专利名称：治疗性抗体或抗体片段的高效大肠杆菌表达发酵工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质医药生物工程与技术领域，具体涉及ー种治疗性抗体或抗体片段的高效大肠杆菌表达发酵エ艺。
背景技术：
单克隆抗体(抗体类)药物靶向性強，副作用低，疗效显著，目前广泛用于肿瘤、类风湿性关节炎等疾病的治疗，并产生了巨大的社会和经济效益。在2011年，全球抗体类药物销售额突破400亿美元。在销售额排名前10位的生物技术药物中，抗体药物共6个，且前5个药物均为治疗性抗体。单克隆抗体从最初的鼠源性单抗历经嵌合单抗、人源化单抗， 目前已经发展到全人源单抗和全人源抗体片段阶段。全人源单抗因其不含有鼠源性成分， 在临床应用上安全性更高、疗效显著，受到国内外单克隆抗体研制単位的高度重视。目前全球已经批准20个以上的全人源单抗，有100多种正在进行临床研究，全人源单抗成为治疗用单克隆抗体研究开发的主流和热点。在中国，抗体药物产业发展相对落后，主要表现为原创性抗体药物品种不足和哺乳动物细胞大规模培养核心技术如细胞密度、抗体表达量等总体水平落后。限制中国治疗性抗体产业发展的主要问题为1)基础研究起点低治疗性抗体研发力量薄弱，少有具有自主知识产权的候选抗体，尤其是在抗体筛选的技术平台方面没有自主创新；2)哺乳动物细胞培养技术/基础差大量生产抗体的动物细胞大規模培养技术仍然处发展阶段。人们目前解决这些问题的方法集中在研发哺乳细胞大規模エ业培养技术(设备和过程エ艺)。但是，或许是仰慕于世界范围内15年来人源化单克隆全分子抗体的巨大成功， 人们过多的关注在动物细胞培养表达的全分子单克隆抗体。但是世界治疗性抗体技术在本世纪的飞速发展为中国解决在中国发展治疗性抗体产业提供了另ー个切实可行的新方法和机遇，这就是治疗性抗体片段分子药物的开发。人源化抗体可变区片段的优点是(I)它是较小的抗体有效结合部位(VL和VH)， 分子量只有全抗体分子的1/5 - 1/10; (2)可以有效地在大肠杆菌、酵母菌、哺乳细胞等多个表达体系内进行较高水平和高质量的可溶性表达；(3)由于其分子小，它的稳定性优于全分子抗体，这个特性可以简化生产过程的下游纯化；(4)由于其分子小，它可以发展多种剂型，比如注射剂、吸入剂、ロ服剂等，同时它还可以进入组织和细胞内部作用与细胞内的靶点，应用范围广；(5)由于其分子量小，它的单位重量分子数是全分子抗体的5-10倍，因此单位剂量的抗体起作用效能远高于全分子抗体，进而显著降低用药成本；(6)由于其分子量小，可以发展同时作用于两个靶点的双功能的治疗性抗体，全分子抗体相对难以完成这个任务；(7)由于其分子量小，可以采用多种可能的延长半衰期的技术方法并不增加表达的技术难度，等等。目前，在世界范围内，研究人员对大肠杆菌发酵制备治疗性抗体或抗体片段ェ艺有广泛的尝试，但在治疗性抗体或抗体片段的生产效率的提高上遇到诸多困难。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种治疗性抗体或抗体片段的高效大肠杆菌表达发酵工艺，能够高效地从大肠杆菌发酵体系中可溶性表达治疗性抗体或抗体片段。为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是一种治疗性抗体或抗体片段的高效大肠杆菌表达发酵工艺，包括如下步骤
(1)发酵菌种的准备在新鲜配制的含有IO-IOOmM四环素的卢波平板上均匀涂布大肠杆菌菌液，在37°C培养16小时，挑取分散良好的大肠杆菌菌株，转移至含有IO-IOOmM四环素的卢波培养基中，在37°C摇床培养16小时，最后将上述卢波培养基按I :10-1 :1000的接种比例接种到IOOmf IOOOml的卢波培养基中，在37°C摇床培养8小时；
(2)培养基和流加培养液的制备
培养基的制备将酵母提取物35-55g、蛋白胨25-50g、磷酸二氢钾l_5g、磷酸氢二钾 10_50g、抗生素I μ g-lmg、消泡剂100-500 μ mol,均勻混合,加入O. 6L的水，室温下搅拌 30min至液体澄清，然后加入甘油10-90g，室温搅拌lOmin，待混合均匀，继续加入水为IL溶液，然后使用25%氨水或35%磷酸调整pH至6-8，在100-120°C高压灭菌20分钟；
流加培养液的制备将酵母菌提取物50-100g、硫酸铵IO-IOOg,均匀混合，加入0. 6L 水,室温下搅拌30分钟至液体澄清，然后加入甘油400-800g,室温搅拌10分钟，待混合均匀，补水至1L，在100-120°C高压灭菌20分钟。(3)发酵在发酵罐中填充培养基，当温度为25_35°C后，按照1:100的接种比例接种IOOml的吸光度八_为1-2的大肠杆菌菌种到10L发酵罐中，同时加入四环素，发酵参数设定为温度 T=25-37°C，酸碱度 ρΗ=6· 0-7. 5，转速 S=500rpm-1400rpm，通气量为 V=l_5vvm， 发酵12-15h后，发酵液中溶氧(DOT)出现显著波动时，开始流加培养液，流速为50-200ml/ h，发酵到16 20小时后加入诱导素；调整发酵温度至T=20-25°C，流加速度调整为25_50ml/ ho发酵进行到60-90小时后收集发酵液，清洗罐体，结束发酵。在本发明一个较佳实施例中，所述的培养基的组成为酵母提取物35-55g、蛋白胨 25-50g、磷酸二氢钾l_5g、磷酸氢二钾10-50g、抗生素、消泡剂100-500 μ mol、甘油10_90g、 水 0.9-1L。在本发明一个较佳实施例中，所述的流加培养液的制备是酵母菌提取物50-100g、 硫酸铵 IO-IOOg,甘油 400-800g、水 0. 6-1L。在本发明一个较佳实施例中，所述的抗生素为四环素、卡那霉素或羧苄青霉素中的一种。
在本发明一个较佳实施例中，所述的治疗性抗体或抗体片段是指功能基团抗体、片段抗体、单链抗体或纳米抗体中的一种。在本发明一个较佳实施例中，所述的治疗性抗体是单链抗体中的一种。在本发明一个较佳实施例中，所述的大肠杆菌是指肠杆菌科埃希氏菌属的埃希氏菌及其亚种。本发明的有益效果是本发明提供了培养基和流加培养液能充分满足大肠杆菌在发酵过程中的营养要求，而且有效控制了发酵过程中的关键参数，采用本发明的发酵工艺， 可高效从大肠杆菌发酵体系中可溶性表达制备治疗性抗体分子，有效降低治疗性抗体的生产成本，具有独特的创新性，其产品可以满足医药，科研和临床诊断对相关人源化抗体产品的需求。
图I是SDS-PAGE法检测发酵反应生成的治疗性单链治疗性抗体的电泳图，I、蛋白质分子量marker ;2、诱导前上清液#I ;3、诱导前上清#2 ;4、诱导前上清#3 ;5、发酵上清液；
6、发酵胞质空间组分I ;7、发酵胞质空间组分II ;8、1.0 8/1标准品；9、1.0 g/L标准品； 10、1.0 g/L 标准品；
图2是诱导前发酵上清液和诱导后发酵上清液的免疫印迹检测的检测结果图3是SDS-PAGE法检测发酵反应生成的片段抗体电泳图，M、蛋白质分子量marker ;1、 诱导后上清液；2、诱导前上清液；3、52kD片段抗体纯化结果；
图4是SDS-PAGE法检测发酵反应生成的功能基团抗体电泳图，M、蛋白质分子量 marker ;1、诱导前菌体总蛋白；2、诱导后菌体总蛋白；3、总蛋白过层析柱后流出样品。4-12 纯化19kD功能基团抗体；
图5是SDS-PAGE法检测发酵反应生成的纳米抗体电泳图，I、Marker ;2、标准品(lg/ L) ； 3、标准品(0. 5g/L) ； 4、诱导前上清液；5、诱导前胞质空间组分I ;6、诱导前胞质空间组分II ;7、诱导后发酵上清；8，诱导后胞质空间I组分；9诱导前胞质空间II组分。
具体实施例方式本发明的大肠杆菌菌种来源为中国微生物菌种保藏管理委员会。实施例I 单链治疗性抗体(Single Chain Antibody Fragment, scFv)
(I)囷种制备
在新鮮配制的含有四环素的卢波(Luria Broth, LB)平板上均匀涂布大肠杆菌菌液， 37°C培养16小吋。挑取分散良好的大肠杆菌菌株，在LB含有四环素的培养基中37°C摇床培养，16小时。将上述过夜培养的I :100接种到200ml的LB培养基中，37°C摇床培养8小时左右作为发酵菌种使用。(2)培养基和流加培养液的制备
培养基的制备将酵母提取物35-55g、蛋白胨25-50g、磷酸ニ氢钾l_5g、磷酸氢ニ 钾10g-50g、抗生素Iii g-lmg、消泡剂100-500ii L，均匀混合，加入0. 6L的水，室温下搅拌 30min至液体澄清，然后加入甘油10-90g，室温搅拌lOmin，待混合均匀，继续加入水为IL溶液，然后使用25%氨水或35%磷酸调整pH至6-8，在100_120°C高压灭菌20分钟；
流加培养液的制备将酵母菌提取物50-100g、硫酸铵IO-IOOg,均匀混合，加入0. 6L 水,室温下搅拌30分钟至液体澄清，然后加入甘油400-800g,室温搅拌10分钟，待混合均匀，补水至1L，在100-120°C高压灭菌20分钟。(3)发酵
在发酵罐中填充培养基，当温度为30°C后，接种200ml吸光浓度A6tltl=I的大肠杆菌菌种到20L发酵罐中，同时加入四环素，将接种时间记录为发酵时间的开始，发酵參数设定为温度 T=25°C _37°C，酸碱度 pH=6. 0-7. 5 转速 S=500rpm_1400rpm，通气量为 V=l_5vvm。 发酵12-15h发酵液中溶氧(DOT)出现显著波动时，开始流加加入营养液，流速为50-200ml/ ho发酵16-20小时后加入lmol/L的诱导素，到终浓度为0. ImM-IOmM,同时调整发酵温度T=20-25°C°C，流加速度为25-50ml/h。发酵进行期间测定发酵液A600处吸光值用于判断菌体扩增情况。发酵进行到80小时后收集发酵液，清洗罐体,结束发酵。(4)发酵液处理
发酵液采用渗透压冲击法处理释放目的蛋白，分别将诱导前发酵液#1、诱导前发酵液#2、诱导前发酵液#3和诱导后发酵液，经5000rpm离心处理60分钟后分别收集诱导前发酵上清液#1、诱导前发酵上清液#2、诱导前发酵上清液#3和诱导后上清液，诱导后上清液使用蔗糖、乙二胺四乙酸缓冲液重悬沉淀菌体，静置16小时后按照再次离心。收集离心发酵胞质空间组分0SI，并使用ImM镁离子溶液重新悬沉淀，4°C震荡过夜。再次离心，弃去菌体，收集发酵胞质空间组分0SII。(5)抗体纯化
蛋白纯化采用阳离子交换预装柱进行纯化。样品准备将诱导前发酵液#1、诱导前发酵液#2、诱导前发酵液#3、诱导后上清液与发酵胞质空间组分OSII和发酵胞质空间组分 OSII经1:50稀释后，高速离心30min，分别取上清对O. 02mM的PB柱透析过夜，随后对蛋白溶液进行12000rp，4°C离心30分钟，再经O. 22 μ m的滤膜过滤；每个CMM预装离子交换柱使用O. OlmM PB缓冲液平衡，采用10倍体积O. 02mM的PB平衡柱子洗脱杂蛋白至A28tl检测线与基线平行；使用精氨酸盐缓冲液分步洗脱；同时检测洗脱蛋白量(A28tl)收集各部分蛋白并在浓缩后通过SDS-PAGE电泳检测。(6)检测结果
经过80小时的发酵反应，按照上述参数控制严格发酵工艺流程。发酵过程中将16小时，48小时，64小时，72小时时间点的菌液样本浓度进行检测，获得A_处吸光度分别为 70.0, 82.8，130，99.8。发酵液经渗透压冲击处理，分成诱导前发酵液#1、诱导前发酵液#2、诱导前发酵液#3、诱导后上清液与发酵胞质空间组分OSII和发酵胞质空间组分0SII，同时取I. Og/L,
0.5 g/L, O. 25 g/L标准品，利用12% SDS-PAGE电泳检测各个组分中重组蛋白含量，电泳结果显示抗体在诱导后上清液与发酵胞质空间组分OSII和发酵胞质空间组分OSII上清中均有高效表达(检测结果见附图I)。将收获时发酵上清液(lane I)和诱导前发酵上清液(lane 2)的12% SDS-PAGE胶电转移到PVDF膜上，然后使用HRP-protein A偶联物检测，通过ECL化学发光底物产生光信号，曝光底片。免疫印迹分析显示所表达蛋白可以为protein-A所识别，指示其正确的抗体结构(检测结果见附图2)。实施例2 片段抗体(Fragment Antibody, Fab)。本实施例前5步同实施例一前5步；
发酵液经渗透压冲击处理，分成诱导前上清液，诱导后上清液和，52kD Fab纯化结果利用12% SDS-PAGE电泳检测各个组分中重组蛋白含量，电泳结果显示抗体在诱导后上清液与 52kD Fab纯化结果中均有高效表达(检测结果见附图3)。实施例3 功能基团抗体(Domain Antibody, dAb)。本实施例前5步同实施例一前5步，，表达结果和检测结果见附图4。抗体分子主要存在于培养上清内
实施例 4 纳米抗体(Single Domain Antibody, SdFv / Nanobody)本实施例的5步前操作基本上同实施例一的前5歩。大肠杆菌发酵表达Nanobody的结果见附图4,目标抗体蛋白分子量为16kDa,所表达抗体分布于大肠杆菌培养液上清和细胞胞质空间内。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
权利要求
1.一种治疗性抗体或抗体片段的高效大肠杆菌表达发酵工艺，其特征在于，包括如下步骤(1)发酵菌种的准备在新鲜配制的含有IO-IOOmM四环素的卢波平板上均匀涂布大肠杆菌菌液，在37°C培养16小时，挑取分散良好的大肠杆菌菌株，转移至含有IO-IOOmM四环素的卢波培养基中，在37°C摇床培养16小时，最后将上述卢波培养基按I :10-1 :1000的接种比例接种到IOOmf IOOOml的卢波培养基中，在37°C摇床培养8小时；(2)培养基和流加培养液的制备培养基的制备将酵母提取物35-55g、蛋白胨25-50g、磷酸二氢钾l_5g、磷酸氢二钾 10_50g、抗生素I μ g-lmg、消泡剂100-500 μ mol,均勻混合,加入O. 6L的水，室温下搅拌 30min至液体澄清，然后加入甘油10-90g，室温搅拌lOmin，待混合均匀，继续加入水为IL溶液，然后使用25%氨水或35%磷酸调整pH至6-8，在100-120°C高压灭菌20分钟；流加培养液的制备将酵母菌提取物50-100g、硫酸铵IO-IOOg,均匀混合，加入0. 6L 水,室温下搅拌30分钟至液体澄清，然后加入甘油400-800g,室温搅拌10分钟，待混合均匀，补水至1L，在100-120°C高压灭菌20分钟。
2.(3)发酵在发酵罐中填充培养基，当温度为25-35°C后，按照1:100的接种比例接种IOOml的吸光度八_为1-2的大肠杆菌菌种到10L发酵罐中，同时加入四环素，发酵参数设定为温度 T=25-37°C，酸碱度 ρΗ=6· 0-7. 5，转速 S=500rpm-1400rpm，通气量为 V=l_5vvm， 发酵12-15h后，开始流加培养液，流速为50-200ml/h，发酵到16 20小时后加入诱导素；调整发酵温度至T=20-25°C，流加速度调整为25-50ml/h。
3.发酵进行到60-90小时后收集发酵液，清洗罐体，结束发酵。
4.根据权利要求I所述的治疗性抗体或抗体片段的高效大肠杆菌表达发酵工艺，其特征在于，所述的培养基的组成为酵母提取物35-55g、蛋白胨25-50g、磷酸二氢钾l_5g、磷酸氢二钾 10-50g、抗生素、消泡剂 100-500 μ mol、甘油 10_90g、水 0. 9-1L。
5.根据权利要求I所述的治疗性抗体或抗体片段的高效大肠杆菌表达发酵工艺， 其特征在于，所述的流加培养液的制备是酵母菌提取物50-100g、硫酸铵10-100g，甘油 400-800g、水 0.6-1L。
6.根据权利要求I所述的治疗性抗体或抗体片段的高效大肠杆菌表达发酵工艺，其特征在于，所述的抗生素为四环素、卡那霉素或羧苄青霉素中的一种。
7.根据权利要求I所述的治疗性抗体或抗体片段的高效大肠杆菌表达发酵工艺，其特征在于，所述的治疗性抗体或抗体片段是指功能基团抗体、片段抗体、单链抗体或纳米抗体中的一种。
8.根据权利要求5所述的治疗性抗体或抗体片段的高效大肠杆菌表达发酵工艺，其特征在于，所述的治疗性抗体或抗体片段体是单链抗体中的一种。
9.根据权利要求I所述的治疗性抗体或抗体片段的高效大肠杆菌表达发酵工艺，其特征在于，所述的大肠杆菌是指肠杆菌科埃希氏菌属的埃希氏菌及其亚种。
全文摘要
本发明公开一种治疗性抗体或抗体片段的高效大肠杆菌表达发酵工艺，步骤为(1)发酵菌种的准备；(2)培养基和流加培养液的制备；(3)发酵在发酵罐中填充培养基，当温度为25℃-35℃后，按照1:100的接种比例接种100ml的吸光度A600为1-2的大肠杆菌菌种到10L发酵罐中，同时加入四环素，进行发酵，发酵进行到60-90小时后收集发酵液，清洗罐体，结束发酵。采用本发明的发酵工艺，可高效从大肠杆菌发酵体系中可溶性表达制备治疗性抗体分子，有效降低治疗性抗体的生产成本，具有独特的创新性，其产品可以满足医药，科研和临床诊断对相关人源化抗体产品的需求。
文档编号C12R1/19GK102586368SQ201210074128
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月20日 优先权日2012年3月20日
发明者刘冰, 张芃芃, 杨冬, 杨艳坤, 龙泉 申请人:拜明(苏州)生物技术有限公司