(适用于鼠CFU-GM和CFU-GEMM分析)和M3334(适用于鼠BFU-E分析)。用重组鼠白介素-3(rmIL-3，10ng/ml)、重组人白介素-6(rhIL-6，10ng/ml)、重组鼠干细胞因子(rmSCF，50ng/ml)和重组人促红细胞生成素(rhEpo，3U/ml)补充M3434。在M3434中唯一包括因子是Epo。根据该方案流程，在14天的孵育后对每只小鼠的重复实验进行盲试。
结果在所有CFA处理组中，于第+3天进行的总WBC计数和差示WBC计数表现出显著减少(图2)。在第7天，用载体处理的化学清除组的总WBC计数恢复约两倍，这一数值仍大大低于未进行处理的对照组。另一方面，OGP(10-14)动物在所有测试剂量下表现出较高的值，而接受10nmol OGP(10-14)/天的小鼠中测量到最高计数。该组的计数接近未进行处理的对照组的记录数值(图2A)。在第7天进行的差示细胞计数也证实OGP(10-14)可通过剂量依赖性形式诱导单核细胞计数的增长和未成熟细胞计数的增长(图2B，2C)。最高剂量(10nmol)下的单核细胞计数6倍高于正常对照(图2A)；未成熟细胞的计数也显著高于对照图2C)。所有动物组的总WBC计数在第10天及之后是正常的(图2B)。但是，单核细胞计数在第7天仍表现相同的趋势，在第14天达到正常水平(图2B)。尽管除0.01nmol剂量组外，在所有剂量组中，未成熟细胞计数均有所减少，但在10nmol组仍获得最高数值。在14天及其后所有组的未成熟细胞计数都是正常的(图2C)。
在每日以10nmol OGP(10-14)进行处理的化学清除小鼠中，第5天的CD34+/S ca-1+双阳性细胞量5倍高于仅以载体进行处理的小鼠(图3)。OGP(10-14)的该作用与G-CSF相似。在+7天和+15天完成的流式细胞测量证实了相似的CD34+/Sca-1+细胞数量。然而，在+15天，OGP(10-14)处理的小鼠的较以载体和G-CSF处理的小鼠显示出显著更高的CD34+/Sca-1+细胞数量(图3)。
祖细胞试验显示，OGP(10-14)可显著刺激CFU-GEMM和BFU-E，但不刺激CFU-GM。OGP的作用显然仅出现在早于化学清除前7天开始的治疗中(图4)。OGP(10-14)对CFU-GM没有作用与其对血粒细胞计数没有显著影响一致。G-CSF仅对CFU-GM有影响。
实施例4
OGP(10-14)恢复患有特发性骨髓纤维化的病人的离体样品中造血骨髓的细胞含量材料和方法在来自患有特发性骨髓纤维化(IMF)的病人的离体骨髓样品中研究OGP(10-14)的造血活性，以鉴定其对人的功效。
在签署知情同意书后，五名IMF患者、一名硬皮病患者和两名患有其它骨髓发育异常综合征(MDS)的患者被募集加入研究。在标准的临床学方法和血液病学方法的基础上[Barosi，G.，et al.，Br.J.Haematol.104730-737(1999)]进行IMF的诊断。骨髓活组织检查显示纤维化是一个基本特征。在排除引起纤维化的其它可能原因和其它可能存在的骨髓增殖性疾病之后，最终确定IMF的诊断。具体地说，通过排除Ph染色体和bcr/abl重排的存在，可排除慢性髓细胞白血病的诊断。五名IMF患者中的三名已预先用低剂量的白消安每月给药十天，并且每天1(g 1，25(OH)2D3。表1中概括了患者的资料。
表1IMF(A-E)患者和MDS(F-G)患者的临床资料
*，正常值240-480U/L**，Ecografic测定用配备有可保证样品尽可能不变形的一次性8号活组织检查针头(TraoSys-tem MDThech，USA)，从髂后上棘取得3mm长的骨髓样品。将该样品分割成3个1cm长的部分。随机选择一个部分进行初步的形态学鉴定。在37℃下、5％CO2气中，于35mm组织培养皿中培养余下的两个片断，并用1ml含有rhSCF(50ng/ml)、rhGM-CSF(10ng/ml)、rhIL-3(10ng/ml)和rhEpo(2单位/ml)、含有或不含有10-8M OGP(10-14)的类Dexter培养基完全覆盖。每次更换一半的培养基，7天后，除恢复细胞因子和OGP(10-14)的最初浓度外，不改变培养基的组分。再过7天培养后，对骨髓样品进行组织学处理。简言之，用改良的B5固定样品，用E.D.T.A酸性缓冲液除盐，并用Giemsa、苏木精-伊红或网状组织的银渗透对切片进行染色。用I-IV级来半定量地评估骨髓的变化。IV级用于表示同正常骨髓相当的富含细胞的骨髓样品；III级代表降低的细胞含量及降低的核密度；II级样品表现出陷窝扩大；I级样品中的造血细胞极度缺乏，和/或骨髓区被陷窝区大量替代。使用整个切片区，对每个样品的至少三个等间距的组织学切片进行检测。此外，用计算机辅助的配有Leica.Qwin软件的Leica显微镜对细胞密度进行自动评定，细胞密度即细胞计数和骨髓面积的比。用OGP(10-14)处理样品的平均细胞密度与未处理样品的平均细胞密度的比率(T/C比率)来表示对每位患者结果的评定结果。
结果培养14天后，用OGP(10-14)处理的骨髓样品与来自相同患者的没有用OGP(10-14)处理的骨髓样品相比，造血细胞更加丰富(图5、6)。在所有IMF患者中，半定量分级明显提高(P＜0.05)。在非IMF患者中检测不到OGP(10-14)处理的骨髓样品和未处理的骨髓样品间的差异。计算机辅助的细胞含量评定显示在所有IMF病例中T/C比率＞1(P＜0.01)，该结果有力地表明在OGP(10-14)处理样品中细胞数量增加。此外，在每对来源于各个病人的骨髓样品中，T/C比都是统计显著的(表2)。T/C比显示出一种很高并与患者的血红蛋白水平显著的反向相关(图7)。降低的血红蛋白水平是IMF严重性的最重要的血清学指标。因此，该相关性有力证明了OGP(10-14)的作用在更严重的受影响的患者中最强。
表2计算机辅助的细胞密度评定
在用OGP(10-14)培养后，红细胞系和髓细胞系细胞的比例未发生明显变化。但是，半定量评定显示来自IMF患者的样品中巨核细胞的数量发生了1.5-10倍的减少。对于总体造血细胞含量，来源于非IMF患者的样品中未发现这种差异。
序列表<110>耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公司<120>作为造血刺激物的成骨生长寡肽<130>13361wo<140>
<141>
<160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成肽序列<400>1Tyr Gly Phe Gly Gly1 5<210>2<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成肽序列<400>2Tyr Gly Phe His Gly1 5<210>3<211>4<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成肽序列<400>3Gly Phe Gly Gly1<210>4<211>6<212>PRY<213>人工序列<220>
<223>人工序列说明合成肽序列<400>4Met Tyr Gly Phe Gly Gly1 权利要求
1.一种用于刺激造血的药物组合物，该组合物包含至少一种作为有效成分的寡肽，该寡肽对造血细胞具有刺激活性，所述寡肽的分子量为200-1,000Da，并且该寡肽具有分别用SEQ ID Nos1，2，3和4表示的Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly、Tyr-Gly-Phe-Hi s-Gly、Gly-Phe-Gly-Gly和Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly中任一氨基酸序列，以及一种可药用载体。
2.根据权利要求1的药物组合物，其中所述的寡肽是一种分子式为Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly，用SEQ ID NO1的氨基酸序列表示的五肽。
3.根据权利要求1的药物组合物，其中所述的寡肽是一种分子式为Tyr-Gly-Phe-His-Gly，用SEQ ID NO2的氨基酸序列表示的五肽。
4.根据权利要求1的药物组合物，其中所述的寡肽是一种分子式为Gly-Phe-Gly-Gly，用SEQ ID NO3的氨基酸序列表示的四肽。
5.根据权利要求1的药物组合物，其中所述的寡肽包含SEQ IDNO4所表示的氨基酸序列Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly，可任选对其进行酰基化。
6.根据权利要求1的药物组合物，其中所述寡肽的分子式为Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly。
7.根据所述任一权利要求的药物组合物，该组合物用于增进骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循环的干细胞的数量。
8.根据所述任一权利要求的药物组合物，该组合物可在接受放疗或化疗的受试者中增进骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循环的干细胞的数量。
9.根据权利要求7和8任一项的药物组合物，其中所述的寡肽增加循环的多谱系干细胞的数量。
10.根据权利要求9的药物组合物，其中所述的多谱系干细胞是循环的早期前体CD34阳性祖细胞。
11.根据权利要求9的药物组合物，其中所述的多谱系干细胞是循环的早期CD34/Flk2双阳性祖细胞。
12.根据权利要求7和8任一项的药物组合物，其中所述的寡肽增强未成熟细胞和单核细胞的恢复。
13.根据权利要求7和8任一项的药物组合物，其中所述的寡肽选择性地增加BFU-E和GEMM中任意一种的集落形成单位(CFU)。
14.根据权利要求7和8任一项的药物组合物，该组合物增加白细胞(WBC)和循环的造血干细胞的数量，以及总体的骨髓细胞含量。
15.根据权利要求7和8任一项的药物组合物，该组合物通过增加干细胞增殖、加速骨髓移植中造血功能的重建，以及增加骨髓的细胞含量来支持骨髓移植。
16.根据权利要求15的药物组合物，该组合物用于治疗患有血液病、实体肿瘤、免疫病和再生障碍性贫血中任意一种疾病的骨髓移植受试者。
17.根据权利要求16中的药物组合物，其中所述的血液病选自淋巴瘤、白血病、霍奇金病和骨髓增生性疾病。
18.根据权利要求16的药物组合物，其中所述的骨髓增生性疾病是特发性骨髓纤维化(IMF)。
19.包含分别用SEQ ID Nos1，2，3和4表示的氨基酸序列Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly、Tyr-Gly-Phe-His-Gly、Gly-Phe-Gly-Gly和Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly的任意一种寡肽在制备一种药物组合物中的应用，该组合物用于增进骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循环的干细胞的数量。
20.包含分别用SEQ ID Nos1，2，3和4表示的氨基酸序列Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly、Tyr-Gly-Phe-His-Gly、Gly-Phe-Gly-Gly和Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly的任意一种寡肽在制备一种药物组合物中的应用，该组合物用于在接受放疗或化疗的受试者中增进骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循环的干细胞的数量。
21.根据权利要求19和20任一项的应用，其中所述的寡肽是一种分子式为Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly，用SEQ ID NO1的氨基酸序列表示的五肽。
22.根据权利要求19和20任一项的应用，其中所述的寡肽是一种分子式为Tyr-Gly-Phe-His-Gly，用SEQ ID NO2的氨基酸序列表示的五肽。
23.根据权利要求19和20任一项的应用，其中所述的寡肽是一种分子式为Ac-Met-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly，用SEQ ID NO4的氨基酸序列表示的六肽。
24.根据权利要求19和20任一项的应用，其中所述的寡肽是一种分子式为Gly-Phe-Gly-Gly，用SEQ ID NO3的氨基酸序列表示的四肽。
25.根据权利要求19和20任一项的应用，所述应用为在制备一种用于增加循环的多谱系干细胞数量的药物组合物中的应用。
26.根据权利要求25的应用，其中所述的循环的多谱系干细胞是循环的早期CD34阳性祖细胞。
27.根据权利要求25的应用，其中所述的循环的多谱系干细胞是CD34/Flk2双阳性细胞。
28.权利根据要求19和20任一项的应用，所述应用为在制备一种用于增强未成熟细胞和单核细胞恢复的药物组合物中的应用。
29.根据权利要求19和20任一项的应用，所述应用为在制备一种用于选择性地增加BFU-E和GEMM中任意一种的集落形成单位(CFU)的药物组合物中的应用。
30.根据权利要求19和20任一项的应用，所述应用为在制备一种用于增加白细胞和循环的造血干细胞的数量，以及总体的骨髓细胞含量的药物组合物中的应用。
31.根据权利要求19和20任一项的应用，所述应用为在制备一种药物组合物中的应用，该组合物用于通过增加干细胞增殖、加速骨髓移植中造血功能的重建，以及增加骨髓的细胞含量来支持骨髓移植。
32.根据权利要求19和20任一项的应用，所述应用为在制备一种药物组合物中的应用，该组合物用于治疗患有血液病、实体肿瘤、免疫病和再生障碍性贫血任意一种疾病的受试者。
33.根据权利要求32的应用，其中所述的血液病是白血病、淋巴瘤、霍奇金病和骨髓增生性疾病中任意一种。
34.根据权利要求33的应用，其中所述的骨髓增生性疾病是特发行骨髓纤维化(IMF)。
35.一种用于增进骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循环的干细胞的数量的方法，该方法包括将一种有效量的权利要求1-7中任一所定义的对造血细胞具有刺激活性的寡肽或含有作为有效成分的所述寡肽的药物组合物给药于有需要的任何一种细胞或个受试者的步骤。
36.一种用于在接受化疗或放疗的患者中增进骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖，以及增加循环的干细胞的数量的方法，该方法包括将一种有效量的权利要求1-8中任一所定义的对造血细胞具有刺激活性的寡肽或含有作为有效成分的所述寡肽的药物组合物给药于有需要的任何一种细胞或受试者的步骤。
37.一种用于治疗患有血液病、实体肿瘤、免疫病和再生障碍性贫血中任意一种疾病的受试者的方法，该方法包括将一种治疗有效量的权利要求1-8中任一所定义的对造血细胞具有刺激活性的寡肽或含有作为有效成分的所述寡肽的药物组合物给药于有需要的任何一种细胞或一个受试者的步骤。
38.一种用于治疗患有血液病、实体肿瘤、免疫病和再生障碍性贫血中任意一种疾病的受试者的方法，该方法包括将一种治疗有效量的权利要求1-8中任一所定义的对造血细胞具有刺激活性的寡肽或含有作为有效成分的所述寡肽的药物组合物给药于有需要的任何一种细胞或受试者的步骤，用以通过骨髓移植支持受试者的治疗。
39.根据权利要求37和38任一项的方法，其中所述的血液病是淋巴瘤、白血病、霍奇金病和骨髓增生性疾病中的任意一种。
40.权利要求39的方法，其中所述的骨髓增生性疾病是特发性骨髓纤维化(IMF)。
41.一种用于降低骨髓移植受试者中的急性移植排斥的方法，包括将一种有效量的权利要求1-8中任一所定义的对造血细胞具有刺激活性的寡肽或含有作为有效成分的所述寡肽的药物组合物给药于所述受试者的步骤。
42.一种用于增进造血干细胞增殖的方法，包括将所述细胞暴露于一种有效量的权利要求1-8中任一所定义的对造血细胞具有刺激活性的寡肽或含有作为有效成分的所述寡肽的药物组合物的步骤。
43.根据权利要求42的方法，其中所述的细胞是CD34阳性细胞。
44.根据权利要求43的方法，其中所述的CD34阳性细胞是Flk2阳性细胞。
45.一种用于在体外和/或离体维持和/或扩增血样中的干细胞群的方法，包括从所述血样中分离外周血细胞，富集表达CD34抗原的血液祖细胞，在适当条件下分散已富集的血液祖细胞，用一种权利要求1-8中任一所定义的对造造血具有刺激活性的寡肽处理所述细胞。
46.根据权利要求35-45中任一项的方法，该方法还包括将所述细胞暴露于至少一种细胞因子。
47.根据权利要求46的方法，其中所述的细胞因子选自TPO(血小板生成素)、EPO(红细胞生成素)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、IL-1(白介素-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、LIF(白血病抑制因子)和KL(kit配体)。
48.根据权利要求41的方法，其中所述的细胞存在于细胞培养物中。
49.根据权利要求42的方法，其中所述的血样是哺乳动物血样。
50.根据权利要求49的方法，其中所述的血样是人的血样。
51.根据权利要求50的方法，其中所述的血样来源于患有或易于患血细胞水平降低的哺乳动物。
52.根据权利要求51的方法，其中所述的血细胞水平降低是由化疗、放疗或骨髓移植治疗所引起的。
53.一种用于在哺乳动物中再增殖血细胞的方法，包括将一种治疗有效量的权利要求1-8中任一所定义的对造血细胞具有刺激活性的寡肽或含有作为有效成分的所述寡肽的药物组合物给药于所述哺乳动物。
54.权利要求53的方法，其中所述的血细胞是红细胞系、髓细胞系和淋巴细胞系的细胞中的任意一种。
全文摘要
本发明涉及一种药物组合物，该组合物包含作为有效成分的与OGPC－末端部分相同或相似的寡肽，该寡肽具有刺激造造血的活性。优选使用的寡肽有Tyr－Gly－Phe－Gly－Gly、Tyr－Gly－Phe－His－Gly、Gly－Phe－Gly－Gly或Met－Tyr－Gly－Phe－Gly－Gly。更具体地说，所述寡肽能增进骨髓移植物的植入、造血功能的重建、骨髓的再增殖以及外周干细胞的动员，尤其是在化疗和放疗后。此外，本发明还提供一些治疗方法和在制备药物组合物中应用这些寡肽的方法。
文档编号A61P41/00GK1551779SQ01823671
公开日2004年12月1日 申请日期2001年7月29日 优先权日2001年7月29日
发明者I·巴比, M·肖雷伊, A·斯特耶, A·穆赫拉德, N·曼苏尔, O·古雷维特奇, Z·格里恩伯格, S·罗斯尼, S·特拉斯西亚迪, M·佩特里尼, I 巴比, 乩锬, 刮餮堑, 匾, 孜 仄, 斩 , 滓 , 绽, 锒鞑 , 鼓 申请人:耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公司, 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公