专利名称：从镰形棘豆中同步制备乔松素和2’,4’-二羟基查尔酮的工艺方法
技术领域：
本发明涉及中药技术领域，具体涉及一种从镰形棘豆中提取黄酮类活性物质的方法。
背景技术：
镰形棘豆(Oxytropis falcata Bunge)系豆科棘豆属的多年生无莖草本植物,藏药称“莪大夏”、“大夏”、“达夏”，广泛分布于西藏、青海、甘肃南部、四川西部及新疆等地。具有抗炎止痛、清热解毒及止血等功效，内服可治流感、扁桃体炎、高烧、喉炎、气管炎、出血、便秘、炭疽等症以及藏医的黄水病，外敷治疗疮疖肿痛、创伤、骨伤疼痛。由于其突出的抗炎疗效，是藏医的“三大抗炎药”，并享有“草药之王”的美誉。在临床上使用广泛，是六味镰形棘豆散、九味青鹏散、十八味欧曲丸、棘豆消氧洗剂、青鹏膏剂、流感丸、奇正藏贴、奇正消痛贴等多种复方或成药的主要药味，是一味非常具有研究和开发价值的天然抗炎药物。黄酮是镰形棘豆的主要活性成分之一，其生物活性主要集中于抗肿瘤、抗炎、抗氧化、镇痛、防治心血管疾病等方面，其中特别突出的是其显著的抗炎活性。通过系统的化学成分研究，目前已从镰形棘豆中发现黄酮类化合物60余种。乔松素(化学名5，7-二羟基二氢黄酮)和2’，4’ - 二羟基查尔酮是镰形棘豆中黄酮类的主要成分，在药材中的含量分别占到0. 12%和0. 27%，同时，这两种化合物也是医药、保健品的重要原料。现有从镰形棘豆中制备黄酮的方法，工业生产上多是针对总黄酮，如采用水提取-盐酸水解工艺制备总黄酮苷元，采用大孔吸附树脂富集镰形棘豆水提取物中的总黄酮，所得产品中黄酮单体的含量低。制备黄酮单体的方法多是实验室方法，步骤繁琐，制备量低，多是毫克级。中国专利申请号NO. 200910264515.1提供了一种制备黄酮单体2’，4’ - 二羟基查尔酮的方法，但该方法需要使用二氯甲烷有毒试剂，柱层析洗脱溶剂系统组成复杂，还需用特殊设备高效液相制备色谱仪进行纯化，且制备量低，难以实现规模化生产。
发明内容
为了克服现在技术的不足，本发明的目的是提供一种简单易行、安全可靠且适合工业化生产的同步制备高纯度乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮的方法，以特色藏药镰形棘豆为原料，通过乙醇加热提取、乙酸乙酯萃取、石油醚沉淀、普通硅胶和反相硅胶柱层析等步骤同时得到高纯度的乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮。所述方法无需应用二氯甲烷等有毒试剂，无需复杂的柱层析洗脱溶剂系统，也不需要高效液相制备色谱仪等设备。为了达到上述目的，本发明的技术方案为一种从镰形棘豆中同步制备乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮的方法，其特征在于，包括以下步骤( 1)取镰形棘豆，粉碎，用乙醇回流提取2 4次，各次提取液过滤，滤液经减压浓缩得总浸膏；(2)总浸膏用水混悬，依次用石油醚萃取2 3次，乙酸乙酯萃取5 7次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物；(3)乙酸乙酯萃取物用硅胶柱色谱分离，先用体积比20:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱，弃去该洗脱液，再用体积比10:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱，通过薄层层析法检测流出液，收集含有乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮的流出液，减压浓缩至干，得浓缩物；(4)浓缩物用少量乙酸乙酯溶解，加入4 7倍石油醚，边加边搅拌，静置，沉淀抽滤，用石油醚洗涤3 5次，干燥，得乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮混合物；(5)混合物用反相硅胶柱色谱分离，甲醇洗脱，通过薄层层析法检测流出液，分别收集含有乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮的流出液，减压浓缩至干，分别获得乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮。进一步地，上述方法中步骤(I)所述的乙醇为浓度为80、5%的乙醇。进一步地，上述方法中步骤(5)所述的反相硅胶为C18反相硅胶，甲醇为70 80%甲醇。使用本发明方法制 备的乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮纯度均大于98% (高效液相色谱法测定)，而且二者的产率和提取率均较高，乔松素的产率和提取率分别为0. 08%和67. 5%，2’，4’ - 二羟基查尔酮的产率和提取率分别可达0. 24%和88. 9%。本发明提出的方法工艺简单，且稳定可行，适合工业大生产。本发明的有益效果在于(I)可同时制备乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮，节省了生产原料，起到了综合利用的作用。(2)制备的产品纯度高，且产率和提取率也较高，适合工业生产应用。(3 )整个制备过程，无需特殊设备，且避免了有毒试剂的使用。
具体实施例方式通过以下具体的实施例可以进一步理解本发明，所提供的实施例仅是对本发明方法的举例说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。以下实施例中使用的试剂和仪器，除特别说明以外，均为普通市售。实施例1从镰形棘豆中同步制备乔松素和2’，4’- 二羟基查尔酮取镰形棘豆6kg，粉碎，用48L90%乙醇回流提取3次，各次提取液过滤，滤液减压浓缩得总浸膏720g。将总浸膏混悬于2000mL水中，依次用IOOOmL石油醚萃取2次，IOOOmL乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物200g。取乙酸乙酯萃取物，用200g200-300目硅胶拌样，挥干溶剂，另取1700g200-300目硅胶，用体积比20:1的石油醚-乙酸乙酯湿法上普通玻璃层析柱，加样，先用18L(4倍柱体积)体积比20:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱，弃去该洗脱液，再用体积比10:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱，通过薄层层析法检测流出液，收集含有乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮的流出液，减压浓缩至干，得浓缩物24g。将浓缩物用IOOmL乙酸乙酯溶解，加入600mL石油醚，边加边搅拌，静置，沉淀抽滤，用石油醚洗涤4次，干燥，得乔松素和2’，4’- 二羟基查尔酮混合物18g。将混合物用IOOmL甲醇溶解，取2500g200-300目的C18反相硅胶，用75%甲醇湿法上普通玻璃层析柱，加样，用75%甲醇洗脱，通过薄层层析法检测流出液，分别收集含有乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮的流分，减压浓缩至干，得乔松素4. 3g和2’，4’ - 二羟基查尔酮12. Sg。
实施例2从镰形棘豆中同步制备乔松素和2’，4’- 二羟基查尔酮取镰形棘豆kg，粉碎，用10L90%乙醇回流提取3次，各次提取液过滤，滤液减压浓缩得总浸骨125g。将总浸骨混悬于500mL水中，依次用500mL石油醚萃取3次，500mL乙酸乙酯萃取7次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物35g。取乙酸乙酯萃取物，用35g200-300目硅胶拌样，挥干溶剂，另取350g200-300目硅胶，用体积比20:1的石油醚-乙酸乙酯湿法上普通玻璃层析柱,加样,先用4. 8L (5倍柱体积)体积比20:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱，弃去该洗脱液，再用体积比10:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱，通过薄层层析法检测流出液，收集含有乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮的流出液，减压浓缩至干，得浓缩物5g。将浓缩物用20mL乙酸乙酯溶解，加入140mL石油醚，边加边搅拌，静置，沉淀抽滤，用石油醚洗涤5次，干燥，得乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮混合物3. Sg。将混合物用15mL甲醇溶解，取570g200-300目的C18反相硅胶，用75%甲醇湿法上普通玻璃层析柱，力口样，用75%甲醇洗脱，通过薄层层析法检测流出液，分别收集含有乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮的流分，减压浓缩至干，得乔松素0. Slg和2’，4’ - 二羟基查尔酮2. 40g。实施例3从镰形棘豆中同步制备乔松素和2’，4’- 二羟基查尔酮取镰形棘豆1kg，粉碎，用6L95%乙醇回流提取4次，各次提取液过滤，滤液减压浓缩得总浸骨123g。将总浸骨混悬于250mL水中，依次用500mL石油醚萃取2次，500mL乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物33g。取乙酸乙酯萃取物，用33g200-300目硅胶拌样，挥干溶剂，另取200g200-300目硅胶，用体积比20:1的石油醚-乙酸乙酯湿法上普通玻璃层析柱,加样,先用3. 3L (6倍柱体积)体积比20:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱，弃去该洗脱液，再用体积比10:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱，通过薄层层析法检测流出液，收集含有乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮的流出液，减压浓缩至干，得浓缩物4. Sg。将浓缩物用15mL乙酸乙酯溶解，加入90mL石油醚，边加边搅拌，静置，沉淀抽滤，用石油醚洗涤3次，干燥，得乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮混合物3. 6g。将混合物用18mL甲醇溶解，取360g200-300目的C18反相硅胶，用70%甲醇湿法上普通玻璃层析柱，加样，用70%甲醇洗脱，通过薄层层析法检测流出液，分别收集含有乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮的流分，减压浓缩 至干，得乔松素0. 78g和2’，4’ - 二羟基查尔酮2. 36g。实施例4本发明制备乔松素和2’，4’- 二羟基查尔酮的方法与现有技术的比较将本发明的方法与中国专利申请为NO. 200910264515.1的方法、文献I (姚淑英，马云保，唐亚，陈纪军，张雪梅.镰形棘豆的化学成分研究.中国中药杂志，2008，33 (12) :1418-1421)以及文献2 (杨欢，王栋，童丽，蔡宝昌.镰形棘豆的化学成分研究(I).中国药学杂志，2008，43 (5) :338-340)中记载的方法进行比较。方法及结果如下按中国专利申请为NO. 200910264515.1的方法取镰形棘豆药材500g，粉碎，用95%乙醇浸泡3周，每日振摇，3周后，取出浸提液，过滤，滤液经旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏状，备用。取浸膏置于500mL烧杯中，加入200mL石油醚超声萃取，每20min更换I次石油醚，萃取2h后，弃去石油醚，保留剩余浸膏，将剩余浸膏加200mL 二氯甲烷超声萃取，每20min更换I次二氯甲烷，萃取3h后，合并所有收集的二氯甲烷萃取液，经旋转蒸发仪浓缩，并在60°C烘箱中烘干，得到二氯甲烷提取物10g。取二氯甲烷提取物用甲醇溶解，加入等量的200-300目硅胶，搅拌均匀，挥干甲醇，上硅胶柱，用体积比100:25:0.1的石油醚-乙酸乙酯-甲酸洗脱，收集流份，点薄层板检测，合并含有2’，4’-二羟基查尔酮的流份，备用；然后再用体积比100:13. 5:0. 3的石油醚-乙酸乙酯-甲酸洗脱，薄层检测，合并含有2’，4’-二羟基查尔酮的流份，备用；最后用体积比100:20:0. 25的石油醚-丙酮-甲酸洗脱，薄层检测，合并含有2’，4’ - 二羟基查尔酮的流份，备用；合并以上3种洗脱系统分离得到的含有2’，4’ - 二羟基查尔酮的流份，减压浓缩至浸膏状，得柱层析提取物5g。将柱层析提取物溶于少量的甲醇中，每次抽取ImL溶液注入高效液相制备色谱仪中纯化,弃去杂质峰流份,收集含有2’，4’ - 二羟基查尔酮的流份，置于50-60°C水浴锅上，浓缩至干，得2’，4’ - 二羟基查尔酮0. 5g。按文献I的方法取镰形棘豆3. 2kg，粉碎，用6倍量90%乙醇冷浸提取3次，每次2d，浸出液回收溶剂得浸膏200g。浸膏上200-300目硅胶柱色谱分离，依次用体积比97: 3，95:5,90:10,80:20,70:30,60:40,0:100 的氯仿-甲醇洗脱，得 8 个流份 Fr. 1-8。流份 Fr. 4(39g)上200-300目硅胶柱色谱分离，依次用体积比95:5，9:1，8:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，得5个组分Fr. 4. 1-4. 5。组分Fr. 4. 2上200-300目硅胶柱色谱分离，依次用体积比95:5，9:1,8:2的氯仿-丙酮梯度洗脱，得4个组分Fr. 4. 2. 1-4. 2. 4。组分Fr. 4. 2. 3经200-300目硅胶柱色谱(体积比8:2的石油醚-丙酮洗脱)及S^hadex LH-20凝胶柱色谱(甲醇洗脱)分离，得2’，4’ - 二羟基查尔酮0. 15g。按文献2的方法取镰形棘豆2kg，粉碎，用95%乙醇冷浸提取3次，每次3d，减压抽滤，药渣再用50%乙醇冷浸提取3次，每次3d，减压抽滤，合并提取液，减压浓缩成浸膏后，加适量水搅拌悬浮，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇萃取，得到氯仿萃取物47g，经反复200-300目硅胶柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯为溶剂进行梯度洗脱，得到乔松素
0.Ollg0本发明制备方法按实施例1和实施例2记载的方法。
结果如表I所示，表明按本发明方法制备的产品产率及提取率均优于现有技术。表I本发明方法与专利方法、文献方法的比较
权利要求
1.一种从镰形棘豆中同步制备乔松素和2’，4’-二羟基查尔酮的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)取镰形棘豆，粉碎，用乙醇回流提取2 4次，各次提取液过滤，滤液经减压浓缩得总浸膏； (2)总浸膏用水混悬，依次用石油醚萃取2 3次，乙酸乙酯萃取5 I次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物； (3)乙酸乙酯萃取物用硅胶柱色谱分离，先用体积比20:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱，弃去该洗脱液，再用体积比10:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱，通过薄层层析法检测流出液，收集含有乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮的流出液，减压浓缩至干，得浓缩物； (4)浓缩物用少量乙酸乙酯溶解，加入4 7倍体积的石油醚，边加边搅拌，静置，沉淀抽滤，用石油醚洗涤3 5次，干燥，得乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮混合物； (5)混合物用反相硅胶柱色谱分离，甲醇洗脱，通过薄层层析法检测流出液，分别收集含有乔松素和2 ’，4 ’ - 二羟基查尔酮的流出液，减压浓缩至干，分别获得乔松素和2 ’，4 ’ - 二羟基查尔酮。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)所述乙醇为浓度为80、5%的乙醇。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述反相硅胶为C18反相硅胶，甲醇为70 80%甲醇。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)取镰形棘豆I重量份，用6-10倍体积份的80、5%乙醇回流提取2-4次，各次提取液过滤，滤液减压浓缩得总浸膏； (2)将总浸膏混悬于2-4倍体积份的水中，依次用0.5-2倍水体积量的石油醚萃取2-3次，0. 5-2倍水体积量的乙酸乙酯萃取5-7次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物； (3)取乙酸乙酯萃取物，用等重量的200-300目硅胶拌样，挥干溶剂，另取6-10倍乙酸乙酯重量的200-300目硅胶，用体积比20:1的石油醚-乙酸乙酯湿法上普通玻璃层析柱，加样，先用3-6倍柱体积的体积比20:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱，弃去该洗脱液，再用体积比10:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱，通过薄层层析法检测流出液，收集含有乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮的流出液，减压浓缩至干，得浓缩物； (4)将浓缩物用3-5倍体积的乙酸乙酯溶解，加入4-7倍乙酸乙酯体积量的石油醚，边加边搅拌，静置，沉淀抽滤，用石油醚洗涤3-5次，干燥，得乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮混合物； (5)将混合物用4-6倍体积份的甲醇溶解，另取100-150倍混合物重量的200-300目C18反相硅胶，用70 80%甲醇湿法上普通玻璃层析柱，加样，用70 80%甲醇洗脱，通过薄层层析法检测流出液，分别收集含有乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮的流分，减压浓缩至干，分别获得乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤 (I)取镰形棘豆I重量份，用8倍体积份的90%乙醇回流提取3次，各次提取液过滤，滤液减压浓缩得总浸膏；(2)将总浸膏混悬于4倍体积份的水中，依次用I倍水体积量的石油醚萃取3次，I倍水体积量的乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物； (3)取乙酸乙酯萃取物，用等重量的200-300目硅胶拌样，挥干溶剂，另取8倍乙酸乙酯萃取物重量的200-300目硅胶，用体积比20:1的石油醚-乙酸乙酯湿法上普通玻璃层析柱，加样，先用4倍柱体积的体积比20:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱，弃去该洗脱液，再用体积比10:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱，通过薄层层析法检测流出液，收集含有乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮的流出液，减压浓缩至干，得浓缩物； (4)将浓缩物用3倍体积的乙酸乙酯溶解，加入7倍乙酸乙酯体积量的石油醚，边加边搅拌，静置，沉淀抽滤，用石油醚洗涤4次，干燥，得乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮混合物； (5)将混合物用5倍体积的甲醇溶解，另取130倍混合物重量的200-300目C18反相硅胶，用75%甲醇湿法上普通玻璃层析柱，加样，用75%甲醇洗脱，通过薄层层析法检测流出液，分别收集含有乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮的流分，减压浓缩至干，得乔松素和2’，4’ - 二羟基查尔酮。
全文摘要
本发明提供了一种从镰形棘豆中同步制备乔松素和2’,4’-二羟基查尔酮的方法，以藏药镰形棘豆为原料，通过乙醇加热提取、乙酸乙酯萃取、石油醚沉淀、普通硅胶和反相硅胶柱层析等步骤同时得到高纯度的乔松素和2’,4’-二羟基查尔酮。使用本发明方法制备的乔松素和2’,4’-二羟基查尔酮纯度均大于98%，而且二者的产率和提取率均较高，乔松素的产率和提取率分别为0.08%和67.5%，2’,4’-二羟基查尔酮的产率和提取率分别可达0.24%和88.9%。
文档编号C07C45/78GK103058978SQ201210578658
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月27日 优先权日2012年12月27日
发明者师彦平, 陈娟, 李波 申请人:甘肃奇正藏药有限公司