专利名称：红细胞生成素治疗家养和饲养动物贫血症的制作方法
技术领域：
本发明涉及应用于家养和饲养动物的基因治疗方法。本发明特别涉及通过施用编码红细胞生成素的表达载体而治疗动物贫血症的方法，以及含有所述表达载体的药物组合物。
由慢性肾衰竭、施用化疗药物或手术引起的贫血症是导致家养和饲养动物死亡和残废的一个主要原因。除了输血，目前可用于治疗狗、猫或猪贫血症的唯一方法是施用重组人红细胞生成素(EPO)。虽然这种治疗有可能提高动物的生活质量，但是它有两个主要的缺点。第一，这种治疗费用昂贵且不方便(动物一生中通常每周必须注射三次)。第二，接受治疗的动物经常产生针对人类蛋白质的抗体，从而降低其疗效，而且可能会与动物自身的EPO发生交叉反应，从而加剧贫血症(Cowgill等人，美国兽医学会杂志(J.Am.Vet.Med.Assoc.)212521-528(1998))。最近狗型、猫型和猪型EPO的获得(Wen等人，血液(Blood)821507-1516(1993))可能会对克服由于跨种系施用EPO引起的免疫学影响有所帮助。然而，治疗很可能依赖昂贵且要求经常的重复。能避开这些问题的EPO给药方法将是兽医学领域的一项显著进步。
本发明是建立在狗、猫和猪贫血症可以通过施用编码EPO的表达载体而减轻这一发现基础上的。这种载体在体内被细胞摄取，并在持久的一段时间内(3-4个月)产生足够量激素，以显著提高动物体内血球计数水平。通过使用编码在接受治疗的动物中发现的类型的EPO的载体(狗EPO给狗、猫EPO给猫和猪EPO给猪)，可以避免由于给这些动物施用人的EPO引起的免疫学问题。
一方面，本发明涉及通过施用表达载体来治疗狗贫血症的方法，所述表达载体含有主要由编码狗红细胞生成素组成的独特EPO序列元件。术语“主要由…组成”指含有编码狗EPO的正确氨基酸序列的核酸序列，以及编码带有非实质性氨基酸差异的蛋白质的核酸序列，这种非实质性差异可由狗激素基本功能和免疫学特性的保留证明。在这一方面特别重要的是编码的EPO不引起接受治疗的动物体内产生抗EPO抗体。EPO序列元件编码成熟EPO蛋白的氨基酸序列，对于狗EPO而言，有166个残基。在它的N-末端通常地有一段信号序列(优选同源的信号序列)。术语“同源的信号序列”指与编码的EPO通常相关的信号序列，如狗EPO信号序列将优选地用于狗EPO结构序列。狗激素的完整氨基酸序列列于
图1(SEQ ID NO1)。最初的26个氨基酸(图中标有下划线的)是狗信号序列，而剩余的氨基酸是成熟狗EPO的结构序列。
用于治疗动物的表达载体应当优选含有与EPO序列元件可操作地连接的启动子元件。术语“可操作地连接”指两个序列元件(即启动子和EPO结构序列)通过这样一种方式连接，使得转录在启动子的控制下进行，并且EPO蛋白正确合成。应当给接受治疗的动物施用量足以引起其血球计数在统计学上显著增加的表达载体。
已记载有许多不同的药物可用于增强施用的核酸在体内的细胞摄取。虽然这些药物都适合本发明，但是表达载体优选与阳离子脂质混合、作为脂质体的一部分或者以无转染促进药物的形式施用。表达载体通常应当以0.01-10mg/ml的浓度施用，优选的浓度约为0.1mg/ml。优选的送递方法是通过肌内注射，但是也可以使用其它方法，如通过“基因枪”的方法。
本发明的另一方面，通过用猫EPO序列元件或猪序列元件取代表达载体中狗EPO序列元件，以上讨论的治疗贫血症的方法可以应用于猫和猪。这样，可以给猫施用含有主要由编码猫EPO的核苷酸组成、并与启动子元件可操作地连接的独特EPO序列元件的表达载体。对于猪而言，表达载体中的独特EPO序列元件将主要由编码猪EPO的核苷酸组成。类似狗，所编码的EPO的N-末端通常应当有一段信号序列，而且应当给接受治疗的动物施用量足以引起其血球计数在统计学上显著增加的表达载体。服用的表达载体优选与阳离子脂质混合，掺入作为脂质体的一部分，或者以是无任何转染促进药物的形式施用。猫EPO的序列列于图2(SEQ ID NO2)。图中标有下划线的氨基酸是猫信号序列。猪EPO的结构序列列于图3(SEQ IDNO3)。
本发明还包括供肠胃外使用，含有上述狗、猫或猪表达载体的药物组合物。载体应当悬浮或溶解于水溶剂诸如盐溶液中，并且应当以约0.01-10mg/ml的浓度存在。优选的浓度约为0.1mg/ml。
图1图1给出了狗EPO的完整氨基酸序列。标有下划线的氨基酸是狗信号序列，而剩余的氨基酸是成熟的狗EPO的结构序列。
图2图2给出了猫EPO的完整氨基酸序列。标有下划线的氨基酸是猫信号序列，而剩余的氨基酸是成熟的猫EPO的结构序列。
图3图3给出了成熟的猪EPO的完整结构序列。
图4图4显示设计用来确定给狗施用狗EPO编码DNA的效果的研究结果。将狗分成几组，一组为对照，接受编码人可溶性胚胎碱性磷酸酶基因的质粒DNA(图中用黑菱形表示)，另有三个实验组。A组给予6剂于25ml体积中的7.5mg EPO DNA(图中用黑方框表示)；B组给予6剂于25ml体积中的2.5mg EPO DNA(图中用黑三角表示)；C组接受6剂于3ml体积中的2.5mg EPO DNA(图中用X表示)。对研究中的各只狗进行为期32天的血球计数。
图5图5显示肾衰竭模型中给予狗EPO编码DNA的实验结果。16只狗经外科手术摘除一个肾，并使第二个肾减小约50％。间隔24小时给狗放血，诱导贫血症。最后一次放血后，总共12只狗接受编码狗EPO的DNA。其中6只狗接受无转染促进剂的DNA，另6只狗接受与脂质复合的DA。4只对照狗不进行处理。为期50天测定每只狗血球计数的百分比变化，图中显示了对照(黑方框)、用无转染促进剂的DNA处理的动物(圆圈，短划线)和用脂质复合DNA处理的动物(圆圈，点线)的结果。
图6该图显示的也是附图5有关实验的结果。将对照动物和用脂质复合DNA处理的动物的数据用研究中约第12-38天观察到的血球计数变化表示。还显示了与这些数据有关的最佳直线的拟合。黑圆表示由脂质复合DNA处理的动物得到的结果，方框表示对照动物的结果。定义下面的描述使用了许多涉及重组体DNA技术的术语。为了能对说明书和权利要求书有清晰和一致的理解，提供下列定义。
克隆载体在宿主细胞中可以自主复制、特征在于有一个或少量限制性内切酶识别位点的质粒、噬菌体DNA或其它DNA序列。外源DNA片段可在这些位点拼接到载体中，达到片段的复制和克隆。载体可含有适合用来鉴定转化细胞的标记。例如，标记有可能提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性。
表达载体与克隆载体类似、但能诱导克隆DNA在转化宿主后表达的载体。克隆的DNA常常处于调控序列诸如启动子或增强子的控制下(即与之可操作地连接)。启动子序列可以是组成型的、诱导型的或抑制型的。
宿主作为表达载体或克隆载体受体的任何原核或真核细胞即是那种载体的“宿主”。可以作为宿主的细胞的例子在本领域中为人所共知，用于细胞转化的技术同样众所周知(参阅，如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)第二版，冷泉港出版社(1989))。宿主细胞可在体内存在并且经受给动物注射的核酸的转染。
启动子通常发现于基因的5’区域、位于起始密码子附近的DNA序列。转录自启动子起始。如果启动子是可诱导的类型，则转录的速率可以用诱导剂提高。
表达表达指由DNA生成多肽的过程。这个过程涉及由编码多肽的DNA片段转录成mRNA和由此mRNA翻译成最终的多肽产物。
表达载体的制备本发明涉及通过分别施用编码狗、猫和猪EPO的表达载体来治疗狗、猫和猪贫血症的方法。这些类型EPO的全长氨基酸序列列于图1-3。Wen等人(血液，821507-1516(1993))描述了从这些物种中PCR扩增EPO的方法。MacLeod等人(美国兽医学研究杂志(Am.J.Vet.Res.)591144-1148(1998))也描述了分离狗EPO并将之插入到表达载体中的方法。虽然这些方法可用于获取适用于本发明的EPO序列，描述过的分离基因元件的许多其它技术也能使用(参阅如Sambrook等人，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港出版社(1989))。这样，DNA可以化学合成，由筛选cDNA文库获取，或者用相应于已知EPO序列区域的PCR探针由cDNA扩增。优选的方法是化学合成在5’端带有信号序列编码区段的所需EPO核苷酸序列。优选与送递的EPO类型同源的信号序列(例如，狗激素优选使用狗信号序列)。然而，如果需要的话，其它信号序列也可使用，例如，狗信号序列可以用于猪结构序列。编码信号序列的区域的5’端和EPO结构序列的3’端还应当包括限制性序列。这些限制性序列应当选择与将用来表达EPO的载体内的相应位点相配的。对于优选的VR1012载体而言，DNA可以构建成5’末端有一个EcoRV位点和3’末端有一个BglII位点。
表达载体可以使用常规技术构建，并且应当包括与编码EPO的DNA元件可操作连接的启动子。转录增强子和其它调控元件也可以存在。优选地，转录由CMV(巨细胞病毒)启动子起始。其它可以使用的启动子的例子包括小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Haymer等人，分子应用遗传学杂志(J.Mol.Appl.Gen.)1273(1982))；疱疹病毒的TK启动子(McKnight，细胞，31355-365(1982))，和SV40早期启动子(Benoist等人，自然，290304(1981))。
大量适合用于本发明的载体已经被描述(Botstein等人，迈阿密冬季专题讨论会(Miami Winter Symp.)19265(1982)；Broach，细胞，28203(1982)；Bollon等人，临床血液学和肿瘤学杂志(J.Clin.Hematol.Oncol.)1039(1980)；和Maniatis，细胞生物学综合论文(Cell BiologyA Comprehensive Treatise)，第三卷，学术出版社(Academic Press)，纽约，第563-608页(1980))。优选的表达载体，“VR1012”，可以如Hartikka等人描述地那样(人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)71205-1217(1996))构建。
表达载体的化学形式许多不同的药物已经被用来促进体内细胞的DNA摄取。本方法适合与所有这些药物一起使用，但是，表达载体优选以无转染促进剂的形式施用，或者与阳离子脂质混合。制备“裸露”DNA的合适方法描述于U.S.5,703,055中。可以使用的阳离子脂质的例子描述于U.S.5,264,68和5,459,127中，而可以使用的阳离子脂质体的例子可参阅U.S.4,897,355。当使用转染促进剂时，应当以在接受治疗的动物中达到表达载体最大细胞摄取而不引起相反的副作用为目标进行选择。
施用的剂量形式和方式任何适合于体内细胞转染和随后功能性EPO的表达的施用方式都可用于本方法。编码EPO的表达载体可以作为唯一有活性的药物或者与其它核酸或有治疗活性的药物一起施用。虽然肌内注射是优选的，但是还有其它可以使用的方式，包括真皮内，经皮，静脉内，动脉内，腹膜内，皮内和皮下方式。载体还可以通过“基因枪”的方法送递给动物。
表达载体可以混入使用本领域常规方法制造的药剂中(参阅，如雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第16版，A.Oslo编，Easton PA(1980))。通常，制剂应当适合于肠胃外施用，并且将包括水溶剂，诸如无菌等渗盐溶液、乙醇、聚二醇水溶液、林格氏(Ringer)溶液等等。通常，表达载体应当占约0.01-10mg/ml的最终组合物。
治疗方法诊断患有贫血症的动物通常应当通过肌内注射约0.5-30ml体积而施用0.01-20mg的剂量。可以进行一次或多次注射。这样，进行几次注射的动物可以得到100mg或更多的总剂量。一种合适的方案包括对动物的每一后肢进行三次DNA注射，每次注射之间间隔30分钟。通过6次注射(每次施用25ml 2.5mg EPO DNA)达到有效的治疗。
这些剂量只是指导方针，而为个别动物选择的实际剂量将由兽医根据临床状况决定。通过有规律间隔地(如每两周一次)测定接受治疗的动物的血球计数，可以检验给定剂量的有效性。每三个或四个月重复施用可能是必要的，频率可根据个别动物的反应进行调整。其它可能影响剂量的因素包括表达载体的细胞摄取效率和转染后启动子和其它调控元件诱导EPO合成的速率。
本方法适合于本领域已经有所描述的任何体内转染方法。优选的方法是那些描述于WO 90/11092和此处实施例部分中的方法。这些或类似的方法，可以有效地用于治疗狗和猫贫血症，不管病因是什么。这样，不管贫血症是由于慢性肾衰竭、化疗或只是年老引起的，动物都会对治疗方法有所反应。
实施例1编码EPO的DNA的制备根据图1和图2给出的序列(包括编码信号序列的核苷酸)，合成了编码狗型和猫型EPO的DNA序列。合成的DNA 5’末端有一个EcoRV位点，3’末端有一个BglII位点。然后将DNA克隆到质粒VR1012中。该质粒含有一些基因元件，包括在体内和体外都能促进克隆基因在哺乳动物细胞中表达的CMV启动子。含有狗EPO基因的重组VR1012此后被称作“狗EPO DNA”，而含有猫EPO基因的重组VR1012被称作“猫EPO DNA”。从E.coli培养物中提取质粒，并用氯化铯梯度超速离心或者阴离子交换层析纯化。用分光光度法和琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA制备物的质量。
实施例2注射狗EPO DNA后小鼠血球计数的上升这项研究涉及三个组的使用，每一组含有20只小鼠。第一组用狗EPODNA处理；第二组用不含狗EPO基因的质粒DNA；而第三组作为未处理对照。对小鼠每一后肢的股直肌注射三次DNA。每次注射溶于50μl磷酸盐缓冲液(PBS)中的25μg DNA，各注射之间间隔30分钟。在第一次处理前第0天和处理后第9、16、23和36天测定血球计数。用肝素化血球计数管通过后眼窝静脉穿刺收集血液。将血液管离心，并用微型血球计数毛细管读数器测定血球计数。收集的数据如下表1注射了狗EPO DNA的小鼠的统计学配对分析
数据的配对分析显示，用狗EPO DNA处理的小鼠与未注射对照组的小鼠血球计数相比，直到处理后36天仍有显著的上升(P值小于0.05)。接受不含狗EPO基因的质粒DNA的小鼠和未注射的小鼠相比较，显示在第0天有显著不同。由于收集血液时动物还未处理，因此认为这属实验异常。在任何其它时间点上，这两个对照组间没有显著不同。处理两周后，观察到用狗EPO DNA处理的小鼠的血球计数下降，这可能归于小鼠体内诱导了对狗EPO的免疫反应。
实施例3注射了猫EPO DNA的小鼠血球计数的上升分别用猫EPO DNA和溶剂(PBS，“未处理对照”)处理两组小鼠，每组5只。浓度、体积和注射方法如实施例2描述的那样。在处理前第0天和处理后第7、14和21天测定血球计数。统计学分析结果，并列于表2。
表2注射了猫EPO DNA的小鼠的统计学配对分析
表2所示的数据配对分析显示，用猫EPO DNA处理的小鼠相比于未处理对照组在处理后第7、14和21天其血球计数有显著上升。
实施例4注射了狗EPO DNA的狗血球计数的上升为了估计引起狗体内血球计数上升所需狗EPO DNA的量，将动物分成三个实验组。遵循实施例2描述的通常方法，每组进行六次注射。每次注射的体积和量列于表3。
表3在注射了EPO DNA的狗研究中各实验组条件
<p>每组有四只狗，两只用狗EPO DNA处理，另两只对照用含有人可溶性胚胎碱性磷酸酯酶(SEAP)基因的质粒DNA处理。如上文所述测定血球计数。
注射狗EPO DNA导致在所有组中持续超过32天血球计数的上升，而注射SEAP DNA对血球计数没有影响。虽然因样品数相对较少而限制了统计学分析，但是在所有组中血球计数水平的百分比增加被认为是生理学相关的。数据显示，(i)注射狗EPO DNA导致狗血球计数上升，这证实了基因治疗的概念，和(ii)血球计数的上升持续了较长的一段时间，这说明接受处理的狗没有产生针对EPO的免疫应答。
就各只动物而言，在“大体积，小剂量”组(总共注射了15mg 150ml)中的两只狗都表现出血球计数的上升。在“大体积，大剂量”和“小体积，小剂量”两组中，两只动物中一只的反应高于另一只。当用“增强”剂量的狗EPO DNA在“大体积，小剂量”的条件下处理低反应者时，两只狗都表现出血球计数的上升。这说明在“大体积，小剂量”的条件下给狗注射狗EPO DNA，可能会有更一致的血球计数反应。
实施例5评估肾切除和经放血的狗中血球计数的恢复速率在肾衰竭实验模型中，检验了注射狗EPO DNA对从贫血症中恢复的速率的影响。将16只健康的beagle狗麻醉，并且将它们左肾的肾动脉、静脉和输尿管结扎并切断。接着活动并切除左肾。将右肾的肾动脉在第一分叉处结扎并切断，剩下约半个残余的右肾进行正常灌注。让狗在静脉取血前至少恢复一周。为了引起贫血症，将肾切除的狗间隔24小时放血三次。在每次确定时间取血时，取走等于体重百分之二的血液量，并且立即注回两倍体积的林格氏乳酸盐溶液。以上文描述的方式(“大体积，小剂量”条件)，给12只狗施用狗EPO DNA。给6只狗施用裸露狗EPO DNA，另6只狗施用以4mg DNA/3ml Lipofectamine比例与脂质(Lipofectamine，生命技术公司，Gaithersburg，马里兰州)混合的狗EPO DNA。剩下四只狗在肾切除和静脉放血后不做处理。
所有肾切除和静脉放血的狗，在静脉放血后立即记录的数值显示上升的血球计数。对照组四只狗中的三只(即没有用狗EPO DNA处理的狗)显示稳定低于基线数值(在肾切除和静脉放血前为狗记录)的上升的血球计数。相反，用狗EPO DNA处理的狗血球计数上升，并稳定在与那些在肾切除和静脉放血前观察到的数值可比的数值上。这说明在这些狗中血球计数的上升应归于施用的DNA的EPO合成。总之，在用Lipofectamine混合的DNA处理的狗中血球计数上升的速率高于用裸露DNA处理的狗或未处理的狗中的数值。与这些观察结果一致，用与Lipofectamine混合的狗EPODNA处理的狗中，其网状细胞计数高于对照中的，说明红血球的生成上升。这些结果说明，来自施用的DNA的EPO在贫血症狗中引起较高的血球计数和较快的上升。虽然从贫血症恢复的速率在用裸露狗EPO DNA处理的狗和未处理的狗中相当，研究的结果总体上说明EPO基因治疗可以成功地应用于狗。
实施例6注射狗EPO DNA后远交系小鼠(CD1)血球计数的上升在上文实施例2和3中，用50μl体积的DNA注射纯系BalB/C小鼠。在本实施例中，用25μl体积的狗EPO DNA注射远交系小鼠CD1。有些注射使用磷酸钠作为溶剂(150mM pH7.2-7.4)进行，而其它用PBS进行(Dulbecco’s磷酸盐缓冲液，生命技术公司(Life Technologies Inc.)，Gaithersburg，马里兰州)。
表4注射EPO DNA的远交系小鼠的研究中各实验组条件<
>得到的结果说明，基于DNA的EPO基因治疗可以成功地应用于远交系哺乳动物种群。还发现，溶于磷酸钠的DNA相对于溶于PBS的DNA引起较高的血球计数反应，并且每一后肢注射一次25μl体积的DNA足以引起血球计数的显著上升。
实施例7注射了狗EPO DNA后“衰老”小鼠血球计数的上升这项研究涉及“衰老”(退休的种畜)Balb/C小鼠血球计数上升的实例。
表5注射EPO DNA的衰老小鼠的研究中各实验组条件
得到的结果说明，基于DNA的EPO基因治疗可以成功地应用于治疗“衰老”哺乳动物。
实施例8注射了猫EPO DNA后猫血球计数的上升注射6-8月龄的猫，第-25天切下脾，依照下文描述的方案用猫EPO DNA处理。依照上文描述提取质粒DNA，溶于磷酸钠，肌内注射到股直肌中。对于阴性对照，用150mM，pH7.2-7.4的磷酸钠注射猫。每组含有5只猫。
表6注射猫EPO DNA的猫研究中各实验组条件
得到的结果说明，基于质粒DNA的EPO基因治疗可以成功地应用于猫。所有EPO DNA处理引起血球计数的显著上升。就剂量而言，发现1mg DNA(以0.1mg/ml的浓度溶于10ml磷酸钠，分两次等体积注射，每条后肢一次)相比于未处理的猫引起血球计数的显著上升。
序列表<110>PFIZER PRODUCTS INC.<120>红细胞生成素治疗家养和饲养动物贫血症<130>PC10485A<140><141><160>3<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>192<212>PRT<213>家犬<400>1Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile20 25 30Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Arg Glu Ala35 40 45Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Gln Gly Cys Ser Phe Ser Glu Ash50 55 60Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Thr Trp Lys Arg Met65 70 75 80Asp Val Gly Gln Gln Ala Leu Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu85 90 95Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ala Ser Gln100 105 110Pro Ser Glu Thr Pro Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Leu115 120 125Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala130 135 140Met Ser Leu Pro Glu Glu Ala Ser Pro Ala Pro Leu Arg Thr Phe Thr145 150 155 160Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg165 170 175Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg180 185 190<210>2<211>192<212>PRT<213>Felis catus<400>2Met Gly Val Arg Glu Cys Pro Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile20 25 30Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Arg Glu Ala35 40 45Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Cys Ser Phe Ser Glu Asn50 55 60Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Thr Trp Lys Arg Met65 70 75 80Asp Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu85 90 95Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ser Ser Gln100 105 110Pro Ser Glu Thr Pro Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Ser Leu115 120 125Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala130 135 140Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Phe Thr145 150 155 160Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile Tyr Ser Asn Phe Leu Arg165 170 175Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Arg Gly Asp Arg180 185 190<210>3<211>166<212>PRT<213>野猪<400>3Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile1 5 10 15Leu Glu Ala Arg Glu Ala Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly20 25 30Cys Ser Phe Ser Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Thr Trp Lys Arg Met Asp Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Ile Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Ala Asn Ser Ser Gln Pro Ser Glu Thr Pro Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Ser Leu Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Thr Ser Leu Pro Glu Ala Thr Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Phe Thr Val Asp Thr Leu Cys Lys Leu Phe Arg Ile130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Thr Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Arg Gly Asp Arg16
权利要求
1.治疗狗贫血症的方法，包括给所述狗施用表达载体，其中a)该表达载体包括主要由编码狗红细胞生成素的核苷酸组成的独特EPO序列元件；b)该表达载体还包括与所述EPO序列元件可操作连接的启动子元件；和c)该表达载体以足够引起狗血球计数在统计学上显著增加的剂量施用。
2.权利要求1的方法，其中所述表达载体以无转染促进剂的形式施用。
3.权利要求1的方法，其中所述表达载体与阳离子脂质复合。
4.权利要求1的方法，其中所述表达载体作为脂质体的一部分施用。
5.权利要求1的方法，其中所述表达载体以大约0.01-10mg/ml的浓度施用。
6.权利要求1的方法，其中所述表达载体以大约0.1mg/ml的浓度施用。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述载体以肌内注射的方法施用。
8.供肠胃外使用的药物组合物，包括(a)表达载体，其中i)该表达载体包括主要由编码狗红细胞生成素的核苷酸组成的独特EPO序列元件；和ii)该表达载体还包括与所述EPO序列元件可操作连接的启动子元件；和(b)溶解或悬浮该表达载体的水性溶剂。
9.权利要求8的药物组合物，其中所述表达载体以大约0.01-10mg/ml的浓度存在。
10.权利要求8的药物组合物，其中所述表达载体以大约0.1mg/ml的浓度存在。
11.治疗猫贫血症的方法，包括给所述猫施用表达载体，其中a)该表达载体包括主要由编码猫红细胞生成素的核苷酸组成的独特EPO序列元件；b)该表达载体还包括与所述EPO序列元件可操作连接的启动子元件；和c)该表达载体以足够引起猫血球计数在统计学上显著增加的剂量施用。
12.权利要求11的方法，其中所述表达载体以无转染促进剂的形式施用。
13.权利要求11的方法，其中所述表达载体与阳离子脂质复合。
14.权利要求11的方法，其中所述表达载体作为脂质体的一部分施用。
15.权利要求11的方法，其中所述表达载体以大约0.01-10mg/ml的浓度施用。
16.权利要求11的方法，其中所述表达载体以大约0.1mg/ml的浓度施用。
17.权利要求11-16中任一项的方法，其中所述载体以肌内注射的方法施用。
18.供肠胃外使用的药物组合物，包括(a)表达载体，其中i)该表达载体包括主要由编码猫红细胞生成素的核苷酸组成的独特EPO序列元件；和ii)该表达载体还包括与所述EPO序列元件可操作连接的启动子元件；和(b)溶解或悬浮该表达载体的水性溶剂。
19.权利要求18的药物组合物，其中所述表达载体以大约0.01-10mg/ml的浓度存在。
20.权利要求18的药物组合物，其中所述表达载体以大约0.1mg/ml的浓度存在。
21.治疗猪贫血症的方法，包括给所述猪施用表达载体，其中a)该表达载体包括主要由编码猪红细胞生成素的核苷酸组成的独特EPO序列元件；b)该表达载体还包括与所述EPO序列元件可操作连接的启动子元件；和c)该表达载体以足够引起猪血球计数在统计学上显著增加的剂量施用。
22.权利要求21的方法，其中所述表达载体以无转染促进剂的形式施用。
23.权利要求21的方法，其中所述表达载体与阳离子脂质复合。
24.权利要求21的方法，其中所述表达载体作为脂质体的一部分施用。
25.权利要求21的方法，其中所述表达载体以大约0.01-10mg/ml的浓度施用。
26.权利要求21的方法，其中所述表达载体以大约0.1mg/ml的浓度施用。
27.权利要求21-26中任一项的方法，其中所述载体以肌内注射的方法施用。
28.供肠胃外使用的药物组合物，包括(a)表达载体，其中i)该表达载体包括主要由编码猪红细胞生成素的核苷酸组成的独特EPO序列元件；和ii)该表达载体还包括与所述EPO序列元件可操作连接的启动子元件；和(b)溶解或悬浮该表达载体的水性溶剂。
29.权利要求28的药物组合物，其中所述表达载体以大约0.01-10mg/ml的浓度存在。
30.权利要求28的药物组合物，其中所述表达载体以大约0.1mg/ml的浓度存在。
全文摘要
本发明涉及通过施用编码狗、猫和猪红细胞生成素的表达载体来治疗家养和饲养动物(特别是狗、猫和猪)贫血症的方法。此外,本发明还包括含有表达载体的药物组合物。
文档编号C07K14/435GK1265921SQ9912675
公开日2000年9月13日 申请日期1999年12月16日 优先权日1998年12月17日
发明者B·R·克里斯南, M·G·谢帕德 申请人:辉瑞产品公司