专利名称：一种广东虫草胞外多糖的生产方法
技术领域：
本发明涉及一种虫草多糖的生产方法，具体来说涉及一种广东虫草胞外多糖的生产方法。
背景技术：
虫草属(Cordyc印s)隶属于子囊菌门(Ascomycota)、肉座菌目(Hypocreales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)，是最值得研究的真菌类群之一。现代科学研究表明，虫草属真菌是一类极具应用价值的药食同源的大型真菌，其中尤以冬虫夏草最为著名，其他种类如蛹虫草(C. militarist. :Fr.)Link.)、蝉花(C. sobolifer (Hill)Berk, et Br.)、古尼虫草 (C. gunnii (BerL)Berk.)等都有类似于冬虫夏草的作用，部分种类的活性成份甚至比冬虫夏草还要高。其中的虫草多糖具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化和提高免疫力等多种功效，是重要的活性成分。广东虫草(Cordycepsguangdongensis T. H. Li, Q.Y.Lin & B. Song)是中国特有虫草新品种，目前已实现了人工培育，包括子实体和菌丝体的培育。研究证明，广东虫草多糖具有明显的抗氧化功效，是可开发利用的理想材料。
发明内容
本发明的目的在于开发出广东虫草胞外多糖的生产方法。我们通过将广东虫草母种在PDA培养基上培养得到斜面菌种，然后将斜面菌种在液体培养基中培养成一级菌种或进一步将一级菌种培养成二级菌种，再在生产培养基中培养，至析出胞外多糖，从而实现了本发明的目的。本发明的广东虫草胞外多糖的生产方法，其特征包括以下步骤(1)将广东虫草(Cordyceps guangdongensis T. H. Li, Q.Y.Lin & B. Song)母种接种在PDA培养基上，20 25°C下暗培养20 30天，菌落直径长至4 5cm时，得到斜面菌种；(2)将步骤(1)得到的斜面菌种按每250mL培养基接入8 12块黄豆大小菌块的比例接种至液体培养基，20 下，摇床转速为120 180r/min，振荡培养7 8天，至菌丝球充满液体培养基，得到一级菌种，所述的液体培养基PH6. O 6. 5，每升培养基由葡萄糖7 10g，蛋白胨3 6g，麦芽浸出物3 6g，酵母浸膏3 5g和余量的水组成；(3)将步骤( 得到的一级菌种按培养基体积5% 15%的接种量接种至生产液体培养基中，20 下，摇床转速为120 180r/min，通气量10 25L/min，振荡培养 2 4天，至菌丝球充满全部培养基，分离菌丝体和培养残液，所述的生产液体培养基PH4 9，每升生产培养基由碳源10 40g、氮源6 14g和余量的水组成，所述的碳源是葡萄糖和 /或麦芽浸出物，氮源是酵母浸膏和/或黄豆；(4)在将步骤C3)得到的培养残液中加入3 5倍体积的酒精，使酒精的终浓度为体积分数70%以上，4 6°C下静置至析出胞外多糖，分离、干燥则可。
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步骤(1)所述的广东虫草(Cordyc印 S guangdongensis T. H. Li, Q.Y.Lin & B. Song)艮口 El 本虫草广东变型(Cordyceps japonica f. guangdongensisT. H. Li, Q.Y.Lin et B. Song)GDIM_C050423 CCTCC No.M206051。该虫草菌株分离自广东虫草标本(GDGM 24020)，已于2006年5月16日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，保藏号为CCTCC No. M206051。该虫草菌株首先公开在中国专利ZL200610035774. 3中。日本虫草广东变型(Cordyceps japonica f. guangdongensis Τ. H. Li, Q.Y.Lin et B. Song)GDIM_ C050423于2008年发表的文献中更名为广东虫草(Cordyceps guangdongensis T. H. Li, Q. Y. Lin &B. Song)(见文献:Lin Q Y, Li T H, Song B. Mycotaxon, 2008，103 :371-376.)。步骤(1)所述的PDA培养基即马铃薯葡萄糖琼脂培养基，是食用菌领域常使用的培养基。步骤( 所述的一级菌种还可以进一步按培养基体积5% 15%的接种量在步骤 (2)所述的液体培养基中以同样的培养条件培养4 7天，至菌丝球充满全部培养基，形成二级液体菌种，步骤C3)所述的一级菌种替换为二级菌种。步骤C3)所述的葡萄糖、麦芽浸出物、酵母浸膏等购自广东省环凯微生物科技有限公司；黄豆购自农贸市场。步骤(4)所述的分离胞外多糖可以采用常规的方法如离心法或过滤法等，胞外多糖干燥是于40 60°C下烘干或进行冻干。将胞外多糖干品进行称重，按照苯酚-硫酸法 (闫文娟，李泰辉，唐芳勇，郑必胜，姜子德.广东虫草多糖的提取及含量测定.华南农业大学学报，2009，3(K4) :53-56.)测定广东虫草多糖产率。本发明的广东虫草胞外多糖产率可达到1. 4 1. 7g/L。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。实施例1 称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水IOOOmL煮沸半个小时，纱布过滤，再加 10 20g葡萄糖和17 20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，视试管大小而定每试管约5 10mL，15磅蒸气121°C灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，得到PDA培养基，冷却贮存备用。将葡萄糖10g，蛋白胨5g，麦芽浸出物3g，酵母浸膏3g加水混合，定容至IOOOmL, 调节PH6.0，得到液体培养基。将葡萄糖10g，黄豆10g，酵母浸膏4g加水混合，定容至IOOOmL,调节pH至9.0，得
到生产液体培养基。将广东虫草母种一块黄豆大小的菌块(约0. 5cm2大小)接种在PDA培养基上， 20°C下暗培养30天，菌落直径长至4 5cm时，得到斜面菌种。将斜面菌种按250mL培养基接入10块黄豆大小的菌块的比例接至液体培养基中， 20°C下，振荡培养，摇床转速为120r/min，培养8天，菌丝球充满液体培养基，菌丝球平均直径约2 3mm，且大小均勻，得到一级菌种。将25mL —级菌种接种至250mL生产液体培养基中，25°C，振荡培养，摇床转速为 120r/min,通气量lOL/min，培养4天，至菌丝球充满全部培养基。离心法分离菌丝体和培养残液，往培养残液加入3倍体积的酒精，使酒精的终浓度为体积分数70%，4°C下静置过夜， 析出胞外多糖。通过离心法收集胞外多糖，40°C下烘干，称重，按照苯酚-硫酸法测得胞外多糖产率为1. 7g/L。实施例2 PDA培养基制备同实施例1。将葡萄糖7g，蛋白胨6g，麦芽浸出物6g，酵母浸膏3g加水混合，定容至IOOOmL,调节pH6. 5，得到液体培养基。将葡萄糖30g，麦芽浸出物10g，酵母浸膏8g加水混合，定容至IOOOmL,调节pH至 4.0，得到生产液体培养基。将广东虫草母种一块黄豆大小的菌块接种在PDA培养基上，25°C下暗培养20天， 菌落直径长至4 5cm时，得到斜面菌种。将斜面菌种按250mL培养基接入12块黄豆大小的菌块的比例接至液体培养基中， 下，振荡培养，摇床转速为180r/min，培养7天，菌丝球充满液体培养基，菌丝球平均直
径约2 3mm，且大小均勻，得到一级菌种。将一级菌种12. 5mL接入250mL液体培养基，25°C下，振荡培养，摇床转速为140r/ min，培养5天，菌丝球充满液体培养基，菌丝球平均直径约2 3mm，且大小均勻，得到二级菌种。将1. 25L 二级液体菌种接种至25L生产液体培养基中，搅拌速度为180r/min，通气量为25L/min，培养2天，至菌丝球充满全部培养基，过滤法分离菌丝体和培养残液，往培养残液加入3倍体积的酒精，使酒精的终浓度为体积分数70%，4°C下静置过夜，析出胞外多糖，过滤法收集胞外多糖，40°C下烘干，胞外多糖产率为1. 5g/L。实施例3 PDA培养基制备同实施例1。将葡萄糖8g，蛋白胨3g，麦芽浸出物3g，酵母浸膏5g加水混合，定容至IOOOmL,调节pH6. 5，得到液体培养基。将葡萄糖20g，麦芽浸出物15g，酵母浸膏6g加水混合，定容至IOOOmL,调节pH至
4.0，得到生产液体培养基。将广东虫草母种一块黄豆大小的菌块接种在PDA培养基上，25°C下暗培养20天， 菌落直径长至4 5cm时，得到斜面菌种。将斜面菌种按250mL培养基接入10块黄豆大小的菌块的比例接至液体培养基中， 下，振荡培养，摇床转速为180r/min，培养7天，菌丝球充满液体培养基，菌丝球平均直
径约2 3mm，且大小均勻，得到一级菌种。将一级菌种45L接入300mL液体培养基，25°C下，振荡培养，摇床转速为140r/min， 培养5天，菌丝球充满液体培养基，菌丝球平均直径约2 3mm，且大小均勻，得到二级菌种。将9L 二级液体菌种接种至60L生产液体培养基中，搅拌速度为180r/min，通气量为25L/min，培养2天，至菌丝球充满全部培养基，过滤法分离菌丝体和培养残液，往培养残液加入5倍体积的酒精，使酒精的终浓度为体积分数83%，4°C下静置过夜，析出胞外多糖， 过滤法收集胞外多糖，40°C下烘干，胞外多糖产率为1. 4g/L。
权利要求
1.一种广东虫草胞外多糖的生产方法，其特征包括以下步骤(1)将广东虫草(Cordycepsguangdongensis T. H. Li，Q. Y. Lin & B. Song)母种接种在 PDA培养基上，20 25°C下暗培养20 30天，菌落直径长至4 5cm时，得到斜面菌种；(2)将步骤⑴得到的斜面菌种按每250mL培养基接入8 12块黄豆大小菌块的比例接种至液体培养基，20 下，摇床转速为120 180r/min，振荡培养7 8天，至菌丝球充满液体培养基，得到一级菌种，所述的液体培养基PH6. 0 6. 5，每升培养基由葡萄糖 7 10g，蛋白胨3 6g，麦芽浸出物3 6g，酵母浸膏3 5g和余量的水组成；(3)将步骤( 得到的一级菌种按培养基体积5% 15%的接种量接种至生产液体培养基中，20 下，摇床转速为120 180r/min，通气量10 25L/min，振荡培养2 4 天，至菌丝球充满全部培养基，分离菌丝体和培养残液，所述的生产液体培养基pH4 9，每升生产培养基由碳源10 40g、氮源6 14g和余量的水组成，所述的碳源是葡萄糖和/或麦芽浸出物，氮源是酵母浸膏和/或黄豆；(4)在将步骤C3)得到的培养残液中加入3 5倍体积的酒精，使酒精的终浓度为体积分数70%以上，4 6°C下静置至析出胞外多糖，分离胞外多糖，干燥。
2.根据权利要求1所述的一种广东虫草胞外多糖的生产方法，其特征是步骤O)中所述的一级菌种进一步按培养基体积5% 15%的接种量在步骤( 所述的液体培养基中以同样的培养条件培养4 7天，至菌丝球充满全部培养基，形成二级液体菌种，步骤(3)所述的一级菌种替换为二级菌种。
全文摘要
本发明涉及一种广东虫草胞外多糖的生产方法，其特征是将广东虫草(Cordyceps guangdongensis T.H.Li，Q.Y.Lin & B.Song)母种在PDA培养基上培养得到斜面菌种，然后将斜面菌种在液体培养基中培养成一级菌种或进一步培养成二级菌种，再将一级菌种或二级菌种在生产培养基中培养，至菌丝球充满全部培养基，分离菌丝体和培养残液，最后在得到的培养残液中加入3～5倍体积的酒精，使酒精的终浓度为体积分数70％以上，4～6℃下静置至析出胞外多糖，分离胞外多糖，干燥即可。本发明的胞外多糖产率可达到1.4～1.7g/L。
文档编号C12R1/645GK102277397SQ20111021093
公开日2011年12月14日 申请日期2011年7月26日 优先权日2011年7月26日
发明者宋斌, 李泰辉, 林群英, 黄浩 申请人:广东省微生物研究所