专利名称：含有解离素基因的抗癌药物和治疗方法
发明
背景技术：
领域本发明涉及表现出抑制癌转移，癌组织的血管发生及生长的活性的抗癌药物，以及利用所述药物治疗癌症的方法。更具体的，本发明涉及用于抑制癌细胞生长的脂质体复合物，以及通过将复合物导入生物体预防或治疗癌症的方法，其中所述脂质体复合物包括saxatilin的基因，所述saxatilin是一种来自于韩国产的黑眉蝮蛇(Agkistrodonsaxatilis)的新的解离素(disintegrin)。
现有技术的描述癌症是一种由非常复杂并且多种因素引起的疾病，是现代人类死亡的一个主要因素。正常细胞通过多种因素转化为癌细胞，并且癌细胞(来自不同的正常细胞)的无限生长发展形成癌组织。特定大小的癌组织诱导血管发生给组织提供必须的营养，并且组织通过由血管发生形成的血管进行转移，而且附着到身体的特定器官和生长。尤其是，已知癌组织通过第一个部位存在的癌细胞分泌一类能够抑制癌在另一个部位生长的因子。尺寸不小于3mm的癌的最初阶段可通过临床诊断很容易的观察到，并且在这个阶段可通过外科手术除去。即使癌可通过外科手术去除，但是万一如果外科手术未除去的癌细胞是在转移期间的话，手术反而具有促进癌转移的危险。因此，除一些特殊病例以外，大多数进行癌症手术的病人应该用抗癌剂或者放射性治疗进行治疗，目的在于阻止可能在手术后发生的转移引起的第二次癌症。
虽然已经发展了非常有效的抗癌药物并且至今已经被临床应用，但是大多数抗癌药物是细胞生长的抑制剂，不能从正常细胞区分癌细胞。目前还没有开发出或者应用可阻止癌转移和抑制癌生长的抗癌药物。
血管发生是指从现有的血管形成新血管的一系列过程，是提供营养和氧气的正常和重要的过程。血管发生可以在损伤，妇女月经，增殖性视网膜病，风湿性关节炎，局部缺血性心血管疾病，癌症等的恢复过程中观察到。因为血管发生非常特异性地出现在癌细胞生长和转移过程中，所以公知的作为治疗癌组织的主要目标。含有胶原蛋白，糖蛋白和异质胞外基质(ECM)的毛细血管通过从癌细胞分泌的促血管形成的因子，诸如bFGF的作用形成，并且内皮细胞通过整联蛋白的作用迁移到毛细血管与毛细血管结合。在血管发生的过程中，细胞融合物质，已知为αvβ3和αvβ5的整联蛋白是非常重要的。据报道，如果用具有Arg-Gly-Asp(RGD)的氨基酸序列、选择性拮抗整联蛋白的解离素蛋白进行处理，那么可以抑制血管发生。
Saxatilin是从韩国产的蛇血清中发现的一种解离素，具有抑制血管发生的作用。据报道，最近从E.coli表达的重组saxalitin抑制由αvβ3整联蛋白介导的癌细胞的血管发生，但是不影响对在尿囊绒膜(CAM)中正常胚胎发生必须的血管的生理形成过程。此外，据证明，日复一日接种saxatilin蛋白后抑制肿瘤细胞的生长以及血管的生成。但是，这种方法的缺点在于为了保持抗癌效果有每天注射的麻烦，很难保持恒定的浓度。为了克服这些缺点，已经实行同时使用多种抗癌治疗。但是，本发明最新证明了通过使用最近倍受关注的基因治疗可以很容易的获得长期的抗癌效果的事实，从而开发了本发明。
发明概述本发明进行了深入的研究以开发保持saxatilin长效抗癌的方法，结果我们发现，如果通过将阳离子脂质体和saxatilin基因混合制备的脂质体复合物(lipoplex)被用于处理癌组织进行基因治疗，癌细胞的生长可被长期抑制。
本发明的主要目的就是提供抑制癌细胞生长的物质。
本发明的另一个目的就是提供通过利用上述物质抑制癌细胞生长的方法。
为了达到上述目的，本发明提供了抑制癌细胞生长的脂质体复合物(lipoplex)，包括阳离子脂质体和含有序列1的saxatilin基因的表达载体。
本发明的阳离子脂质体优选为一种选自下列的脂质体含有DMDK(赖氨酸-天冬氨酸-十四烷醇)和胆固醇的脂质体，含有DMEK(赖氨酸-戊二醛酯-十四烷醇)和胆固醇的脂质体，含有DOTMA(N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-氯化三乙铵)和胆固醇的脂质体，含有DC-Chol(3β-[N-(N’N’二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇)和DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)的脂质体，和含有DOTAP(1，2-二油酰氧丙基-3-N，N，N-氯化三甲铵)和胆固醇的脂质体。本发明的saxatilin基因不仅包括序列1的碱基序列还包括其突变体和其活性片段。
作为本发明的表达载体，可以使用任一的常规表达载体。尤其是，真核表达载体优选为pAAV-CMV和pFLAG-CMV-1。
此外，本发明提供了通过利用saxatilin基因抑制癌细胞生长的方法，包括下列步骤将胆固醇与DOTAP混合，将混合物悬浮在水性介质中制备阳离子脂质体以及通过将序列1的saxatilin基因导入真核表达载体制备表达saxatilin的表达载体；将阳离子脂质体和上述表达载体混合在水性介质中并均质以制备脂质体复合物；以及将脂质体复合物导入癌组织。
附图简述本发明将参考附图以详细描述的示范性实施方案的方式进行解释，所述附图是以说明的方式给出的，因此并非限制本发明
图1显示了表达载体pAAV-CMV(a)和pFLAG-CMV-1(b)的基因结构。
图2显示了通过将saxatilin基因插入图1的表达载体制备saxatilin表达载体(pAAV-CMV-saxatilin和pFLAG-CMV-1 saxatilin)。
图3的照片显示了在293细胞中体外表达saxatilin。质粒通过基于DOTAP的阳离子脂质体导入细胞。泳道1显示分子量的标记，泳道2显示未导入的介质作为阴性对照，而泳道3显示pFLAG-CMV1-saxatilin。
图4的照片显示saxatilin基因抑制癌细胞生长的效果。在图中，A代表用B16BL6小鼠肺癌细胞，和PBS处理的对照组，而B代表用pAAV-CMV-saxatilin(25μg/小鼠)处理的实验组。
图5的照片显示saxatilin基因对癌转移的抑制效果。在图中，A代表注射PBS的对照组，而B代表在注射B16BL6细胞给小鼠后用pAAV-CMV-saxatilin处理的实验组。
图6显示表达在298细胞中的saxatilin抑制BCE细胞的生长。在图中，BCE细胞用表达在293细胞中的saxatilin处理，所述293细胞用pAAV-CMV-saxatilin在1ng/ml的bFGF存在下转染72小时并且根据saxatilin的浓度对增生的抑制加以分析。
优选实施方案的详细描述现在，将更详细的逐步描述根据本发明通过利用saxatilin基因抑制癌细胞生长的过程。
步骤1阳离子脂质体的制备胆固醇与DOTAP(1，2-二油酰氧丙基-2-N，N，N-氯化三乙铵)混合，混合物悬浮在水性介质中制备阳离子脂质体。作为水性介质，优选使用获得的脂质体可在其中稳定化的介质，诸如PBS，葡萄糖水溶液等。
步骤2表达载体的制备表达saxatilin的表达载体通过将saxatilin基因的cDNA导入真核表达载体进行制备。真核表达载体优选自pAAV-CMV和pFLAG-CMV-1。
步骤3脂质体复合物的制备阳离子脂质体和表达载体在水性介质中混合并均质以制备脂质体复合物。作为水性介质，优选使用获得的脂质体可在其中稳定化的介质，诸如PBS，葡萄糖水溶液等。脂质体和表达载体的混合比例为从2∶1到20∶1(w/w)。
步骤4脂质体复合物的注射将脂质体复合物注射到癌组织。
因为根据上述方法处理的saxatilin基因长期有效的抑制癌组织的生长和转移并且对正常组织没有损伤作用，因此可被广泛用于有效地预防和治疗癌症。
现在，本发明将参考下列实施例以详细描述的示范性实施方案的方式进行解释，所述实施例仅仅是以说明的方式给出，并显而易见对本领域技术人员来说，考虑到本发明的宗旨，本发明的范围不被这些实施例1重组蛋白的表达和浓度DOTAP和胆固醇以1∶1(v/v)比例混合。混合物均质并悬浮在生理盐水中以制备具有片层结构的阳离子脂质体。
Saxatilin基因的cDNA被导入图1的表达载体pAAV-CMV和pFLAG-CMV-1(Sigma Chem.Co.，U.S.A)分别制备saxatilin表达载体pAAV-CMV-saxatilin和pFLAG-CMV-1 saxatilin。Saxatilin基因的cDNA通过聚合酶链式反应(PCR)合成。使用CCCAAGCTTGCCACCATGGAGGCCGGAGAAGAATGT作为5-末端引物，而使用CGCGGATCCTTAGGCATGGAAGGGATT作为3-末端引物。通过聚合酶链式反应合成的DNA片段用限制酶，HindIII和BamHI进行酶切并且连接到pAAV-CMV载体和在N-末端编码FLAG(DYKDDDDK)表位的pFLAG-CMV-1载体上(图.2)。这样制备的每个表达载体导入E.coli DH5α制备转化子，然后进行培养。由此获得的每种表达载体与上述阳离子脂质体以1∶10(w/w)的比例混合。混合物悬浮在5％(w/v)的葡萄糖水溶液中，并且将悬浮液均质制备脂质体复合物。将脂质体复合物添加到稳定化介质[DMEM(Dulbecos修饰的eagle氏介质)，10mM丙酮酸钠，500U/ml青霉素和50μg/ml链霉素]中，然后在室温下稳定混合物30分钟。
真核293细胞(美国典型培养物保藏中心，ATCC)在CO2(5％v/v)条件下培养在含10％(v/v)的稳定化培养基中，并且注射含有pFLAG-CMV-1 saxatilin作为表达载体的上述稳定化的脂质体复合物。用稳定化培养基替换培养基后，细胞在相同的条件下培养10天。培养后，通过使用抗-FLAG M2抗体将293细胞裂解物进行western印迹，从而证实saxatilin得以正常表达且在真核细胞中表达载体正常表达saxatilin(图3)。
实施例2saxatilin基因抑制癌细胞的生长向50μl含有250μg阳离子脂质体的PBS中添加根据实施例1制备的25μg的pAAV-CMV-saxatilin以制备脂质体复合物lipoACS。
在喂养了7周的C57BK16小鼠的脊柱中间皮下注射B16BL6细胞(5×105)，小鼠肺癌细胞。动物喂养到癌组织的大小为50到100mm3，并分成3组。向对照组每4天静脉内注射PBS，同时向实验组静脉内注射lipoACS(25μg/动物)，然后随着时间的推移测定肿瘤的大小。如图4所示，肿瘤体积的增长率在表达的saxatilin实验组中显著降低。
实施例3saxatilin抑制癌转移的效果根据实施例2相同的方法制备脂质体复合物lipoACS。准备PBS皮下注射到喂养了7周的C57BK16小鼠的对照组，以及注射了lipoACS(25μg/动物)的实验组。向每组小鼠的尾静脉，每5天注射B16BL6细胞(4×104)[小鼠肺癌细胞]，喂养小鼠25天直到对照组的小鼠死亡。然后计算肺肿瘤的克隆数(参见表1和图5)。从表1和图5可以看出，实验组与对照组相比表现出85-93％的转移抑制效果。利用抗-saxatilin抗体对从每个实验组获得的蛋白进行蛋白质印迹。结果，在对照组中没有检测到saxatilin，而在实验组中检测到了saxatilin。因此，实验组抗癌转移的抑制效果是包含在脂质体复合物中的saxatilin基因引起的效果。
saxatilin基因对癌转移的抑制效果
实施例4表达在293细胞中的saxatilin对牛毛细血管内皮(BCE)细胞生长的抑制效果培养在含有10％FBS的DMEM培养基中的BCE细胞转化到摇瓶中使得细胞数为4×104/ml，并在37℃在5％(v/v)CO2的条件下培养在不含FBS的DMEM培养基中12小时。然后，用通过在293细胞中的pAAV-CMV-saxatilin表达载体表达的saxatilin进行处理。20分钟后，加入1ng/ml的bFGF，并且将混合物在37℃在5％(v/v)CO2的条件下培养在含5％FBS的DMEM培养基中72小时。比较存活的细胞数，测定生长抑制率。如图6所示，BCE细胞的生长的抑制与加入的saxatilin的量成正比。在saxatilin为2μg/ml时，出现90％或者更强的抑制效果。
如上所述，本发明提供了通过使用saxatilin基因抑制癌细胞生长的方法，包括下列步骤将胆固醇与DOTAP混合，将混合物悬浮在水性介质中制备阳离子脂质体以及通过将saxatilin基因导入真核表达载体中制备用于表达saxatilin的表达载体；将阳离子脂质体和上述表达载体混合在水性介质中并均质以制备脂质体复合物；以及将脂质体复合物导入癌组织。
根据本发明，通过利用saxatilin基因可以进行长期稳定的抗癌治疗。
序列表<110>郑光会(CHUNG，KWANG-HOE)<120>含有解离素基因的抗癌药物和治疗方法(Anti-cancer agents comprising disintegrin genes and the treating methods)<130>SCT040639-47<160>3<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>222<212>DNA<213>黑眉腹蛇(Agkistrodon saxatilis)<400>1gaggccggag aagaatgtga ctgtggcgct cctgcaaatc cgtgctgcga tgctgcaacc60tgtaaactga gaccaggggc gcagtgtgca gaaggactgt gttgtgacca gtgcagattt120atgaaagaag gaacaatatg ccggatggca aggggtgatg acatggatga ttactgcaat180ggcatatctg ctggctgtcc cagaaatccc ttccatgcct aa 222<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR扩增saxatilin基因的5’引物<400>2
cccaagcttg ccaccatgga ggccggagaa gaatgt 36<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223)PCR扩增saxatilin基因的3’引物<400>3cgcggatcct taggcatgga agggatt2权利要求
1.一种抑制癌生长的脂质体复合物，包括(a)阳离子脂质体和(b)含有序列1的saxatilin基因的表达载体。
2.根据权利要求1的脂质体复合物，其中所述阳离子脂质体为一种选自含有DMDK和胆固醇的脂质体，含有DMEK和胆固醇的脂质体，含有DOTMA和胆固醇的脂质体，含有DC-Chol和DOPE的脂质体，和含有DOTAP和胆固醇的脂质体。
3.根据权利要求1的脂质体复合物，其中表达载体为pAAV-CMA或者pFLAG-CMV-1。
4.一种通过利用saxatilin基因抑制癌生长的方法，包括下列步骤(a)将胆固醇与DOTAP混合，使混合物悬浮在水性介质中制备阳离子脂质体以及把序列1的saxatilin基因导入真核表达载体；(b)将阳离子脂质体和上述表达载体混合在水性介质中并且均质以制备脂质体复合物；以及(c)将脂质体复合物导入癌组织。
5.根据权利要求4所述的通过利用saxatilin基因抑制癌生长的方法，其中水性介质为磷酸盐缓冲液或者葡萄糖水溶液。
6.根据权利要求4所述的通过利用saxatilin基因抑制癌生长的方法，其中真核表达载体为pAAV-CMA或者pFLAG-CMV-1。
7.根据权利要求4所述的通过利用saxatilin基因抑制癌生长的方法，其中脂质体和表达载体的混合比例为2∶1-20∶1(w/w)。
全文摘要
本发明涉及包含来自黑眉蝮蛇的一种新的解离素基因的脂质体复合物，以及通过将复合物转移给生物体治疗和预防肿瘤的方法。
文档编号A61K48/00GK1545424SQ01823583
公开日2004年11月10日 申请日期2001年8月29日 优先权日2001年8月29日
发明者朴容奭, 金秀仁, 洪性洧, 孙英德, 张桹洙, 许镇奎, 金斗植, 朴容 申请人:郑光会