专利名称：肠出血性大肠杆菌stx1基因检测试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种肠出血性大肠杆菌StXl基因检测试剂盒及其使用方法。
背景技术：
2011年5月德国爆发肠出血性大肠杆菌(EHEC)感染疫情，根据世界卫生组织的报道，截止6月5日，德国已报告630例HUS病例，死亡15例；1601例EHEC感染病例，死亡6 例。此外，欧洲奥地利、捷克、瑞典、丹麦、荷兰、波兰、法国、瑞士、挪威、西班牙、卢森堡和英国等12国共报道31例HUS (死亡1例)和EHEC感染病例73例。美国报道2例HUS病例。肠出血性大肠杆菌感染是一种人畜共患病，主要引起腹部绞痛和轻度腹泻，一些病例为血性腹泻(出血性肠炎)。多数病人10天内康复，少数病人特别是幼儿和老年人，可出现严重并发症，如以急性肾功能衰竭、溶血性贫血和血小板减少为特点的溶血尿毒综合症(HUS)。一般5°/Γ Ο%的EHEC感染者可发展为溶血尿毒综合症，病例死亡率为3%至5%。EHEC致病主要依靠分泌毒素来使人体受到损害。EHEC产生的毒素能使vero细胞产生病变，故称vero毒素；又因与志贺菌的毒素在生物学特性、物理特性和抗原性等方面相似，亦称志贺样毒素(81^8￡1-111 ^0^11，31^)或志贺毒素(计力。志贺毒素在肠道中能够杀伤上皮细胞，并引起严重的炎症反应和广泛的组织病理学损伤，从而导致血痢或无血性腹泻。EHEC是大肠杆菌的一个亚型，0157:H7是EHEC的主要血清型，此外还包括026、 0111、0103、0113、0117、0128等四十多个血清型，此次引起德国EHEC感染疫情的主要为 0104 :H4血清型。鉴于EHEC危害的严重性以及覆盖血清型的广泛性，因此准确、快速检测肠出血性大肠杆菌具有十分重要的意义。传统肠出血性大肠杆菌检测方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。以聚合酶链式反应(PCR)技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中存在一些问题，如普通聚合酶链式反应(PCR)技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应(real time PCR)技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中恒温扩增 (Isothermal Amplification)核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导恒温扩增技术(LAMP)具有很多的优越性。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的肠出血性大肠杆菌检测试剂盒。本发明的目的可以通过以下技术措施实现一种肠出血性大肠杆菌Stxl基因检测试剂盒，所述的肠出血性大肠杆菌stxl基因检测试剂盒包括以stxl基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。志贺毒素由原噬菌体所编码，它由A、B 2个亚单位组成，stx-A为RNA- N-糖苷酶 (RNA- N- glucosidase)催化亚单位，是毒素的毒力区。StxB为靶受体结合区，可以激发机体的免疫应答，是开发疫苗可选择的重要靶分子。stx可分成2类即stxl和stx2。本专利检测的是stxl基因(GeneBank的gi为32400301 )，具有很高的特异性。作为本发明肠出血性大肠杆菌StXl基因检测试剂盒的优选实施方式，所述的两对引物为
外引物 F3 (1) :(SEQ ID NO 1)
GTAGATTCGCTGAATGTCATT
外引物 B3 (1) :(SEQ ID NO 2)
TGTTAACAAATCCTGTCACAT
内引物 FIP (1) :(SEQ ID NO 3)
TCAATCATCAGTAAAGACGTACCTCTTTTCGCTCTGCAATAGGTACT
内引物 BIP (1) :(SEQ ID NO 4)
CAGGGGATAATTTGTTTGCAGTTGATTTTCGTTCAACAATAAGCCGTAGA 或
外引物 F3 (2) :(SEQ ID NO 5)
TGCAGGGATCAGTCGTAC
外引物 B3 (2) :(SEQ ID NO 6)
AGATCATCCAGTGTTGTACG
内引物 FIP (2) :(SEQ ID NO 7)
GTCAGTGAGGTTCCACTATGCGTTTTAATCGCCATTCGTTGACTAC
内引物 BIP (2) :(SEQ ID NO 8)
TCTGTGGCAAGAGCGATGTTTTTTCCCTCTGTATTTGCCGAA。作为本发明肠出血性大肠杆菌stxl基因检测试剂盒的优选实施方式，所述的肠出血性大肠杆菌stxl基因检测试剂盒还包括feiDNA聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液。作为本发明肠出血性大肠杆菌stxl基因检测试剂盒的更优选实施方式， 所述的fei DNA聚合酶酶浓度4-10 U/ μ L ；
所述的反应液含1. 6 2mmol/L dNTP、20 25mmol/L Tris-HCl、10 12. 5mmol/L KCl、10 12. 5mmol/L (NH4)2SO4,8 10mmol/L MgS04、0. 1 0· 125 体积％ TritonX-100、 0.8 lmol/L甜菜碱；
所述的样品预处理液含10 20 mmol/L pH 8.0的Tris- HC1、1 2 mmol/L EDTA和 1 1. 2 体积 % Triton X-100 ；
所述的显色液为SYBR Green I或Eva Green ； 所述稳定液为石蜡油；所述的阳性对照为肠出血性大肠杆菌基因组DNA ；
所述的内引物FIP/BIP各为1.2 2. Oymol/L，外引物F3/B3的浓度各为0.2 0.25 μmol/L0作为本发明肠出血性大肠杆菌Stxl基因检测试剂盒的最优选实施方式， 所述的fei DNA聚合酶酶浓度8 U/ μ L ；
所述的反应液含2mmol/L dNTP、25mmol/L Tris-HCl、12. 5mmol/L KC1、12. 5mmol/L (NH4) 2S04UOmmol/L MgS04、0. 125 体积 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜碱；
所述的样品预处理液含20 mmol/L pH 8. 0的Tris- HCl,2 mmol/L EDTA和1. 2体积 % Triton X-100 ；
所述的显色液为STOR Green I ；
所述的内引物FIP/BIP的浓度为1.6ymol/L ；
所述的外引物F3/B3的浓度为0. 2 μ mol/L。作为本发明肠出血性大肠杆菌Stxl基因基因检测试剂盒的优选实施方式，所述的肠出血性大肠杆菌stxl基因检测试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。作为本发明肠出血性大肠杆菌stxl基因检测试剂盒的更优选实施方式，所述的 A、B两个空腔中分别装有工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由稳定液封存，所述工作液为反应液和fei DNA聚合酶的混合而成。本发明还提供一种肠出血性大肠杆菌stxl基因检测试剂盒的使用方法，该方法包括如下步骤
(1)将待测样品离心，去上清，得到沉淀；
(2)将步骤(1)的沉淀加入样品预处理液，混合均勻，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心，上清即为样品模板DNA;
(3)在反应容器中加入BstDNA聚合酶0. 9 1. 8体积份数、反应液38 40体积份数、 稳定液52 54. 5体积份数、样品模板DNA 4. 5、体积份数、内引物FIP/BIP各2体积份数、 外引物F3/B3各4体积份数，恒温反应；
(4)在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混勻，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性；
所述步骤(3)中的内引物FIP/BIP和外引物F3/B3为以stxl基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对弓I物。作为本发明使用肠出血性大肠杆菌stxl基因检测试剂盒的方法的优选实施方式，所述的两对引物为
外引物 F3 (1) :(SEQ ID NO 1)
GTAGATTCGCTGAATGTCATT
外引物 B3 (1) :(SEQ ID NO 2)
TGTTAACAAATCCTGTCACAT
内引物 FIP (1) :(SEQ ID NO 3)
TCAATCATCAGTAAAGACGTACCTCTTTTCGCTCTGCAATAGGTACT
内引物 BIP (1) :(SEQ ID NO 4)CAGGGGATAATTTGTTTGCAGTTGATTTTCGTTCAACAATAAGCCGTAGA 或
外引物 F3 (2) :(SEQ ID NO 5)
TGCAGGGATCAGTCGTAC
外引物 B3 (2) :(SEQ ID NO 6)
AGATCATCCAGTGTTGTACG
内引物 FIP (2) :(SEQ ID NO 7)
GTCAGTGAGGTTCCACTATGCGTTTTAATCGCCATTCGTTGACTAC
内引物 BIP (2) :(SEQ ID NO 8)
TCTGTGGCAAGAGCGATGTTTTTTCCCTCTGTATTTGCCGAA。作为本发明使用肠出血性大肠杆菌Stxl基因检测试剂盒的方法的优选实施方式，步骤(3)中，恒温反应的反应条件为温度63 65°C，反应时间45 90min。本发明所说的基于环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication of DNA,简称LAMP)快速检测肠出血性大肠杆菌的方法，是利用feiDNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成， 结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP 反应过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(63 65°C)条件下 45 90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法， 初步鉴定需2 3天，完成鉴定报告需10 15天；采用本发明的检测试剂盒仅需2小时。 并且，本发明的反应体系中加入了显色液，鉴定结果更为直观清晰。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.本发明的检测试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性；3.本发明的检测试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高； 4.本发明的检测试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；5.本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物—— 焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠；6.由于选择了高保守性的stxl基因作为靶基因设计引物，使得本发明的检测试剂盒检测肠出血性大肠杆菌的准确率更高；7.在本发明检测试剂盒中采用特制的反应管，减少了气溶胶污染的可能性，同时方便操作。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。下列缩略语适用于本发明
LAMP loop-mediated isothermal amplification,环介导恒温扩增
dNTP :deoxyribonucleoside triphosphate,脱氧核苷三憐酸
Bst 酶Bst DNA polymerase (large fragment), Bst DNA 聚合酶(大片段)
EDTA :ethylenediamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸
DNA deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸
Betaine 舌甘菜碱
Triton X-100 聚乙二醇辛基苯基醚 Stxl 1类志贺毒素实施例1试剂盒的制备
(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物
外引物 F3 (1) :(SEQ ID NO 1)
GTAGATTCGCTGAATGTCATT
外引物 B3 (1) :(SEQ ID NO 2)
TGTTAACAAATCCTGTCACAT
内引物 FIP (1) :(SEQ ID NO 3)
TCAATCATCAGTAAAGACGTACCTCTTTTCGCTCTGCAATAGGTACT
内引物 BIP (1) :(SEQ ID NO 4)
CAGGGGATAATTTGTTTGCAGTTGATTTTCGTTCAACAATAAGCCGTAGA。(2)购置DNA聚合酶-.Bst DNA聚合酶置于容器；
(3)配制反应液和引物反应液含有2mmol/LdNTP、25mmol/L Tris-Cl、12. 5mmol/L KCl、12. 5mmol/L (NH4)2SO4UOmmo 1/L MgS04、0. 125 体积 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜碱、内引物FIP/BIP各1. 2ymol/L和外引物F3/B3各0. 2 μ mol/L，置于容器；
(4)配制样品预处理液样品预处理液含有20mmol/L Tris- HCl (pH 8.0),2 mmol/ L EDTA 和 1. 2 体积 % Triton X-100，置于容器；
(5)购置稳定液石蜡油，置于容器；
(6)购置显色液STORGreen I，置于容器；
(7)提取阳性对照提取肠出血性大肠杆菌基因组DNA，置于容器；
(8)将上述7个容器装成试剂盒，封装。制备工艺简述如下
1、将内引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；
2、将上述(2广(4)步骤配制的液体无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；
3、将稳定液分装，抽样质检；
4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；
5、组装试剂盒。实施例2试剂盒的制备(1)按以下序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物
外引物 F3 (2) :(SEQ ID NO 5)
TGCAGGGATCAGTCGTAC
外引物 B3 (2) :(SEQ ID NO 6)
AGATCATCCAGTGTTGTACG
内引物 FIP (2) :(SEQ ID NO 7)
GTCAGTGAGGTTCCACTATGCGTTTTAATCGCCATTCGTTGACTAC
内引物 BIP (2) :(SEQ ID NO 8)
TCTGTGGCAAGAGCGATGTTTTTTCCCTCTGTATTTGCCGAA。(2)购置DNA聚合酶-.Bst DNA聚合酶置于容器；
(3)配制反应液和引物反应液含有1. 6mmol/LdNTP、20mmol/L Tris-Cl、10mmol/L KClUOmmol/L (NH4) 2SO4、8mmol/L MgS04、0. 1 体积％ TritonX_100、0. 8mol/L 甜菜碱、内弓丨物FIP/BIP各2. 0 μ mol/L和外引物F3/B3各0. 25 μ mol/L,置于容器；
(4)配制样品预处理液样品预处理液含有10mmol/L Tris- HCl (pH 8.0),1 mmol/ L EDTA 和 1. 0 体积 % Triton X-100，置于容器；
(5)购置稳定液石蜡油，置于容器；
(6)购置显色液EVAGreen I，置于容器；
(7)提取阳性对照提取肠出血性大肠杆菌基因组DNA，置于容器；
(8)将上述7个容器装成试剂盒，封装。其他同实施例1。实施例3肠出血性大肠杆菌Stxl基因检测试剂盒的应用 1材料与方法
1. 1材料 1. 1. 1菌株
本发明采用菌株有25株，主要来源于广州出入境检验检疫局、临床分离菌株和环境分离菌株。详见表1。 表1菌株名称及来源
权利要求
1.一种肠出血性大肠杆菌stxl基因检测试剂盒，其特征在于，所述的肠出血性大肠杆菌stxl基因检测试剂盒包括以stxl基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。
2.根据权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌stxl基因检测试剂盒，其特征在于，所述的两对引物为外引物F3 (1) GTAGATTCGCTGAATGTCATT 外引物B3 (1) TGTTAACAAATCCTGTCACAT 内引物FIP (1)TCAATCATCAGTAAAGACGTACCTCTTTTCGCTCTGCAATAGGTACT 内引物BIP (1)CAGGGGATAATTTGTTTGCAGTTGATTTTCGTTCAACAATAAGCCGTAGA 或外引物F3 (2) TGCAGGGATCAGTCGTAC 外引物B3 (2) AGATCATCCAGTGTTGTACG 内引物FIP (2)GTCAGTGAGGTTCCACTATGCGTTTTAATCGCCATTCGTTGACTAC 内引物BIP (2)TCTGTGGCAAGAGCGATGTTTTTTCCCTCTGTATTTGCCGAA。
3.根据权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌stxl基因检测试剂盒，其特征在于，所述的肠出血性大肠杆菌stxl基因检测试剂盒还包括fei DNA聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液。
4.根据权利要求3所述的肠出血性大肠杆菌stxl基因检测试剂盒，其特征在于， 所述的fei DNA聚合酶酶浓度4-10 U/ μ L ；所述的反应液含1. 6 2mmol/L dNTP、20 25mmol/L Tris-HCl、10 12. 5mmol/L KCl、10 12. 5mmol/L (NH4)2SO4,8 10mmol/L MgS04、0. 1 0· 125 体积％ TritonX-100、 0.8 lmol/L甜菜碱；所述的样品预处理液含10 20 mmol/L pH 8.0的Tris- HC1、1 2 mmol/L EDTA和 1 1. 2 体积 % Triton X-100 ；所述的显色液为SYBR Green I或Eva Green ； 所述稳定液为石蜡油；所述的阳性对照为肠出血性大肠杆菌基因组DNA ；所述的内引物FIP/BIP各为1.2 2. Oymol/L，外引物F3/B3的浓度各为0.2 0.25 μmol/L0
5.根据权利要求4所述的肠出血性大肠杆菌stxl基因检测试剂盒，其特征在于， 所述的fei DNA聚合酶酶浓度8 U/ μ L ；所述的反应液含2mmol/L dNTP、25mmol/L Tris-HCl、12. 5mmol/L KC1、12. 5mmol/L (NH4) 2S04UOmmol/L MgS04、0. 125 体积 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜碱；所述的样品预处理液含20 mmol/L pH 8. 0的Tris- HCl,2 mmol/L EDTA和1. 2体积 % Triton X-100 ；所述的显色液为STOR Green I ；所述的内引物FIP/BIP的浓度为1.6ymol/L ；所述的外引物F3/B3的浓度为0. 2 μ mol/L。
6.根据权利要求3、4或5所述的肠出血性大肠杆菌stxl基因检测试剂盒，其特征在于，所述的肠出血性大肠杆菌stxl基因检测试剂盒还包括反应管，所述的反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。
7.根据权利要求6所述的肠出血性大肠杆菌stxl基因检测试剂盒，其特征在于，所述的A、B两个空腔中分别装有工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由稳定液封存，所述工作液为反应液和fei DNA聚合酶的混合而成。
8.一种使用如权利要求3所述的肠出血性大肠杆菌stxl基因检测试剂盒的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(1)将待测样品离心，去上清，得到沉淀；(2)将步骤(1)的沉淀加入样品预处理液，混合均勻，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心，上清即为样品模板DNA;(3)在反应容器中加入feiDNA聚合酶0. 9 1. 8体积份数、反应液38 40体积份数、 稳定液52 54. 5体积份数、样品模板DNA 4. 5、体积份数、内引物FIP/BIP各2体积份数、 外引物F3/B3各4体积份数，恒温反应；(4)在上述反应容器和阳性对照中分别加入显色液，混勻，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性；所述步骤(3)中的内引物FIP/BIP和外引物F3/B3为以stxl基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对弓I物。
9.根据权利要求8所述的使用肠出血性大肠杆菌stxl基因检测试剂盒的方法，其特征在于，所述的两对引物为外引物F3 (1) GTAGATTCGCTGAATGTCATT 外引物B3 (1) TGTTAACAAATCCTGTCACAT 内引物FIP (1)TCAATCATCAGTAAAGACGTACCTCTTTTCGCTCTGCAATAGGTACT 内引物BIP (1)CAGGGGATAATTTGTTTGCAGTTGATTTTCGTTCAACAATAAGCCGTAGA 或外引物F3 (2) TGCAGGGATCAGTCGTAC 外引物B3 (2)AGATCATCCAGTGTTGTACG 内引物FIP (2)GTCAGTGAGGTTCCACTATGCGTTTTAATCGCCATTCGTTGACTAC 内引物BIP (2)TCTGTGGCAAGAGCGATGTTTTTTCCCTCTGTATTTGCCGAA。
10.根据权利要求8或9所述的使用肠出血性大肠杆菌stxl基因检测试剂盒的方法， 其特征在于，步骤(3)中，恒温反应的反应条件为温度63 65°C，反应时间45 90min。
全文摘要
本发明提供一种肠出血性大肠杆菌stx1基因检测试剂盒，所述的肠出血性大肠杆菌stx1基因检测试剂盒包括以stx1基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物内引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本发明的肠出血性大肠杆菌stx1基因检测试剂盒检测效果更全面、漏检率低。
文档编号C12Q1/04GK102251044SQ201110211370
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月27日 优先权日2011年7月27日
发明者卢钟山, 曹以诚, 杜正平, 王传现, 田桢干, 章琪, 谭慧媚, 陆晔, 陈洵 申请人:中华人民共和国上海出入境检验检疫局, 广州华峰生物科技有限公司