专利名称：稻瘟病抗性基因Piym2及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种水稻稻瘟病抗性基因的分离克隆与应用。
背景技术：
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米为主要粮食。稻瘟病是水稻最主要的病害之一，全球每年因稻瘟病造成的稻谷减产达10% 30%，严重时达30% 50%，甚至颗粒无收。在我国稻瘟病常年发生面积在380万亩左右，造成数亿公斤的稻谷损失，直接威胁着国家的粮食安全。培育和利用抗病品种一直被公认为最经济有效和环境友好的稻瘟病防治措施。但是，由于稻瘟病菌群体结构复杂，加之其致病性易于发生变异，一些潜在的或新产生的致病小种的迅速繁殖，一个抗病品种往往推广3-5年就发生感病化。广泛挖掘抗病资源，鉴定和克隆抗病基因，培育广谱、持久抗病新品种，是当前水稻抗稻瘟病病育种研究工作的当务之急O随着分子生物学的快速发展，迄今至少已有70多个水稻抗稻瘟病主效基因被分子定位，分别位于除第3染色体以外的11条水稻染色体上，其中2/3以上位于第6、11和 12染色体，且成簇分布。在稻瘟病抗性基因克隆方面，正式报道的已有18个抗性基因，即 Pib, Pita、Pi9,Pi2, Piz~t、Pi_d2、Pi_d3、Pi36、Pi37、Pik、Pik_m、Pik~p、Pi5、Pia、Pit、 Pish ,pi 21, Pb I。除Pid2编码一个丝氨酸/苏氨酸受体类激酶，编码一个富含脯氨酸的蛋白，各自代表一种新的抗性基因类型外，其余的已克隆的16个基因全都属于NBS-LRR (Nucleotide binding site-Leucine rich repeat)基因家方矣。Pib (Wang et al.，1999)是第一个被克隆的稻瘟病抗性基因，克隆自日本粳稻品种TohokuIL9,位于水稻第2染色体的长臂末端。它包含有4个内含子,全长cDNA由I 个5’非翻译区(UTR)、1个的开放阅读框(ORF)和I个3’非翻译区等组成。Pib编码一个由1251个氨基酸组成的蛋白产物，属于典型的NBS-LRR类抗病基因。环境条件(如温度、 光照等)的变化可影响的表达。Pita (Bryan et al. , 2000)克隆自日本粳稻品种Yashiro-Mochi,位于水稻第 12染色体近着丝点区域。它包含2个外显子和I个的内含子，编码一个由928个氨基酸组成的质膜受体蛋白，包含NBS结构域和富亮氨酸结构域(LRD)抗感位点编码的产物只有一个氨基酸的差异，即918位的丙氨酸变为丝氨酸。Pi-ta介导的抗性可能是Pi-ta蛋白与AVR-Pita蛋白互作的结果，但需要一个与之共分离的单显性基因产斤“)的参与(Jia et al. , 2008)。Pi9 (Qu et al. , 2006)、朽之和Piz-i (Zhou et al. , 2006)均位于第 6 染色体短臂近着丝粒区，都属于NBS-LRR类基因，但它们的2个内含子分别位于NBS区之前和LRR 区之后，而不像其他NBS-LRR基因的内含子位于NBS区的激酶2的N端。Pi 2与Pi z~t高度同源，两者仅有八个氨基酸不同，分布在3个保守的LRR结构区内，显示了 LRR结构区与基因的小种专化性有关。Pi-d2 (Chen et al. , 2006)和朽-必(Shang et al. , 2009)都克隆自我国籼稻品种地谷。Pi-必位于第6染色体短臂近着丝粒区，编码一个丝氨酸/苏氨酸蛋白受体激酶，其抗感差异由单碱基突变造成的，即第441氨基酸由异亮氨酸(I)突变为甲硫氨酸(M)。
位于第6染色体长臂的近着丝粒区，含有2个外显子，编码一个由923氨基酸组成的蛋白，产物含有NBS-LRR结构域和MHD基序。其抗感差异也是因一个单碱基突变造成的，即抗病品种的LRR结构域的第2208位核苷酸处C在感病品种中突变为T，造成编码蛋白的提前终止。Pi36 (Zhai et al. , 2011)克隆自籼稻品种Q61，位于第8染色体短臂上。它编码1056个氨基酸，在基因组中为单拷贝，组成性表达，抗、感位点编码的蛋白仅在第590个氨基酸的位置上存在一个氨基酸的差异(Asp - Ser) oPi37 (Zhai et al. , 2011)克隆自粳稻品种St. No. 1，位于第I染色体长臂上。它编码1290个氨基酸，也是组成型表达，其抗性的获得是因第239位(丙氨酸突变为缬氨酸)和第247位氨基酸(蛋氨酸突变为异亮氨酸)发生置换引起的。Pik (Zhai et al. , 2011) ^Pik~m (Ashikawa et al. , 2008)和(Yuan et al., 2011)，是位点上的3个等位基因，位于第11染色体长臂近末端区域。这3个基因的抗性均由2个紧密连锁的NBS-LRR类互补基因提供。Pik的2个互补基因编码的蛋白与和对应的等位基因所编码的蛋白有非常高的同源性。(Lee et al., 2009)和/ (Okuyama et al.，2011)也都包含 2 个 NBS- LRR 类基因。位于第 9 染色体近着丝粒短，其2个NBS- LRR类基因分别编码1025和1063个氨基酸，一个受病原菌诱导表达，另一个组成性表达。Pia位于第11染色体短臂，其2个NBS- LRR类基因虽然相邻但方向相反。Pit (Hayashi and Yoshida, 2009)克隆自日本粳稻品种K59,位于第I染色体近末端区域。与感病Γ雄⑴不同的是，抗病化5到的启动子中插入了一个长的反转座子，同时在NBS和LRR结构域各有2个氨基酸替换。反转座子激活了Pii基因的表达，对Pit 恢复抗性功能起到至关重要的作用。Pish (Takahashi et al.，2010)克隆自日本粳稻品种新2号，位于第I染色体长臂上。它是利用反转座子插入突变方法克隆的，与的氨基酸一致性大98%。pi21 (Fukuoka et al. , 2009)是第一个被克隆的隐性抗稻痕病基因，是位于第4 染色体上的一个主效QTL。与感病品种相比,抗病品种Owarihatamochi的基因中分别有21bp和48bp的缺失。感病等位基因编码一个由266氨基酸组成的富含脯氨酸的蛋白，负调节抗病性。(Hayashi et al, 2010)是一个具有成株抗性和穗瘟抗性的基因，来自籼稻品种Modan，位于第11染色体长臂上一个以60_kb为单位的串联重复序列中。Pbl基因在NBS区域不包含P-Ioop结构，其它一些基序也发生了退化。在含作2的品种中，作7基因的转录水平随发育进程而增加，其功能化是通过基因组重复在编码序列上游安置一个启动子序列而激活“沉睡的”饱Pbl的结果。稻瘟病抗性基因的克隆及其功能分析，为人们理解水稻抗稻瘟病分子机理提供了一定的信息。首先，在已克隆的18个基因中有16个属于NBS-LRR类基因家族，有理由相信， 水稻中抗稻瘟病基因绝大多数应该是NBS-LRR类基因；其次，多数抗病基因成簇分布，且簇内基因间同源性很高，暗示着水稻与病原菌协同进化过程中抗性基因有可能通过复制、重组、插入及碱基突变等方式产生不同的抗性基因；另外，在分子水平上证实了抗性基因与病原菌的无毒基因相互识别的“基因对基因”假说，相对于无毒基因的快速进化，水稻需要不断地产生新的抗性基因。稻瘟病抗性基因的分离和获得，为抗稻瘟病转基因育种提供了基因源。在已克隆的稻瘟病抗性基因中，除部分抗性基因和作7外，其他基因都表现完全抗性，其小种专化性强，抗性易于丧失.至子pi21和作2，虽然具备持久抗性的某些特征，但抗性程度弱，在稻瘟病大流行年份难以真正发挥作用。由于田间稻瘟病菌小种众多且变异速度快，为了更好地应对稻瘟病的危害，克隆更多的抗稻瘟病基因就显得尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种稻瘟病抗性基因及其应用，将所述基因转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物，特别是可以用杂交和转化方法在植物中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中连锁累赘问题，并且可以缩短育种时间，提高品种选育效率。本发明的目的是提供一种水稻稻瘟病抗性基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。该DNA序列编码一种NBS- LRR类蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所列，结构如图 8所示。因而，本发明的另一个目的是提供上述抗稻瘟病基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。本发明的另一个目的是提供用于扩增上述抗稻瘟病基因的特异性引物对，其正向引物如SEQ ID NO. 3所示，反向引物如SEQ ID NO. 4所示。本发明的另一个目的是提供含有上述抗稻瘟病基因的载体。本发明所分离、克隆的抗性基因编码NBS-LRR蛋白。该种蛋白包含两个主要的结构域NBS和LRR区域,其中NBS结构域含有保守的激酶la (kinase la) kinase la: GGAGKS,激酶 2 (kinase 2) :LLYLDDV 和激酶 3a (kinase 3a) :GSRVLVTSRQ。而该蛋白的C-末端为27个典型LRR重复，其亮氨酸含量为16. 4%。本发明同样包括将抗性基因的主要结构部分连接上合适的调节序列所形成的嵌合基因，以及在基因组中包含这种基因的植物和这种植物的种子。这种基因可以是天然的或是嵌合的。例如，将包含该基因的片段和一个组成型表达的启动子如花椰菜花也病毒的35S启动子等连接，或者和一个组织/发育时期特异性表达的启动子或环境条件诱导的启动子连接。其中，组织和发育时期包括叶、果实、种子和花等，环境条件包扩病原菌的攻击、厌氧条件和光等。本发明提供的稻瘟病抗性基因具有重要的应用价值。将所述的基因编码区序列连接到植物载体，导入到水稻或其他植物细胞，可获得表达所述基因的转基因抗病品种，从而应用于生产。本发明所属的基因构建到植物转化载体中，可以对所属基因或其调控序列做适当的修饰，也可以在其转录起始密码子前用其他的启动子取代原有的自动子，从而拓宽和增强对病原菌的抗性。本发明具有如下明显的有益效果来源于我国云南粳稻品种YMG，是一个广谱、持久抗性的地方品种。克隆来源于 YMG的稻瘟病抗性基因，可以广泛应用于抗稻瘟病水稻的育种。将泛基因转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用杂交和转化方法在植物中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中连锁累赘问题，并且可以缩短育种时间，提高品种选育效率；抗病基因的克隆是解决传统育种中种间基因转移存在障碍的基础。
图I为水稻稻瘟病抗性基因Piym2的遗传和物理图谱
图2为Piym2引物从抗感亲本DNA里扩增出的目的片段琼脂糖凝胶电泳图其中M1: 15kb DNA分子量标记；M2: 2kb DNA分子量标记图3为互补载体pCAMBIA1305. I结构4为过表达载体pCUbil390结构图
图5为水稻稻瘟病抗性基因泛基因组互补转化T1植株的稻瘟病抗性鉴定图其中，I YMG ；2 Fujisaka5 ;3_14分别表示12个以Fujisaka5为背景的转基因单株。R 代表抗病，S代表感病。A.各T1单株的稻瘟病抗性表型；B.各T1单株的潮霉素标记基因型，PCR反应体系如下10μ I 2XPCR Buffer for KOD FX,4y I dNTPs (2mM each), I μ I 引物(10 μ M, F+R)，0.4y I KOD FX 酶(lU/μ 1，Τ0Υ0Β0)，I μ I DNA 模板(IOOng/μ I )，加 ddH20 至 20μ I ;扩增反应条件94°C 2 min ；98°C 10s — 55°C 30s ^ 68°C 50s，35 个循环 —68°C 5 min, 16°C保存。图6为水稻稻瘟病抗性基因Piym2过表达转化T1植株的稻瘟病抗性鉴定图其中，I YMG ；2 Fujisaka5 ;3_12分别表示10个以Fujisaka5为背景的转基因单
株。R代表抗病，S代表感病。A.各T1单株的稻瘟病抗性表型；B.各T1单株的潮霉素标记基因型，PCR反应体系及扩增反应条件同图5B。图7为水稻稻瘟病抗性基因Piym2基因的结构图8为水稻稻瘟病抗性基因编码的氨基酸序列结构其中，N端带单下划线字母为组成推定的2个CC (coil-coil)结构域；中间带单下划线并加粗倾斜的字母位NBS的3个保守区域；该蛋白的C-末端的590-1288个氨基酸为27 个LRR重复。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法(例如山崎义人、 高坂淖尔编著.稻瘟病与抗病育种(凌忠专、孙昌其译).农业出版社，1990 ;路铁钢等编著.分子遗传学.高等教育出版社，2008)。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I :水稻稻瘟病抗性基因Piym2的遗传分析及初步定位
为了发掘和鉴定稻瘟病新抗性基因，对不携带任何主效抗稻瘟病基因的感病粳稻地方品种丽江新团黑谷(Lijiangxintuanheigu,简称LTH)与云南地方粳稻品种羊毛谷 (Yangmaogu,简称YMG)配制杂交组合，采用F1' F2及F3群体对YMG的稻瘟病抗性遗传进行了深入的研究，鉴定和定位了 Piyml和Piym2两个主效抗性基因。其中对来自我国籼稻区的稻瘟病菌株CH43表现抗性，被定位在水稻第I染色体长臂上(图I)。实施例2 :稻瘟病抗性基因Piym2的精细定位与候选基因预测
本发明利用图位克隆和生物信息学方法克隆抗性基因Α>^ 。为精细定位该基因，利用从LTH /YMG F2群体中分离出来的对稻瘟病鉴别菌株表现极端感病单株1990个，及表现极端抗病的单株1060个，通过用连锁标记以及F3后代表型验证，洛Piym2定位在标记CAPS2 和dCAPS5之间。在日本晴参考序列中，该区间为78. 8 Kb，包含10个候选基因，其中4个基因i0s01g57270、0s01g57280、0s01g57310和)是与抗病相关的NBS-LRR结构的基因，都聚集于克隆81100010上，跨越52.0103的区间。测序发现，在YMG中该区间大约为43 Kb, 利用 FGENESH 软件(http://linuxl. softberry. com/berry, phtml)进行基因预测发现,这 43 Kb序列含有7个基因，其中2个为NBS-LRR类基因(图I)。通过下述实验确定第二个 NBS-LRR类基因(候选基因)即为目标基因Piym20
实施例3 :稻瘟病抗性基因Ρ ,2候选基因的分离及载体的构建
为了分离出Α>^ ，根据已经获得的序列，通过引物设计软件设计候选基因的特异性引物，通过高保真KOD酶(Τ0Υ0Β0)用PCR方法将候选基因分离出来；PCR扩增产物经纯化后连接到PCAMBIA1305. I和pCUbil390载体上，并转入大肠杆菌TranslO (TransGen Biotech)中保存。连接产物经酶切验证的阳性质粒送往北京博迈德科技发展有限公司测序 (Biomed)。一、PCR 扩增
根据已经获得的序列，通过引物设计软件设计候选基因的特异性引物，其中引物序列分别为
1305F: CCATGATTACGAArrCTTTCATTAGGTGCACCCACCCACAAG (SEQ ID NO. 3)
1305R: TACCGAGCTCGAATTaQkkQkTQQQCQkTQQQkQTCkTQT (SEQ ID NO. 4)
1390F: TTACTTCTGCACTAGGTACCQTQTTkTKCkkTQQCQQkQQTQQTQCTk (SEQ ID NO. 5) 1390R: TCCGTCGACCTGCAGGTACCkkQCkCkmCkTCTQkmCCTTCCkQCQ (SEQ ID NO. 6) 通过高保真KOD酶用PCR方法以抗病亲本YMG的DNA为模板，利用引物1390F (SEQ ID NO. 5)和 1390R (SEQ ID NO. 6)扩增/ 泛的编码区片段 3867bp，利用 1305F (SEQ ID 勵.3)和 13051 (SEQ ID NO. 4)扩增/ 泛的全长基因组片段 7006bp (SEQ ID NO. I) oPCR 反应体系如下2X PCR Buffer for KOD FX 25μ 1,10μ I dNTPs (2mM each), 2μ1 弓丨物 (lOpmol, F+R), I μ I KOD FX 酶(lU/μΙ, Τ0Υ0Β0),2μ I DNA 模板(IOOng/μ I )，加 ddH20 至5(^1。扩增反应条件941 2 min ；98°C 10 s — 60°C 30s — 68°C 10 min，35 个循环； 68°C 5 min，16°C保存。二、PCR产物及质粒回收与纯化
PCR产物在I. 5%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为I X TAE,当电泳指示剂溴酚蓝迁移至可以分离DNA片段时(160V, 20min),关闭电源。在凝胶图像分析仪上记录结果，电泳图如图2所示。在紫外灯下切下目的条带，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生物技术公司) 回收，利用试剂盒(北京博迈德科技发展有限公司)提取质粒，用及酶切pCAMBIA1305. I 载体，用KpnI酶切pCUbil390载体后回收备用。三、候选基因的连接转化利用 Clonetech In-fusion PCR Cloning system (TaKaRa)对纯化后的的全长基因组片段(7006bp)和编码区片段(3867bp，详见SEQ ID NO. I中第1598位至5464位) 分别重组到PCAMBIA1305. I载体的酶切位点，和pCUbil390载体的命酶切位点， 并转化大肠杆菌TranslO (TransGen Biotech)中。载体示意图如图3和图4所示。重组反应程序
线性质粒(100-200 ng/μ I)3 μ I
纯化的 PCR 产物(100-200 ng/μ I)I μ I
5 X in-fusion HD Enzyme PremixI μ I
反应程序50。C 60 min，4° C 30min 四、酶切验证与测序
转化后的阳性克隆质粒分别经限制性内切酶&0似或酶切验证后，连接上的阳性质粒送往北京博迈德科技发展有限公司测序(Biomed)。实施例4 :稻瘟病抗性基因Pi,2的遗传互补试验及转化体的抗性鉴定
将经测序验证的阳性克隆质粒，即含泛全长基因组的互补载体PCAMBIA1305. I和含编码区的过表达载体pCUbi 1390，通过电击分别导入农杆菌菌株EHA105中，并转化感病水稻品种 Fujisaka5。利用潮霉素标记 HygF (GGAGCATATACGCCCGGAGT, SEQ ID NO. 7) 和HygR (CTGCCCGCTGTCTAC AACC, SEQ ID NO. 8)检测转互补载体和过表达载体的Ttl代，筛选出转基因阳性植株并插植。在水稻分蘖盛期，利用稻瘟病鉴别菌株进行注射接种鉴定，结果发现在33个转互补载体的Ttl代植株中，有29株表现抗病反应，4株表现感病反应；在48 个转过表达载体的Ttl代植株中，有21株表现抗性抗病反应，27个表现感病反应(表I)。对 T1株系进行喷雾接种鉴定，发现所有由感病Ttl单株衍生的T1株系都表现纯合感病，而由抗病Ttl单株衍生的T1株系表现抗病或抗感分离(表I)。这些结果表明，泛转基因可以互补对供试稻瘟病株的抗性。图5和图6给出部分T1代植株叶片病斑图，其中，水稻稻瘟病抗性测定按0-5级分级0-3级为抗病R，4-5为感病S。以上结果也说明，/ 泛转基因是可以稳定遗传的，可以直接利用Pi,2基因转化水稻感病品种，获得含有该基因的抗稻瘟病水稻新种质，也可以利用有性杂交转移抗性转化体中的基因来改良其他粳稻水稻品种，还可以利用有性杂交将该基因直接应用于水稻育种。 表I基因的遗传互补试验分析结果
权利要求
1.一种水稻稻瘟病抗性基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.权利要求I所述的基因的cDNA。
3.权利要求I所述的基因编码的蛋白质，其特征是其氨基酸序列如SEQID NO. 2所/Jn ο
4.含有权利要求I所述的基因或权利要求2所述的cDNA的表达盒。
5.含有权利要求I所述的基因或权利要求2所述的cDNA的表达载体。
6.一种制备抗稻瘟病的转基因水稻的方法，其特征在于，利用权利要求I所述基因或权利要求2所述的cDNA转化水稻，在转基因植株中选择出抗性增强的植株。
7.获得权利要求I所述的基因的引物对，其正向引物如SEQID NO. 3所示，反向引物如 SEQ ID NO. 4 所示。
全文摘要
本发明公开了一种水稻稻瘟病抗性基因Piym2及其应用，提供了所述的水稻抗稻瘟病基因Piym2的核苷酸序列及其编码的蛋白质氨基酸序列，该基因属于CC-NBS-LRR抗性基因家族的成员。本发明还提供了用于扩增水稻抗稻瘟病基因Piym2的引物，以及该基因在转化水稻或其他植物培育抗病品种方面的应用。将本发明所述基因转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用杂交和转化方法在植物中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中连锁累赘问题，并且可以缩短育种时间，提高品种选育效率。
文档编号C12N15/54GK102604974SQ20121007381
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月20日 优先权日2012年3月20日
发明者万建民, 张欣, 王久林, 程治军, 许兴涛, 郭秀平, 雷财林, 马建 申请人:中国农业科学院作物科学研究所