专利名称：新颖的抗幽门螺杆菌和大肠杆菌157:h7的类干酪乳杆菌类干酪亚种菌株的抗细菌剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及新颖的乳酸菌属微生物、其抗细菌物质以及它们的制备方法。具体而言，本发明涉及新颖的类干酪乳杆菌属菌株〔类干酪乳杆菌类干酪亚种CSK01，Lactobacillus paracasei subsp.paracasei CSK 01)〕，它采用下述步骤制得(1)向胃肠炎患者给予从猪的胃粘液获得的乳酸菌；(2)在这些患者完全病愈后，再从他们的粪便中分离出乳酸菌；(3)进行16S rRNA测序和RAPD聚合酶链式反应鉴别出该细菌菌株。本发明的乳杆菌可粘附在胃和肠粘膜上，并在它们上面增殖，该乳杆菌可突出地抵抗酸性条件和胆汁质条件，并具有优异的抗细菌特性，从而可广泛用于开发新药、功能性食物、促进健康的添加剂等。
背景技术：
通常，乳杆菌亚种对含有大量外源凝集素的消化器官的上皮细胞具有亲和力。因而，从外环境获得的乳杆菌在体内倾向于结合到该区域上，并在其上增殖。并且，日常存在于体内的乳杆菌在这种附属表面上形成集落。
乳杆菌亚种的各个种类最初存在于上皮细胞上，并产生共生现象，与这些上皮细胞互相生存，这一直给宿主动物带来功能性益处。尤其是，各个种类起不同的作用，并因而具有益生菌的特殊功能，例如，A细菌菌株形成集落，B菌株分泌抗细菌物质，C菌株分离高酸性乳酸盐，D菌株有助于消化活性等等。
目前，国际上已对上述乳杆菌亚种菌株进行了大量的研究，在这方面的研究存在许多竞争，从而已在实践上将乳杆菌用于各种领域中。不幸的是，从这些研究中获得的所有的功能性乳杆菌亚种菌株都是从肠、粪便、食物、粗的食物材料等获得。因此，虽然乳杆菌亚种菌株对小肠和大肠具有亲和力，但是当将它们与食物制备并摄取时，它们几乎都被胃酸杀灭。因此，需要解决乳杆菌的应用和功效等问题。
发明的公开
为了克服前述和其它缺点，本发明者己试图获得新的乳杆菌菌株，该株可很好地粘附到胃和肠粘膜上、很好地增殖并可抵抗酸、胆汁和细菌。具体而言，我们给予胃肠炎患者以猪胃粘液的乳杆菌，在该患者恢复后，从其粪便中分离出类干酪乳杆菌属菌株，然后检测该菌株的形态学、生理学和培养特性。结果证实了本发明的细菌菌株是新的类干酪乳杆菌类干酪亚种菌株。
本发明的目的是提供一种具有抗细菌特性的新的类干酪乳杆菌菌株。具体而言，本发明提供类干酪乳杆菌类干酪亚种CSK 01株(登记号码KCTC 0907 BP)，这种菌株是抗幽门螺杆菌(Helicobacter pyroli)和大肠杆菌(Escherichia coli)O157H7的抗细菌剂。
本发明的另一目的是，提供抵抗酸和胆汁、并可粘附到胃粘膜和肠粘膜上并于其上增殖的类干酪乳杆菌类干酪亚种CSK 01株。
本发明的另一目的是提供一种制备类干酪乳杆菌类干酪亚种菌株的方法，该方法包括(1)向胃肠炎患者给予从猪的胃粘液获得的乳酸菌；(2)在这些患者完全病愈后，再从他们的粪便中分离出乳酸菌；(3)进行16S rRNA测序和RAPD聚合酶链式反应鉴别出该细菌菌株。
本发明的另一目的是提供一种抗细菌物质，该物质从类干酪乳杆菌类干酪亚种菌株中分离得到，它可杀灭幽门螺杆菌和大肠杆菌O157H7或抑制它们的增殖。
本发明的另一目的是提供含有作为有效成分的乳杆菌属菌株的食物组合物，该菌株具有预防和治疗由幽门螺杆菌引起的胃炎、胃溃疡和十二指肠炎以及由大肠杆菌和其它肠道致病性细菌引起的肠炎、结肠炎和直肠炎的功能。
本发明的另一目的是提供含有作为有效成分的乳杆菌属菌株的药学组合物，该菌株具有预防和治疗由幽门螺杆菌引起的胃炎、胃溃疡和十二指肠炎以及由大肠杆菌以及其它肠道致病性细菌引起的肠炎、结肠炎和直肠炎的功能。
本发明的其它目的和优点将在下文公开。
附图的简短描述
从下面结合附图进行的详细描述中，将可更清楚地理解本发明的上述和其它目的、特征和其它优点，其中
图1a和1b描述本发明经革兰氏染色的乳杆菌(类干酪乳杆菌类干酪亚种CSK01株)；
图2描述本发明上述乳杆菌中使用API KIT 50 CHL进行的糖酵解的分析；
图3描述使用具有微生物识别系统(Microbial ID.Inc.，Newark，Delaware，USA)的自动气相色谱仪进行分析得到的所述乳杆菌的脂肪酸组成；
图4描述使用自动气相色谱仪分析得到的所述乳杆菌的脂肪酸组成；
图5a、5b、5c和5d描述使用所述乳杆菌的Biolog GP小平板(Biolog商品目录号#1004)以代谢指纹形式进行的95种碳源的分析结果；
图6描述本发明乳杆菌中的16S DNA的核苷酸序列；
图7描述使用所述乳杆菌的16S rRNA测序检测的BLAST结果；
图8描述使用类干酪乳杆菌属的特殊引物对所述乳杆菌进行PCR的结果，所得结果与使用标准的乳杆菌亚种的特殊引物进行的PCR结果进行比较；
图9描述所述乳杆菌和类干酪乳杆菌类干酪亚种JCM 8130的核苷酸序列分析；
图10描述使用RP引物对所述乳杆菌和所述标准的乳杆菌亚种进行的RAPDPCR结果；
图11描述使用CRA25引物对所述乳杆菌和所述标准的乳杆菌亚种进行的RAPD PCR的结果；
图12a和12b描述可粘附到胃粘膜上并于其上增殖的所述乳杆菌的特性；
图13a和13b描述可粘附到小肠粘膜上并于其上增殖的所述乳杆菌的特性；
图14描述幽门螺杆菌对Balb/c小鼠的胃粘膜的感染；
图15描述所述乳杆菌杀灭受感染的Balb/c小鼠中的幽门螺杆菌的效果；
图16描述从所述乳杆菌纯化得到的抗细菌物质杀灭幽门螺杆菌的效果；
图17描述大肠杆菌O157H7对Balb/c小鼠小肠的感染；
图18描述所述乳杆菌杀灭受感染的Balb/c小鼠中的大肠杆菌O157H7的效果；
图19描述对所述乳杆菌和大肠杆菌O157H7的混合培养物中的大肠杆菌的杀灭效果；
图20描述从所述乳杆菌得到的抗细菌物质对大肠杆菌O157H7的杀灭效果。
实施本发明的最佳方式
本发明提供具有优异的抗细菌特性的类干酪乳杆菌类干酪亚种菌株。较佳的是，本发明的类干酪乳杆菌类干酪亚种菌株抗幽门螺杆菌和大肠杆菌O157H7。
为了获得所述乳杆菌，本发明提供了一种制备这种乳杆菌的方法，它包括(1)向胃肠炎患者给予从猪的胃粘液获得的乳杆菌；(2)在这些患者完全病愈后，再从他们的粪便中分离出乳杆菌。然后，通过进行以下操作检测本发明的乳杆菌(1)使用API KIT 50 CHL进行糖酵解分析；(2)细胞脂肪酸组成的分析；(3)使用代谢指纹法进行的碳源使用分析等等。结果，已鉴别出所述乳杆菌就是类干酪乳杆菌类干酪亚种或鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)。
此外，通过进行16S rRNA序列分析，将本发明的乳杆菌菌株与标准的菌株进行比较，以便确切证实所述细菌菌株。并且，进行RAPD聚合酶链式反应(PCR)，以对所得结果与常规菌株进行比较。
具体而言，通过使用16S rRNA测序和核苷酸序列的BLAST分析，所述菌株以99.9％以上的精确度被证实属于类干酪乳杆菌类干酪亚种。此外，当使用对类干酪乳杆菌属特异的引物进行PCR时，在本发明的菌株和标准的类干酪乳杆菌类干酪亚种中都发现了大约300bp的类似片段，这证明了本发明该CSK 01株属于类干酪乳杆菌类干酪亚种。
另一方面，当如下比较16S rDNA测序的结果时，本发明的CSK 01株显示出与类干酪乳杆菌类干酪JCM 8130株存在一些不同
第861个碱基在CSK 01株中为G；在JCM 8130株中为T；
第1451个碱基在CSK 01株中为A；在JCM 8130株中为G；
此外，当使用对类干酪乳杆菌亚种特异的RP引物进行聚合酶链式反应时，大约850bp的片段在试验株和标准菌株中是共有的，而其它条带则互不相同。然后，当使用对类干酪乳杆菌亚种特异的CRA25引物进行PCR时，在该CSK 01株中发现约980bp和550bp的片段，而该标准的菌株则出现不一致的条带模式。因此，可澄清该CSK 01株具有它自己的特异特征。
为了证实所述细菌菌株的安全性，分别将0.3ml和0.6ml所述菌株的肉汤培养物(5×109cfu/ml)通过口腔注射到试验小鼠(Balb/c)中，每天1次，共10天，用2个月的时间检测其安全性。结果是，从肉眼看，试验组的健康得到维持，并且所有的器官维持正常的外观。准确的是，包括胃粘膜和小肠粘膜在内的消化器官与标准组的消化器官类似。
此外，本发明提供可抵抗酸性条件的类干酪乳杆菌类干酪亚种。
具体的是，在通过加入HCl将10％脱脂乳的pH调节到1.0-4.0的范围后，将本发明的细菌菌株接种，并分别培养2天和4天。结果证实了本发明菌株可抵抗酸性条件，因为即使在pH 1.5的条件下它们也能增殖。作为参考，CSK 01株在pH 1.5时细胞数少于101cfu/ml，在pH2.0时为104-5cfu/ml。
此外，本发明提供可突出地抵抗胆汁的类干酪乳杆菌类干酪亚种菌株。
具体是，在将猪胆汁加到10％脱脂乳中，获得浓度为4.0-4.5％的胆汁液，接种本发明的细菌接种，并分别培养2天和4天。结果证实了所述菌株可抵抗胆汁酸性条件，因为即使在4.5％的浓度中它们也可增殖。作为参比，CSK 01株在4.0-4.5％的范围内的细胞数少于102-3cfuml。
此外，本发明提供可粘附到胃粘膜并于其上增殖的类干酪乳杆菌类干酪亚种菌株。
具体是，给试验小鼠每天口服0.3ml所述肉汤培养物，共10天，2个月后切下1g胃粘膜，以便分离得到7×108cfu/g的细胞。使用电子显微镜进行观察，结果证实，所述菌株粘附到胃粘膜上，并于其上增殖，其数量无法计数。
此外，本发明提供可粘附到小肠粘膜并于其上增殖的类干酪乳杆菌类干酪亚种菌株。
具体是，给试验小鼠每天口服0.3ml(7×109cfu/ml)所述肉汤培养物，共10天，2个月后切下1g胃粘膜，以便分离得到7×106cfu/g的细胞。使用电子显微镜进行观察，结果证实，所述菌株粘附到小肠粘膜上，并于其上增殖，其数量无法计数。
此外，本发明提供可杀灭幽门螺杆菌的类干酪乳杆菌类干酪亚种菌株。
具体是，给试验小鼠每天口腔注射0.3ml的幽门螺杆菌肉汤培养物，共5天；在注射3天后，每天再通过口腔注射0.3ml的CSK 01株的肉汤培养物，共10天。结果证实，在胃粘膜中没有分离到幽门螺杆菌，仅得到该CSK 01株。因而，电子显微镜观察的结果证实，该CSK 01株以数不清的量散布在胃粘膜上。
此外，本发明提供能杀灭和防止大肠杆菌增殖的类干酪乳杆菌类干酪亚种菌株。
具体是，给试验小鼠每天经口腔灌喂0.3ml的大肠杆菌肉汤培养物，共5天；在灌喂3天后，每天再通过口腔灌喂0.3ml的CSK 01株的肉汤培养物，共10天。结果是，在2个月后，从小肠中未分离出大肠杆菌，仅仅回收得到该CSK 01株。因此，电子显微镜观察的结果证实了所述菌株以数不清的量散布在小肠粘膜上。
当时，每天以7×109cfu/ml的浓度给予幽门螺杆菌，以3×109cfu/ml的浓度给予大肠杆菌，共5天；3天后，幽门螺杆菌以7×107cfu/ml感染到小鼠的胃粘膜上，大肠杆菌O157H7以7×104cfu/ml感染到小肠粘膜上。然后，每天再给感染的小鼠灌喂5×109cfu/ml的CSK 01株肉汤培养物，共10天；2个月后，胃粘膜上仅分离得到7×109cfu/ml的CSK 01株，在小肠粘膜上分离得到4×106cfu/ml的CSK 01株，未发现幽门螺杆菌和大肠杆菌。
此外，将CSK 01株和大肠杆菌的2份肉汤培养物中的细胞数量调到相同，然后将它们接种到10％脱脂乳中，培养5天。检测细胞增殖模式的结果表明，大肠杆菌在70小时内完全被杀灭，而CSK 01株并未受到大肠杆菌的存在的影响，因此它们继续增殖。
因此，上述获得的菌株称为类干酪乳杆菌类干酪亚种CSK 01，该菌株已在2000年12月8日被保藏到国际保藏组织——韩国生物科学和生物技术研究院(KRIBB)的韩国典型培养物保藏中心(KCTC，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Teaion305-333，大韩民国)中，并获得KCTC登记号KCTC 0907 BP。
本发明提供一种抗细菌物质，这种物质从类干酪乳杆菌类干酪亚种菌株中分离得到，它可杀灭幽门螺杆菌和大肠杆菌O157H7或抑制它们的增殖。
具体是，将幽门螺杆菌的肉汤培养物涂布在平板的表面上，将吸附了CSK 01株的抗细菌物质的小片放在该平板的中心。然后在厌氧条件下培养幽门螺杆菌，并检查它们在该圆片的周围区域被杀灭的情况。此外，使CSK 01株与大肠杆菌一起培养，以研究它对大肠杆菌的杀灭效果，在40小时后，大肠杆菌的明显死亡。
本发明提供含有作为有效成分的乳杆菌菌株或所述抗细菌物质的食物组合物，该菌株或物质起到预防和治疗由幽门螺杆菌引起的胃炎、胃溃疡和十二指肠炎以及由大肠杆菌和其它肠道致病性细菌引起的肠炎、结肠炎和直肠炎等功能。
本发明提供含有作为活性成分的乳杆菌菌株或所述抗细菌物质的药学组合物，该菌株或物质起到预防和治疗由幽门螺杆菌引起的胃炎、胃溃疡和十二指肠炎以及由大肠杆菌和其它肠道致病性细菌引起的肠炎、结肠炎和直肠炎等功能。
此外，本发明的细菌菌株和抗细菌物质可用作功能性食物的有效成分，如由乳酸菌发酵的牛奶获得的各种液体产品、由活的乳酸菌和失活的乳酸菌获得的各种粉末状产品、加入活的乳酸菌和失活的乳酸菌的各种冷冻产品、经乳酸菌发酵的各种奶酪产品、加了活的乳酸菌和失活的乳酸菌的各种饮料、加了乳酸菌的抽提物的各种饮料和冷冻产品等等。
此外，本发明的乳杆菌亚种菌株和抗细菌物质可用作可施用于皮肤以治疗大肠杆菌相关的皮炎的油膏的有效成分。具体是，含有活的乳酸菌和/或失活的乳酸菌的各种各样的可溶制剂、粉剂、膏等以及含有所述乳酸菌的抽提物和/或纯化的抗细菌物质的各种各样的可溶的制剂、粉剂、膏等。
此外，本发明提供含有作为有效成分的所述乳杆菌菌株或抗细菌物质的药物，该菌株或物质可用于预防和治疗由幽门螺杆菌引起的胃炎、胃溃疡和十二指肠炎以及由大肠杆菌和其它肠道致病性细菌引起的肠炎、结肠炎和直肠炎。具体是，含有活的乳酸菌和/或失活的乳酸菌的各种各样的可溶制剂、粉剂、胶囊等以及含有所述乳酸菌抽提物和/或纯化的抗细菌物质的各种各样的可溶的制剂、粉剂、胶囊等。
本发明涉及新颖的类干酪乳杆菌类干酪亚种菌株(Lacrobacillus paracaseisubsp.paracasei CSK 01)，该菌株由以下步骤制得(1)从猪胃粘膜中分离出乳酸菌；(2)将此菌株给予胃肠炎患者；(3)从恢复的患者的粪便中分离出该菌株。通过进行实施例中所述的鉴别菌株、使用动物的胃和小肠粘膜进行体内和体外试验，结果证实，本发明的乳杆菌菌株粘附到胃和肠的粘膜上，并于其上增殖，并且该菌株突出地抵抗酸性和胆汁质条件，具有优异的抗幽门螺杆菌和大肠杆菌O157H7等特性
实施例
下述实施例阐述了本发明的实践和目前优选的实施方式。
但是，应理解，本领域熟练的技术人员在考虑到本公开内容之后，可在本发明的精神和范围内作出改动和改进。实施例1从猪胃中分离出乳酸菌
10年以来(1988-1998)，从位于釜山、晋州、水原、全州等地的屠宰场屠宰的猪(3270头)获得胃，然后将其保存在4℃，直到将其用作试验样品。
然后，将1g猪胃粘膜浸入MRS肉汤培养物中，在37℃培养24小时。将该培养基涂布在MRS琼脂平板上，然后在37℃放置3天。培养后，收集在琼脂培养基上出现的集落，用其检测细菌特征，如下文所述的革兰氏染色模式、糖酵解能力等。结果，鉴别出上述细菌是乳杆菌亚种菌株。实施例2纯化从接受了上述乳杆菌亚种的患者的粪便中获得的乳酸菌
为了研究从实施例1分离得到的乳酸菌在人体内的相容性和抗细菌特性，向5位慢性胃肠炎患者给予上述乳酸菌。准确地说，分别在早晨起床后和晚上睡觉前30分钟，在空胃的状态下服用100ml上述乳酸菌，持续2个月。结果，在注射1个月前后以及注射2个月后，进展得到改善，试验中所有的患者都得到恢复。
此时，采用实施例1所述的方法，再从5位给了药的患者的粪便中分离出乳酸菌，获得3-5×107cfu/ml的细胞。然后研究这些细菌的特征，通过与实施例1分离得到的细菌比较，对其进行鉴定，结果证实其特征与实施例1分离得到的给予乳酸菌的特征相同。因此，将该乳酸菌简明地称为CSK 01。
以加了10％脱脂乳的肉汤培养物状态将上述乳酸菌CSK 01冻干，保存在-20℃，然后用于各种检测细菌特征的试验中。实施例3乳酸菌CSK 01的革兰氏染色
采用革兰氏染色法检测CSK 01的特征。结果如图1a和1b所示，呈革兰氏阳性，为无孢子棒状，大小为1.0-1.5μm，这是乳酸杆菌属乳杆菌亚种的典型特征。
然后，研究该乳酸菌CSK 01，以阐明其培养特征。结果是，该菌种在MRS琼脂平板上长成直径为2-3mm的灰色菌落，培养温度较佳在37℃而非30℃。实施例4使用API KIT 50 CHL对该CSK 01株进行分析
在37℃，在厌氧条件下将该CSK 01株在MRS琼脂平板上培养48小时，然后用悬浮培养基将所得培养物悬浮，悬浮液的浊度与McFarland 2的相同。然后，将该培养细胞接种到API 50 CHL条纹试管中，在其上层覆盖一层矿物油，以便检测对49种糖的酵解能力。
通过分析标准的鼠李糖乳杆菌菌株和该CSK 01株的成分，比较糖酵解的模式。结果是，在标准的鼠李糖乳杆菌菌株中，β-龙胆二糖和葡糖酸的含量都为85％，而在CSK 01株中这两种物质的含量分别占5％和45％。
然后，还通过分析标准的类干酪乳杆菌类干酪亚种菌株和本发明的CSK 01株中的成分检测糖酵解的模式。结果是，在该类干酪乳杆菌类干酪亚种菌株中，α-甲基-d-葡糖苷占85％、苦杏仁苷占99％、蔗糖占93％、β-龙胆二糖占85％、葡糖酸占85％，由此测定该菌种是阳性的；而在CSK 01株中，这些物质分别占40％、40％、45％、50％和45％，由此测定该菌种是阴性的。
此外，使用API识别软件程序分析了糖酵解能力。结果显示，该CSK 01株的糖酵解模式与鼠李糖乳杆菌属和类干酪乳杆菌类干酪亚种的类似，如图2所示分别为99.2％和97.1％。实施例5细胞脂肪酸组成的分析
在37℃将CSK 01株培养在MRS琼脂平板上48小时，然后将约50mg的肉汤培养物(包括水在内的重量)以13×100mm的大小分配到干燥干净的特氟隆-有衬里的螺帽管中。然后加入1ml试剂1，以在100℃进行30分钟的皂化作用；2ml的试剂2，以在80℃进行10分钟的甲基化作用。再用1.25ml的试剂3来抽提脂肪酸，然后在室温下放置。一旦分离出两层反应混合物，则去除下层，然后加入3ml试剂4，以便和碱一起洗涤该层5分钟。然后，将约2/3的上清液移到隔膜盖住的样品瓶(12×32mm，Alltech Associates，Inc.，IL，USA)中，将其用作试验样品。
试剂
(1) 试剂1(皂化试剂)
将150ml去离子蒸馏水与150ml甲醇混合，然后加入45g NaOH(ACS核准)，使其完全溶解，制成皂化试剂。
(2) 试剂2(甲基化试剂)
将325ml、6.00N的HCl与275ml的甲醇(试剂级)混合，制成甲基化试剂。
(3) 试剂3(抽提溶剂)
将200ml己烷(HPLC级)与200ml甲基叔丁基醚，制成抽提溶剂。
(4) 试剂4(碱洗液)
将10.8g NaOH(ACS批准)溶解在900ml去离子蒸馏水中，制成碱洗液。
为了分析实施例5所示的脂肪酸的组成，使用Hewlett Packard气相色谱仪II系列6890型(Microbial ID，Inc.，Delaware，USA)，使用25ml×0.22mm×0.33m的甲硅熔凝硅石毛细柱作为分离柱。
此外，使用微生物鉴别系统软件(Nicrobial ID.，Inc.，Delaware，USA)来提供FAME数据图表。然后，通过与标准的校准溶液(Microbial ID.，Delaware，USA)比较，鉴别出峰、测量出停留时间和峰的面积比。
同时，在下面的条件下进行气相色谱法载气为氢气；柱头压力为10psi；溢出比为100∶1；溢出体积为50毫升/分钟；隔膜清洗(septum purge)为5毫升/分钟；FID氢，30毫升/分钟；FID氮，30毫升/分钟；FID空气，400毫升/分钟；原始温度，170℃；程控比例，5℃/分钟；最终温度270℃；FID温度，300℃；进样口，250℃，进样体积2μl。
如图3和图4所述，MIS气相色谱法的结果如下主要脂肪酸，C16∶0，汇总在特征(feature)7(C18∶1w7c)，C18∶1w9c，汇总在特征9(C19∶0环状w10c)等。结果是，鉴别出本发明的乳酸菌属于乳杆菌亚种。实施例6；采用代谢指纹法进行BIOLOG分析
使用Biolog乳酸菌琼脂(BLA)培养基(商品目录号#70004)在28-35℃培养CSK01株24小时，然后将培养物悬浮在20ml、0.85％NaCl中，以便将其在590nm的光密度调整在35-42％的范围内。然后将150μl的肉汤培养物分别分配到Biolog GP小平板(Biolog商品目录号#1004)的96个孔中，然后在28-35℃培养24小时。
分别在培育4小时和24小时后使用读数器测量反应，并使用micro release软件3.50版对所得数据进行分析，检测95种碳源的利用模式。
上述BIOLOG系统是自动化系统，通过分析95种碳源的利用模式，可用它来鉴别微生物并对其进行分类。尤其是，已将其开发用来鉴别乳酸菌〔如乳杆菌亚种、乳球菌亚种(Lactococcus sp.)和片球菌亚种(Pediococcus sp.)〕，并对它们进行分类。如上所述，通过使用碳源利用模式对CSK 01株的代谢特征进行表征。结果如图5a、5b、5c和5d所示，鉴定出该CSK 01株属于鼠李糖乳杆菌或类干酪乳杆菌类干酪亚种。实施例7(7-1)总基因组DNA的抽提
采用Hunter法(1985)从试验株和标准菌株中分离出染色体DNA。即，将所保藏的菌株接种到10ml培养基中，在37℃培养2-3天，然后用100ml培养基培养，直到菌株的生长达到指数生长期的晚期。再次用含有10mg溶菌酶的10ml TE缓冲液处理约5g的细菌残屑，在30℃悬浮细胞裂解液2-3小时。
将已裂解细胞的溶液与1ml的20％SDS缓慢混合，然后加入1.5ml的5M NaCl和苯酚，缓慢摇动20分钟。然后以3,500rpm离心10分钟，获得上清液，将该上清液与等体积的氯仿混合，缓慢摇动10分钟，然后将所得溶液转移到100ml无菌烧杯中，然后与等体积的异丙醇混合。
然后，室温下放置该细胞上清液5分钟，用黄色tip头分离出在两层之间形成的染色体DNA。将所得的DNA溶解在少量TE缓冲液中，然后加入20μg/ml RNA酶，在50℃培养1小时。同时混合100μg/ml蛋白酶K、100mM的NaCl和0.4％的SDS，使其在37℃反应1小时。
重复从苯酚处理以及加入TE缓冲液开始的步骤，使用260nm的吸光度测量DNA浓度。(7-2)16S rRNA测序分析
定量分析上述阶段中的试验株的基因组DNA，将其用于聚合酶链式反应(PCR)。
同时，将先前分离得到的列在表1中的乳杆菌亚种的染色体DNA作为PCR的模板，使用浓度为10μg/ml。<表1>用于鉴定CSK 01株的标准乳酸菌
PCR反应混合物的组成如下总体积为100μl，形成于100mM Tris-HCl(pH8.3)中的1×的反应缓冲液，500mM的KCl，2mM的MgCl2，0.2mM的dNTP，200pmol的有义引物F9(SEQ ID NO1)，200pmol的反义引物1542R(SEQ ID NO2)和2.5单位的Taq聚合酶(如表2所示)。
<表2>用于本发明乳酸菌的16S rRNA测序分析的引物
PCR过程的反义条件如下在95℃变性5分钟、再在95℃变性1分钟、在60℃退火1分钟、在72℃延伸2分钟，以此为一轮，重复30轮。最后，在72℃进行10分钟的后延伸处理，然后将所得反应混合物保存在15℃。
进行1％琼脂糖凝胶电泳分离出PCR产物，用溴乙锭进行染色，以进行鉴别。
考虑1500bp大小的PCR产物，并使用Qiaquick凝胶抽提试剂盒(Qiagen)从该琼脂糖凝胶中洗涤出该产物，然后将其克隆到pGEM-T简易载体中，构建LA1500/pGEM-T载体。
然后，通过使用CSK 01株的16S DNA(第9-1542位)并且进行PCR，从而进行16S rRNA测序分析。准确而言，将约1500bp大小的PCR产物克隆到pGEM-T简易载体中，然后测定其核苷酸序列。
为了测定该基因的核苷酸序列，使用WizardTM+Midipreps DNA纯化系统(Promega)分离出载体LA1500/pGEM-T，然后在Bionex Corporation里使用自动序列分析仪(AlFexpressTM，Pharmacia Biotech)测定该LA 1500bp片段。结果是，16SDNA的核苷酸序列显示为序列表中的SEQ ID NO3，并显示在图6中。实施例8使用BLAST分析核苷酸序列数据
测定上述16S rRNA的核苷酸序列，并使用BLAST程序(Altschul等人，1990；http//www.ncbi.nih.Gov/BLAST)将其与从已知的乳杆菌亚种和属于不同种类的其它代表性菌株的序列进行比较，然后判断它们的同源性。
通过利用邻近相加的方法以及计算从BLAST软件获得的距离值，建造系统树。
结果，CSK 01株的该16S rRNA序列阐述在图7中，并且，根据此分子体系分类，可证明本发明的CSK 01株属于干酪乳杆菌属。尤其是，该菌株与类干酪乳杆菌(D79212)显示出最高的同源性值99.9％。实施例9多重RAPD PCR分析
为了研究试验株，使用任意的约10bp大小的引物进行可分析乳杆菌亚种的类型的随机扩增多态DNA聚合酶链式反应(RAPD PCR)。
此外，制备可特异地检测到类干酪乳杆菌的引物，然后用它们比较试验株的基因与8株类干酪乳杆菌菌株的基因。
如上所述，使用浓度为10μg/μl的先前分离得到的乳杆菌亚种的染色体DNA作为模板进行RAPD-PCR。
PCR反应混合物的组成如下总体积是50μl，形成于100mM Tris-HCl(pH8.3)中的1×的反应缓冲液，500mM的KCl，3mM的MgCl2，0.2mM的dNTP，10pmol的RP引物(SEQ ID NO4)，10pmol的CRA25引物(SEQ ID NO5)和1单位Taq聚合酶(如表3所述)。
<表3>用于本发明乳酸菌的RAPD分析的引物
PCR过程如下94℃3分钟、45℃45秒钟和72℃1分钟(1轮)；94℃45秒钟、45℃45秒钟和72℃1分钟，重复此循环30轮；最后94℃45秒钟、45℃45秒钟和72℃5分钟(1轮)。然后在72℃进行8分钟的后延伸处理，之后将反应混合物保藏在4℃。
进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分离出PCR产物，用溴乙锭染色，以用于给条带模式定型。
根据Ward法(1999)，通过参考类干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等的16S rRNA核苷酸序列，制备用于检测特殊序列的类干酪乳杆菌属特异引物。
当使用含有类干酪乳杆菌的独特的核苷酸序列的引物进行PCR时，在试验株和标准类干酪乳杆菌株中都检测到约300bp的条带，从而鉴别出本发明的CSK01株属于类干酪乳杆菌类干酪亚种，结果如图8所述(泳道1、17100bp的DNA梯；泳道2试验株；泳道3-10类干酪乳杆菌；泳道11-16鼠李糖乳杆菌)。
如实施例3-9所述，检测本发明CSK 01株的生化活性、16S rRNA测序、鉴别的PCR分析等，结果证明了该菌株属于类干酪乳杆菌类干酪亚种。实施例10CSK 01株和类干酪乳杆菌类干酪亚种菌株的DNA核苷酸序列的比较
测定CSK 01株和JCM 8130株的DNA核苷酸序列，结果如图9所示。结果是，两条序列中在第861位和第1451位的核苷酸不同，在CSK 01株中分别为G和A，在JCM 8130株中分别为T和G。实施例11对CSK 01株和乳杆菌亚种菌株使用RP引物进行RAPD PCR
当使用RP引物进行RAPD PCR时，在试验株和标准类干酪乳杆菌菌株中都检测到约850bp的条带，这个结果与采用Ward法(1999)获得的结果相对应。由此可证明本发明的CSK 01株属于类干酪乳杆菌类干酪亚种，结果如图10所示(泳道1、17100bp的DNA梯；泳道2试验株；泳道3-10类干酪乳杆菌；泳道11-16鼠李糖乳杆菌)。但是，除了该850bp条带外，其它条带具有与标准菌株不可比拟的模式，这些条带显示出CSK 01株的特异性。实施例12对CSK 01株和乳杆菌亚种菌株使用CRA25引物进行RAPD PCR
当使用CRA25引物进行RAPD PCR时，在标准类干酪乳杆菌菌株中未检测到约980bp和550bp的条带，这个结果与本发明的CSK 01株的不同。上述结果证明了CSK 01株的特异性，如图11所示(泳道1、17100bp的DNA梯；泳道2试验株；泳道3-10类干酪乳杆菌；泳道11-16鼠李糖乳杆菌)。
如实施例10-12所证明，在16S rRNA测序和使用RP引物和CRA25引物进行的PCR中，鉴别出本发明的CSK 01株具有与常规菌株不对应的特殊特征。实施例13CSK 01株对Balb/c小鼠的安全性
为了检测CSK 01的安全性，选择使用Medical Inspection ofNational VeterinaryScience的2周龄无病菌Balb/c小鼠。具体是，将CSK 01株接种到10％脱脂乳(5×109cfu/ml)中，每天以正确的量——0.3ml和0.6ml通过口腔给予上述小鼠，共10天，2个月后检测其安全性。
结果是，灌喂了0.3ml和0.6ml的肉汤培养物的试验组中所有的成员都存活，并且从肉眼看都是正常的。
尸体解剖的结果是，并未发现试验组的实体器官(肝、心脏、肺、肾等)和消化器官(胃、小肠和大肠)与标准组的有差异，所有的器官都可证明是正常的。
将给药组成员的胃、小肠和大肠中的粘液涂布到MRS琼脂平板上，在37℃培养48小时。如表4所示，从给药组中分离出大量的乳酸菌，但在标准组中未检测到。<表4>本发明的乳酸菌的安全性实施例14本发明CSK 01株的抗酸性
为了制备肉汤培养物，将100ml、10％脱脂乳(pH6.2)和10N的HCl混合，并将其pH值分别调整为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0。然后，接种1ml CSK 01株的肉汤培养物(5×109cfu/ml)，培养4天。测量第2天和第4天细菌的数量和pH，将所得结果列在表5中。
在pH1.0的培养基中，第2天检测到的pH为1.0-0.84，没有分离到乳酸菌。
在pH1.5的培养基中，第2天检测到的pH为1.5-2.0，分离到少于101cfu/ml的乳酸菌。
在pH2.0的培养基中，第2天检测到的pH为2.2-2.5，分离到104-5cfu/ml的乳酸菌；在pH2.5的培养基中，第2天检测到的pH为2.7-3.0，分离到105-6cfu/ml的乳酸菌。
在pH3.0的培养基中，第2天检测到的pH为3.4-3.6，分离到106-7cfu/ml的乳酸菌。
在pH3.5的培养基中，第2天检测到的pH为3.6-3.7，分离到107-8cfu/ml的乳酸菌。
在pH4.0的培养基中，第2天检测到的pH为4.5-5.0，分离到超过108cfu/ml的乳酸菌。
在上述pH基础上进行的第4天培养的检测，结果发现，乳酸菌的数量与第2天检测到的相似。
<表5>CSK 01株的抗酸性实施例15CSK 01株的抗胆汁能力
为了研究CSK 01株的抗胆汁能力，在100ml、10％的脱脂乳中加入猪胆汁(SigB8631)，使胆汁的浓度分别为1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％和4.5％，然后将1ml(5×109cfu/ml)的CSK 01株的培养液接种于这些脱脂乳中，培养2天和4天。然后用保存在4℃的MRS肉汤培养物以10倍逐级稀释该培养液，之后将1ml的稀释液涂布到平板上，测量细胞数量。
胆汁浓度分别为1.0％、1.5％、2.0％、2.5％的脱脂乳中细菌的数量在107-9cfu/ml的范围内，胆汁浓度为3.0％和3.5％的脱脂乳中细菌的数量为105-6cfu/ml，胆汁浓度为4.0％和4.5％的脱脂乳中细菌的数量减到102-3cfu/ml，这个结果证明了CSK01株对胆汁具有抗性。
根据胆汁量的比例，4天培养的结果与2天培养的结果类似，如表6所示。<表6>本发明乳酸菌对胆汁的抗性实施例16CSK 01株在Balb/c小鼠的胃粘膜上的粘附和增殖
为了检测CSK 01株的粘附和增殖，使用20只从Medical Inspection of NationalVeterinary Science得到的2周龄无病菌Balb/c小鼠。具体是，每天给予这些小鼠0.3ml培养了48小时后的CSK 01株的培养液，共10天。
给予培养液2个月后，拣出小鼠的胃，获得其胃粘液，用保存在4℃的MRS肉汤培养物以10倍逐级稀释1g胃粘液。然后，将1ml的稀释液涂布到MRS琼脂平板上，在37℃培养48小时，以便将细胞的数量调整为7×108cfu/ml。
为了使用扫描电子显微镜(SEM)进行观察，将部分胃切碎，用1M磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH7.2-7.4)快速洗涤，然后用2-3％戊二醛在0.1M PBS中的溶液将其固定，在4℃保存2-3小时，然后用相同的缓冲液洗涤，然后用1％四氧化锇在4℃的0.1ml PBS中的溶液进行后固定处理2小时，然后依次用50％、70％、80％、90％乙醇进行脱水处理5分钟，用100％乙醇处理20分钟。
然后，使用乙酸异戊酯作为替代剂，用临界点干燥器干燥，并用离子包衣，以使用电子显微镜(Hitach，S-570)进行观察。结果证实，CSK 01株在胃粘液上粘附并增殖，如图12a和12b所述。实施例17CSK 01株在Balb/c小鼠小肠粘液上的粘附和增殖
为了研究在小肠粘液上的粘附和增殖，如上述从胃粘液中分离得到CSK 01株，用电子显微镜进行观察。
结果获得3×106cfu/ml的CSK 01株，并通过使用电子显微镜进行观察，证实了该菌株粘附到胃粘液上并于其中增殖，如图13a和图13b所示。
如实施例13-17所证明，本发明的CSK 01株对酸和胆汁具有抗性，并粘附到Balc/b小鼠的胃粘液和场粘液上并于其中增殖。实施例18Balb/c小鼠对幽门螺杆菌的感染性
从患者获得幽门螺杆菌，并将其保存在釜山Bokeum医院的微生物学院中。准确地说，选择使用幽门螺杆菌121株。
在厌氧条件下(空气压缩容器)，使用含有10％牛血清的Mueller-Hinton肉汤(NMB)培养基培养该幽门螺杆菌4天，然后将其涂布到10％绵羊血培养基中，再培养4天。由此测定该菌株是革兰氏阳性、可弯曲和成螺旋形，然后用保存在4℃的10％Mueller-Hinton肉汤培养物和玻璃珠收集该菌株。然后，每天通过口腔将0.3ml这些细胞的培养液(2×109cfu/ml)给予Balb/c小鼠，共5天；3天后切下Balb/c小鼠的胃。
用保存在4℃的MHB以10倍逐级稀释1g胃粘液，然后将1ml稀释液涂布到10％绵羊血培养基上。结果分离出7×107cfu/g的细菌。
此外，用电子显微镜观察上述经处理的组织，检测到该组织被大量的细菌所感染，如图14所示。实施例19CSK 01株对Balb/c小鼠中感染的幽门螺杆菌的杀灭效果
通过口腔向感染了幽门螺杆菌的Balb/c小鼠给予CSK 01株的肉汤培养物(5×109cfu/ml)，每天1次，每次0.3ml，共10天；2个月后，研究这些小鼠的胃粘液，使用目前所述的方法检测幽门螺杆菌。结果未发现幽门螺杆菌，检测到的CSK01株为1×109cfu/g。
此外，使用电子显微镜观察上述经处理的胃粘液，检测到粘液中感染了大量的所给予的细菌，但未检测到幽门螺杆菌，如图15所示。实施例20从CSK 01株获得的抗细菌物质对幽门螺杆菌的杀灭效果
在37℃下用10％脱脂乳培养CSK 01株的肉汤培养物48小时，然后将100ml的该肉汤培养物分配成50ml的量，加到超声波仪中，然后维持在4℃30秒钟。重复这个超声处理过程5次(Sonical材料，Vc×375)，然后以10,000g离心30分钟，回收上清液。
然后，将80％饱和度的硫酸铵溶液加到漂浮的细胞(float cell)中，4℃下放置24小时，然后离心，回收沉淀。然后，用保存在4℃的无菌蒸馏水稀释这些细胞成2倍，将所得溶液倒入透析膜(PGC 29-0593-37，MWCO，10K)中，使用蒸馏水在4℃透析48小时。
然后，使用40％饱和度硫酸铵溶液再次分配上述制得的纯化的溶液，在4℃放置24小时，然后以10,000g离心，回收上清液。再次以相同的方法稀释该上清液成两倍体积，然后4℃冻干48小时。
加入10％脱脂乳后，再次将CSK 01株的冻干的抗细菌物质稀释2倍，对其进行超声波处理，然后在10,000G离心，获得上清液。
将幽门螺杆菌的肉汤培养物涂布到含有10％牛血清的Mueller-Hinton琼脂上，将吸收了本发明抗细菌物质的圆片放到该培养皿的中心，在厌氧条件下进行培养。测量了抑制范围，结果证明幽门螺杆菌的增殖在该圆片周围完全被抑制，如图16所示。实施例21Balb/c小鼠大肠粘膜对大肠杆菌O157H7的感染性
从Kyungsang大学兽医科学学院(Department of Veterinary Science)的微生物学实验室获得大肠杆菌O157H7。
将大肠杆菌O157/H7株接种到BHI肉汤培养物上，在37℃培养18小时，通过将无菌的生理盐水加到平板上并使用玻璃珠而获取这些菌株。然后用无菌生理盐水以10倍逐级稀释这些细胞，计算出其数量是3×109cfu/ml。
将此培养基通过口腔给予Balb/c小鼠，每天1次，每次0.3ml，共5天；给予此培养基3天后，切下部分小肠粘液。
加入无菌生理盐水以10倍逐级稀释1g小肠粘液，然后将1ml的稀释液涂布到7％绵羊血培养基上，在37℃培养18小时。结果是，分离得到6×105cfu/g的细胞，并且证实了这些细胞是革兰氏阴性、成杆状，与大肠杆菌O157H7抗血清起阳性反应等等，从而确定这种菌种为大肠杆菌。
另一方面，使用电子显微镜观察小肠粘液，发现了大肠杆菌的生存，并证实了大量的大肠杆菌粘附到该粘液上并于其中增殖，如图17所示。实施例22CSK 01菌种对Balb/c小鼠中感染的大肠杆菌O157H7的杀灭效果
通过口腔向感染了大肠杆菌O157H7的Balb/c小鼠给予CSK 01珠的肉汤培养物(5×109cfu/ml)，每天1次，共10天。使用电子显微镜研究小肠粘液，检测大肠杆菌O157H7。
具体是，用无菌生理盐水以10倍逐级稀释1g小肠粘液，然后将1ml稀释液涂布到BHI琼脂平板上，在37℃培养20小时，以测量细菌的生存。结果未发现大肠杆菌O157H7，当实施与上述相同的方法时，检测到4×105cfu/ml的CSK 01株。
同时，再次用电子显微镜观察上述经处理的小肠粘液。结果证实，该粘液仅被所给予的大量的CSK 01株感染，而根本没有发现大肠杆菌O157H7，如图18所示。实施例23CSK 01株和大肠杆菌O157H7的混合培养物中对大肠杆菌的杀灭效果
将1ml的CSK 01株(2～6×108cfu/ml)MRS肉汤培养物和1ml的大肠杆菌(2～6×108cfu/ml)BHI肉汤培养物调节成具有相同的细胞浓度。将它们一起接种到10％脱脂乳中，在37℃培养5天，培养20小时后开始计算CSK 01株和大肠杆菌的数量。
具体是，使用MRS琼脂培养基评估CSK 01株，使用MacConkey琼脂培养基评估大肠杆菌，将1ml的肉汤培养物涂布到每一种琼脂平板上，以获取各自的细胞数量。
结果检测到，大肠杆菌的数量30小时后减少，然后大多数的细胞自40小时后被杀灭，最终，在70小时后所有的细胞被杀灭，如图19所示。
相反，即使在70小时后CSK 01株的细胞数量也未曾有过改变。实施例24从CSK 01株获得的抗细菌物质对大肠杆菌的杀灭效果
如上述纯化该抗细菌物质，用饱和的硫酸铵溶液使其沉淀，然后冻干，稀释成300mg/ml，然后将20μl的量吸附在圆片上。
将在BHI肉汤中的大肠杆菌细胞涂布在胰胨肉胨琼脂平板上，然后将吸附了该抗细菌物质的圆片放在该平板的中心，然后在37℃培养24小时。结果证实，大肠杆菌在圆片周围的增殖受到抑制，如图20所示。
如实施例18-24所证明，本发明的CSK 01株具有杀灭导致Balb/c小鼠胃炎的幽门螺杆菌和导致Balb/c小鼠的肠炎的大肠杆菌的抗细菌特性。
工业应用性
如上所述，本发明涉及新颖的类干酪乳杆菌株(类干酪乳杆菌类干酪亚种CSK01)，采用下述方法制得这种菌种从胃粘膜中分离出乳酸菌；将这些乳酸菌给予胃肠炎患者；再从恢复的患者的粪便中分离出该菌种。本发明的乳杆菌菌株可粘附到胃和场粘膜上，并于其上增殖，该菌株对酸性和胆汁质条件具有显著的抗性，并具有优异的抗细菌特性，尤其是抗幽门螺杆菌。因此，该乳杆菌菌株及其抗细菌物质可有效用于各种领域。
本领域中熟练的技术人员将理解，前面描述中公开的概念和特殊的实施方式可易于用作修改或设计其它实施本发明的相同目的的实施方式的基础。本领域中熟练的技术人员还将理解，这些等价的实施方式不偏离附带权利要求所设的本发明的实质和范围。
序列表序列表(1) 总述 (iii)序列数目18(2) SEQ ID NO1的信息 (i)序列特征
(A) 长度碱基对
(B) 类型核酸
(C) 链型双链
(D) 拓扑结构直线形
(xi)序列描述SEQ ID NO1(3) SEQ ID NO2的信息 (i)序列特征
(A) 长度24个核酸
(B) 类型核酸
(C) 链型单链
(D) 拓扑结构直线形
(xi)序列描述SEQ ID NO2CCCACTGCTG CCTCCCGTAG GAGT(4) SEQ ID NO3的信息(i)序列描述
(A) 长度18个核酸
(B) 类型核酸
(C) 链型单链
(D) 拓扑结构直线形(xi)序列描述SEQ ID NO3CACCGAGATT CAACATGG 18(5) SEQ ID NO4的信息 (i)序列特征
(A) 长度10个核酸
(B) 类型核酸
(C) 链型单链
(D) 拓扑结构直线形
(xi)序列描述SEQ ID NO4CAGCACCCAC 10(6) SEQ ID NO5的信息 (i)序列特征
(A) 长度10个核酸
(B) 类型核酸
(C) 链型单链
(D) 拓扑结构直线形
(xi)序列描述SEQ ID NO5AACGCGCAAC 10
权利要求
1.类干酪乳杆菌类干酪亚种CSK 01株，其特征在于，它具有抗细菌特性，(登记号KCTC 0907 BP)。
2.如权利要求1所述的类干酪乳杆菌类干酪亚种CSK 01株，其特征在于，所述抗细菌特性是抗幽门螺杆菌和大肠杆菌。
3.如权利要求1所述的类干酪乳杆菌类干酪亚种CSK 01株，其特征在于，所述菌种对酸和胆汁具有抗性，并可在胃粘液和肠粘液上粘附和增殖。
4.一种制备权利要求1所述的类干酪乳杆菌类干酪亚种菌株的方法，它包括(1)向胃肠炎患者给予从猪的胃粘液获得的乳酸菌；(2)在这些患者完全病愈后，再从他们的粪便中分离出乳酸菌；(3)进行16S rRNA测序和RAPD聚合酶链式反应鉴别出该乳酸菌菌株。
5.一种抗细菌物质，其特征在于，它从权利要求1所述的类干酪乳杆菌类干酪一亚种菌株中分离得到，它杀灭幽门螺杆菌和大肠杆菌O157H7或抑制它们的增殖。
6.一种食物组合物，其特征在于，该组合物含有作为有效成分的权利要求1所述的乳杆菌菌株，该菌株具有预防和治疗由幽门螺杆菌引起的胃炎、胃溃疡和十二指肠炎以及由大肠杆菌和其它肠道致病性细菌引起的肠炎、结肠炎和直肠炎的功能。
7.一种药学组合物，其特征在于，该组合物含有作为有效成分的权利要求1所述的乳杆菌菌株，该菌株具有预防和治疗由幽门螺杆菌引起的胃炎、胃溃疡和十二指肠炎以及由大肠杆菌和其它肠道致病性细菌引起的肠炎、结肠炎和直肠炎的功能。
全文摘要
本发明涉及新颖的乳酸菌属微生物、其抗细菌物质以及它们的制备方法。具体而言，本发明涉及新颖的类干酪乳杆菌属菌株(类干酪乳杆菌类干酪亚种CSK01，Lactobacillusparacasei subsp.paracasei CSK 01〕，它采用下述步骤制得(1)向胃肠炎患者给予从猪的胃粘液获得的乳酸菌；(2)在这些患者完全病愈后，再从他们的粪便中分离出乳酸菌；(3)进行16SrRNA测序和RAPD聚合酶链式反应鉴别出该细菌菌株。本发明的乳杆菌可粘附在胃和肠粘膜上，并在它们上面增殖，该乳杆菌可突出地抵抗酸性条件和胆汁质条件，并具有优异的抗细菌特性，从而可广泛用于开发新药、功能性食物、增进健康的添加剂等。
文档编号A61P31/04GK1406274SQ0180566
公开日2003年3月26日 申请日期2001年12月28日 优先权日2000年12月29日
发明者曹性根 申请人:曹性根