一种肠出血性大肠杆菌o157:h7 elisa抗体检测试剂盒及其使用方法
【专利摘要】本发明涉及一种肠出血性大肠杆菌O157:H7ELISA抗体检测试剂盒及其使用方法，包括：a）包被板、b）10×浓缩洗涤液、c）稀释液、d）酶标二抗、e）底物A液、底物B液、底物缓冲液、f）阴、阳性对照血清、g）终止液，所述的包被板为包被抗原的96孔板，其包括包被纯化的intimin蛋白和包被液。本发明与现有技术相比具有以下优点：1、能够简便快速的检测血清中大肠杆菌O157：H7特异性抗体；2、特异性好，包被板包被抗原为大肠杆菌O157：H7特异性蛋白intimin，和大肠杆菌其它血清型以及鸡白痢等血清不发生交叉反应；3、灵敏度高。
【专利说明】—种肠出血性大肠杆菌0157:H7 ELISA抗体检测试剂盒及 其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种肠出血性大肠杆菌0157:H7ELISA抗体检测试剂盒及其使用方 法，属于抗体检测领域。
【背景技术】
[0002]肠出血性大肠杆菌(EnterohemorrhagicEscherichia coli, EHEC)等食源性病原 微生物是当今世界上不断增多的食品安全和突发性公共卫生事件的主要诱因。在食源性病 原微生物中，EHEC占有重要地位，主要包括0157:H7、026:HlI和0111,0157:H7是出血性肠 炎的主要致病菌。0157:H7感染具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性以及抗生素治疗 可能会加剧病情等特点。1982年，0157:H7首先在美国发现，此后在世界各地散发或地方流 行，已成为全球性的公共卫生和食品安全问题。
[0003]目前，国内外已报道的检测方法大多对抗原进行检测，而缺乏对抗体检测方法的 研究，因而有必要建立快速、简便、特异的抗体检测方法。
[0004]0157:H7LEE毒力岛上的eae基因编码的94kDa的外膜蛋白即紧密素(intimin)是 EHEC重要的外膜蛋白，其介导细菌与上皮细胞的紧密黏附，是最重要的黏附因子，可产生 A/E病变。0157:H7主要依靠紧密素及其受体黏附于肠上皮细胞，紧密素的特异性抗体可阻 断细菌的黏附而使其丧失致病力，具有较强的免疫原性和免疫保护性，是理想的疫苗备选 抗原。Intimin蛋白为包被抗原的ELISA抗体检测试剂盒对大肠杆菌0157:H7的流行病学 调查以及疫苗效果评估有重要作用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种肠出血性大肠杆菌0157:H7ELISA抗体检测试剂盒，该 试剂盒选择肠出血性大肠杆菌0157:H7LEE毒力岛上的eae基因的表达产物intimin包被 酶标板及其应用方法，其可快速检测血清中大肠杆菌0157:H7特异性抗体，了解鸡体抗体 水平或感染状况，对于该病的流行病学调查有着重要作用。
[0006]本发明为解决上述技术问题而采取的技术方案为:一种肠出血性大肠杆菌 0157:H7ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括:a)包被板、b) 10 X浓缩洗涤液、 c)稀释液、d)酶标二抗、e)底物A液、底物B液、底物缓冲液、f)阴、阳性对照血清、g)终 止液，所述的包被板为包被抗原的96孔板，其包括包被纯化的intimin蛋白和包被液，包被 浓度为0.88 u g/mL,所述的intimin蛋白是肠出血性大肠杆菌0157:H7LEE毒力岛上的eae 基因原核表达产物，eae基因的上游引物为5 ‘-GGGAATTCCATATGATTACTCATGGITGTTAT-3’， 下游引物为 5 ‘-CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG-3’。
[0007]按上述方案，所述的包被液为0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH值为9.6，按如下配方 进行配制:Na2C03l.59g, NaHC032.93g，加 ddH20 定容至 1000ml。
[0008]按上述方案，所述的IOX浓缩洗涤液为含5%Tween_20的10XPBST，pH值为1.4，按如下配方进行配制:10 XPBSlOOOml，Tween-205ml。
[0009]按上述方案，所述的10XPBS浓度为0.lmol/L，pH值为7.4，按如下配方进行配制=Na2HPO4.12H2058g, KH2P044g, NaCl 160g, KC14g，溶于 980ml ddH20 中，调 pH 至 7.4，定容至 1000ml0
[0010]按上述方案，所述的稀释液为含1%MILK的PBST，按如下配方进行配制:取用 CldH2OlO倍稀释的浓缩洗涤液100ml，MILK1.0g，混合。
[0011]按上述方案，所述的酶标二抗为兔抗鸡lgY-HRP。
[0012]按上述方案，所述的底物缓冲液9.5ml,底物A液32ul，底物B液0.5ml,混匀， 其中所述的底物A液配制方法为H2O20.75ml、三蒸水100ml，混合，4°C避光保存；所述的底物B液配制方法为TMB0.lg、无水乙醇50ml，混合，4°C避光保存；所述的底物缓冲液:柠檬酸? H204.91g, Na2HPO4.12H2019.38g，加 ddH20 定容至 1000ml。
[0013]按上述方案，所述的阴性对照血清为采集健康的SPF鸡血，离心取上清，保存备用；所述的阳性对照血清为采集抗0157:H7的SPF鸡血，离心取上清，保存备用。
[0014]按上述方案，所述的终止液为2mol/L H2SO4，按如下配方进行配制:取浓 H2S0455.5ml，缓慢滴加到ddH20中，冷却后定容至500ml。
[0015]肠出血性大肠杆菌0157:H7ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括有以下步骤:
[0016]I)取包被抗原的96孔板，其包括包被纯化的intimin蛋白和包被液，包被浓度为
0.88 V- g/mL,所述的intimin蛋白是肠出血性大肠杆菌0157:H7LEE毒力岛上的eae基因原核表达产物，eae基因的上游引物为5 ‘-GGGAATTCCATATGATTACTCATGGITGTTA`T-3’，下游引物为5 ‘-CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG-3 ’，用稀释液将待检样品1:200倍稀释后加入板孔中，IOOuL/孔，用同样的方法1:200倍稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照血清各设2 孔，IOOuL/孔，另设一空白对照孔，空白对照孔加IOOul待检样品稀释液，轻轻振匀孔中样品，37 °C温育Ih ；
[0017]2)甩净孔中用稀释液稀释的待检样品和阴、阳性对照血清以及待检样品稀释液， 用CldH2OlO倍稀释的浓缩洗涤液洗涤5次，200uL/孔，每次5min，然后甩净10倍稀释的浓缩洗洚液，拍干；
[0018]3)将加了待检样品和阴、阳性对照血清的所有孔以及空白对照孔加入用稀释液 1:5000倍稀释的酶标二抗IOOul，37°C温育Ih ；
[0019]4)洗涤，方法同步骤2);
[0020]5)将加了待检样品和阴、阳性对照血清的所有孔以及空白对照孔加入底物A液、 底物B液、底物缓冲液配成的显色液IOOul，混匀，室温避光显色10分钟。
[0021]6)将加了待检样品和阴、阳性对照血清的所有孔以及空白对照孔加入终止液 50ul，在酶标仪上测定0D45Q。
[0022]本发明与现有技术相比具有以下优点:
[0023]1、能够简便快速的检测血清中大肠杆菌0157:H7特异性抗体，了解鸡体抗体水平或感染状况，对于该病的流行病学调查有着重要作用；
[0024]2、特异性好，包被板包被抗原为大肠杆菌0157:H7特异性蛋白intimin，和大肠杆菌其它血清型以及鸡白痢等血清不发生交叉反应；[0025]3、灵敏度高，血清稀释1:1600倍时仍能检测到0157:H7intimin特异性抗体。 【具体实施方式】
[0026]一种肠出血性大肠杆菌0157:H7ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括:a)包被板、b) IOX浓缩洗涤液、c)稀释液、d)酶标二抗、e)底物A液、底物B液、底物缓冲液、f)阴、阳性对照血清、g)终止液，所述的包被板为包被抗原的96孔板，其包括包被纯化的intimin蛋白和包被液,包被浓度为0.88 u g/mL,所述的intimin蛋白是肠出血性大肠杆菌0157: H7LEE毒力岛上的eae基因原核表达产物，eae基因的上游引物为5 ‘ -GGGAATT CCATATGATTACTCATGGTTGTTAT-3 ’，下游引物为 5 ‘ -CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG-3 ’。
[0027]所述的包被液为0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH值为9.6，按如下配方进行配制: Na2CO3L 59g, NaHC032.93g，加 ddH20 定容至 1000ml。
[0028]所述的IOX浓缩洗涤液为含5%Tween_20的10XPBST，pH值为1.4，按如下配方进行配制:10 XPBSlOOOml，Tween-205ml O
[0029]所述的10XPBS浓度为0.lmol/L, pH值为7.4，按如下配方进行配制: Na2HPO4.12H2058g, KH2P044g, NaCl 160g, KC14g,溶于 980ml ddH20 中，调 pH 至 7.4，定容至 1000ml0
[0030]所述的稀释液为含1%MILK的PBST，按如下配方进行配制:取用ddH2010倍稀释的浓缩洗涤液100ml，MILK1.0g，混合。
[0031]所述的酶标二抗为兔抗鸡lgY-HRP。
[0032]所述的底物缓冲液9.5ml，底物A液32ul，底物B液0.5ml，混匀，其中所述的底物A液配制方法为H2O20.75ml、三蒸水100ml，混合，4°C避光保存；所述的底物B液配制方法为TMB0.lg、无水乙醇50ml，混合，4°C避光保存；所述的底物缓冲液:柠檬酸.H204.91g， Na2HPO4.12H2019.38g，加 ddH20 定容至 1000ml。
[0033]所述的阴性对照血清为采集健康的SPF鸡血，离心取上清，保存备用；所述的阳性对照血清为采集抗0157: H7的SPF鸡血，离心取上清，保存备用。`
[0034]所述的终止液为2mol/L H2SO4,按如下配方进行配制:取浓H2S0455.5ml，缓慢滴加到ddH20中，冷却后定容至500ml。
[0035]肠出血性大肠杆菌0157:H7ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括有以下步骤:
[0036]I)取包被抗原的96孔板，其包括包被纯化的intimin蛋白和包被液，包被浓度为
0.88 V- g/mL,所述的intimin蛋白是肠出血性大肠杆菌0157:H7LEE毒力岛上的eae基因原核表达产物，eae基因的上游引物为5 ‘-GGGAATTCCATATGATTACTCATGGITGTTAT-3’，下游引物为5 ‘-CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG-3 ’，用稀释液将待检样品1:200倍稀释后加入板孔中，IOOuL/孔，用同样的方法1:200倍稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照血清各设2 ?L, IOOuL/孔，另设一空白对照孔，空白对照孔加IOOul待检样品稀释液，轻轻振匀孔中样品，37 °C温育Ih ；
[0037]2)甩净孔中用稀释液稀释的待检样品和阴、阳性对照血清以及待检样品稀释液， 用CldH2OlO倍稀释的浓缩洗涤液洗涤5次，200uL/孔，每次5min，然后甩净10倍稀释的浓缩洗涤液，拍干；[0038]3)将加了待检样品和阴、阳性对照血清的所有孔以及空白对照孔加入用稀释液 1:5000倍稀释的酶标二抗IOOul，37°C温育Ih ；
[0039]4)洗涤，方法同步骤2);
[0040]5)将加了待检样品和阴、阳性对照血清的所有孔以及空白对照孔加入底物A液、 底物B液、底物缓冲液配成的显色液IOOul，混匀，室温避光显色10分钟。
[0041]6)将加了待检样品和阴、阳性对照血清的所有孔以及空白对照孔加入终止液 50ul，在酶标仪上测定0D45Q。
[0042]下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应当理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。
[0043]肠出血性大肠杆菌0157:H7ELISA抗体检测试剂盒组成与配制
[0044]1、试剂组成
[0045]引物由上海生物工程公司合成，兔抗鸡IgY-HRP购自于Thermo公司，MILK购自BD 公司，酶标板购自深圳金灿华公司，Tween-20购自AMRESC0公司，大肠杆菌其它血清型01、
02、011、018、035、045、078、086、088、0147、鸡白痢以及新城疫等标准血清购自中国兽药监察所。
[0046]2、试剂配制
[0047]A) IOX 浓缩洗涤液(PBST PH7.4): 10XPBSlOOOml，Tween_205ml
[0048]B)包被液(0.05mol/L 碳酸盐缓冲液 PH9.6) =Na2CO3L 59g, NaHC032.93g，加 ddH20 定容至1000ml
[0049]C)封闭液(含 5.0%MILK):I XPBSTlOOml, BSA5.0g
[0050]D)显色液(底物液):
[0051]底物A液:H2020.75ml，三蒸水100ml，4°C避光保存。
[0052]底物B液:TMB0.lg，无水乙醇50ml，4°C避光保存。
[0053]底物缓冲液:柠檬酸?H204.91g，Na2HPO4.12H2019.38g，加 ddH20 定容至 1000ml。
[0054]使用方法:底物缓冲液9.5ml，底物A液32ul，底物B液0.5ml，混匀，现配现用。
[0055]E) 10XPBS (0.lmol/L PH7.4) =Na2HPO4.12H2058g, KH2P044g, NaCl 160g, KC14g，溶于 980ml ddH20 中，调 PH 至 7.4，定容至 1000ml。
[0056]F)终止液(2mol/L H2SO4):取浓H2S0455.5ml，缓慢滴加到ddH20中，冷却后定容至 500ml。
[0057]G)稀释液(含 1%MILK 的 PBST):I XPBSTlOOml, MILK1.0g
[0058]H)制备试剂:双蒸水
[0059]肠出血性大肠杆菌0157:H7ELISA抗体检测试剂盒的使用方法
[0060]1、样品的处理:被检样品为血清,用稀释液稀释200倍后编号备检。
[0061]2、被检样品的检测:①将备检样品加入包被抗原的96孔板，IOOuL/孔。用同样的方法1:200倍稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照各设2孔，IOOuL/孔。另设一空白对照孔，空白对照孔加IOOul样品稀释液，轻轻振匀孔中样品，37°C温育lh。②甩净孔中溶液，用 CldH2OlO倍稀释的浓缩洗涤液洗涤5次，200uL/孔，每次5min，然后甩净洗涤液，拍干。③每孔加入用稀释液1:5000倍稀释的酶标二抗(抗鸡lgY-HRP)100ul，37°C温育lh。④洗涤，方法同2。⑤每孔加入显色液lOOul，混匀，室温避光显色10分钟。⑥每孔加入终止液50ul，10分钟内在酶标仪上测定od45(i。
[0062]3、结果判定
[0063]以空白孔调零，在酶标仪上测定各孔OD450，试验成立条件是阳性对照孔平均OD45tl 值应大于或等于0.600,阴性对照孔平均OD45tl值低于0.200。
[0064]样品孔OD45tl值大于0.300判为阳性，小于0.300判为阴性。
[0065]肠出血性大肠杆菌0157:H7ELISA抗体检测试剂盒的初步应用
[0066]1、灵敏性试验:将阳性血清系列稀释(1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、 1:3200)，用肠出血性大肠杆菌0157:H7ELISA抗体检测试剂盒进行检测，检测结果表明血清稀释1:1600倍时仍能检测到0157:H7intimin特异性抗体(试验结果如表1)。
[0067]表1灵敏性试验结果
[0068]
【权利要求】
1.一种肠出血性大肠杆菌0157:H7ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括:a)包被板、b) IOX浓缩洗涤液、c)稀释液、d)酶标二抗、e)底物A液、底物B液、底物缓冲液、f)阴、阳性对照血清、g)终止液，所述的包被板为包被抗原的96孔板，其包括包被纯化的intimin蛋白和包被液,包被浓度为0.88 u g/mL,所述的intimin蛋白是肠出血性大肠杆菌0157:H7LEE毒力岛上的eae基因原核表达产物，eae基因的上游引物为5 ‘-GGGAATTCCA TATGATTACTCATGGTTGTTAT-3 ’，下游引物为 5 ‘ -CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG-3 ’。
2.按权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于所述的包被液为0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH值为9.6，按如下配方进行配制=Na2CO3L 59g， NaHC032.93g，加 ddH20 定容至 1000ml。
3.按权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于所述的IOX浓缩洗涤液为含5%Tween-20的10XPBST，pH值为7.4，按如下配方进行配制: 10XPBSlOOOml，Tween-205mlo
4.按权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于所述的10XPBS浓度为0.lmol/L，pH值为1.4，按如下配方进行配制:Na2HP04.12H2058g, KH2P044g, NaCl 160g, KCl 4g,溶于 980ml ddH20 中，调 pH 至 7.4，定容至 1000ml。
5.按权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于所述的稀释液为含1%MILK的PBST，按如下配方进行配制:取用CldH2OlO倍稀释的浓缩洗涤液 100ml, MILK1.0g，混合。
6.按权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于所述的酶标二抗为兔抗鸡lgY-HRP。
7.按权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于所述的底物缓冲液9.5ml，底物A液32ul，底物B液0.5ml，混匀，其中所述的底物A 液配制方法为H2O20.75ml、三蒸水100ml，混合，4°C避光保存；所述的底物B液配制方法为TMB0.lg、无水乙醇50ml，混合，4°C避光保存；所述的底物缓冲液:柠檬酸.H204.91g， Na2HPO4.12H2019.38g，加 ddH20 定容至 1000ml。
8.按权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于所述的阴性对照血清为采集健康的SPF鸡血，离心取上清，保存备用；所述的阳性对照血清为采集抗0157:H7的SPF鸡血，离心取上清，保存备用。
9.按权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌0157:H7ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的终止液为2mol/L H2SO4，按如下配方进行配制:取浓H2S0455.5ml，缓慢滴加到 ddH20中，冷却后定容至500ml。
10.肠出血性大肠杆菌0157:H7ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括有以下步骤:I)取包被抗原的96孔板，其包括包被纯化的intimin蛋白和包被液，包被浓度为0.88 V- g/mL,所述的intimin蛋白是肠出血性大肠杆菌0157:H7LEE毒力岛上的eae基因原核表达产物，eae基因的上游引物为5 ‘-GGGAATTCCATATGATTACTCATGGITGTTAT-3’，下游引物为5 ‘-CCGTCTCGAGTTCTACACAAACCGCATAG-3’，用稀释液将待检样品1:200倍稀释后加入板孔中，IOOuL/孔，用同样的方法1:200倍稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照血清各设2 孔，IOOuL/孔，另设一空白对照孔，空白对照孔加IOOul待检样品稀释液，轻轻振匀孔中样品，37 °C温育Ih ；2)甩净孔中用稀释液稀释的待检样品和阴、阳性对照血清以及待检样品稀释液，用 CldH2OlO倍稀释的浓缩洗涤液洗涤5次，200uL/孔，每次5min，然后甩净10倍稀释的浓缩洗洚液，拍干；3)将加了待检样品和阴、阳性对照血清的所有孔以及空白对照孔加入用稀释液1:5000 倍稀释的酶标二抗IOOul，37°C温育Ih ；4)洗涤，方法同步骤2)；5)将加了待检样品和阴、阳性对照血清的所有孔以及空白对照孔加入底物A液、底物B 液、底物缓冲液配成的显色液IOOul，混匀，室温避光显色10分钟。6)将加了待检样品和阴、阳性对 照血清的所有孔以及空白对照孔加入终止液50ul，在酶标仪上测定OD45tl。
【文档编号】G01N33/569GK103558377SQ201310545709
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】罗玲, 邵华斌, 罗青平, 温国元, 艾地云, 王红琳, 苟妙 申请人:湖北省农业科学院畜牧兽医研究所