专利名称：烟粉虱抗真菌肽defensin基因及其所编码的抗菌肽与制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种烟粉虱抗菌肽defensin基因及其所编码的抗菌肽与应用。尤其涉及一种重组烟粉虱抗菌肽defensin的纯化制备方法、重组烟粉虱抗菌肽及其抑菌应用。
背景技术：
近年来,烟粉風Bemisia tabaci (Gennadius)已成为一种世界性的入侵性灾害性昆虫，在世界各地暴发成灾，造成惨重的损失例。该虫不仅大量取食植物汁液，导致植物枯萎，而且传播多种植物病毒，尤其是双生病毒，常导致植物病毒病大流行，使作物严重减产或绝收。由于烟粉虱寄主范围广，繁殖力强，危害方式多，对杀虫剂产生抗药性的能力特别强，因此，当其入侵到一个新的地区，极易暴发成灾。由于传统抗菌素的滥用和耐药菌株的不断产生，严重影响了感染性疾病的临床治疗效果。而抗菌肽具有杀菌强，不易引起耐药性等优点，成为抗菌药物新的研究热点。目前抗菌肽产量低，天然抗菌肽的分离难度大，因而倾向于利用基因工程方法获得抗菌肽。防御素(defensin)是近年来发现的广泛存在于动植物体内的一类阳离子抗菌多肽，由29 54个氨基酸残基组成，含有6 8个保守的半胱氨酸(通常是6个)，分子量小于5KDa。N端有3个β转角和I个Y转角，中间有I个两亲性的α螺旋，C端有I个反向平行的β折叠，由3 4个二硫键连接α螺旋和β转角，形成特定的CSa β结构。防御素可在特定的细胞中合成并贮存于细胞质的颗粒中，或被病原微生物诱导合成，对多种微生物均具有较强的防御能力，主要作用于病原微生物的细胞膜，使病原微生物不易对其产生抗性，防御素是目前颇具吸引力的一类新型候选抗菌药物。到目前为止，国内外尚没有烟粉虱defensin抗菌肽的研究报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对目前烟粉虱抗菌肽研究状况及其不足，提供一种重组烟粉虱抗菌肽defensin基因和其所编码的抗菌多肽，以及所述基因在基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中的应用。本发明的解决方案是，提供了一种烟粉虱defensin抗菌肽基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。本发明还提供了所述烟粉虱defensin抗菌肽基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中的应用。本发明还提供了所述烟粉虱defensin抗菌肽基因制备具有抗菌活性的重组蛋白的方法，是通过基因重组技术将所述基因在大肠杆菌中进行表达，获得具有抗菌活性的重组蛋白。本发明还提供了所述烟粉虱defensin抗菌肽基因编码的抗菌肽，该抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
本发明还提供了所述抗菌肽在制备用于防治烟粉虱的药物中的应用，该药物适用的烟粉風品种为:隐种 Middle East-Asia Minor I(MEAMl)Ji^1I1Mediterranean(Med)Jil 种ZHJl、隐种ZHJ2或隐种ZHJ3。相对于现有技术，本发明的有益效果在于I、本发明中的烟粉虱defensin抗菌肽基因原核表达过程中，表达载体中引入蛋白酶Xa因子，能够有效的酶切重组融合蛋白，并根据蛋白分子大小利用超滤方式快速分离得到defensin多肽。整个过程快速简单。2、本发明中的重组烟粉虱defensin抗菌肽具有抗真菌活性，能明显抑制球孢白僵菌(Beuaveria bassiana)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)和灰霉菌 (Botrytis cinerea)等昆虫病原真菌生长。
图I :不同隐种烟粉虱抗菌肽defensin基因PCR扩增产物电泳图。在图I中，M为 DNA maker, 1-5 分别为烟粉虱 MEAMl、Med、ZHJl、ZHJ2 和 ZHJ3 抗菌肽 defensin 基因 PCR 扩增产物，bp代表碱基对。图2 :烟粉虱抗菌肽基因和大肠杆菌表达载体质粒pET_32a及defensin成熟肽基因PCR产物酶切图。在图2中，M为DNA maker, I为质粒pET_32a经BamH I和Xho I双酶切后产物，2和3为defensin成熟肽基因PCR产物经BamH I和Xho I双酶切后产物。图3 :烟粉風抗菌肽defensin成熟肽片段融合表达载体pET32a_Def的构建示意图。图4 =IPTG诱导的pET32a-Def-BL21和纯化的重组烟粉虱抗菌肽蛋白的SDS-PAGE 凝胶电泳图。M为蛋白maker，1-6代表不同IPTG诱导浓度0mM、0. 2mM、0. 4mM、0. 6mM、0. 8mM、 ImM，7代表纯化后重组蛋白Trx-Def，kDa代表蛋白分子量。图5 :重组烟粉風抗菌肽defensin Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳图。M为蛋白 maker, I 为 defensin 蛋白产物。
具体实施方案本发明从烟粉虱抗菌肽defensin基因着手，对其进行可性质、基因表达和定位及重组表达等方面的研究，获得了专性抗真菌活性的重组防御素defensin。本发明所述烟粉虱抗菌肽defensin基因，其核苷酸序如SEQ ID NO. I所示。序列特征长度624碱基对；类型核酸；链型双链；拓扑结构线性；分子类型cDNA。本发明所述烟粉虱defensin抗菌肽基因编码的抗菌肽，其氨基酸如SEQ ID NO. 2 所示。序列特征长度76氨基酸；类型氨基酸；链型单链；拓扑结构线性；分子类型 蛋白质。本发明所述烟粉虱抗菌肽基因cDNA的克隆方法是以烟粉虱总RNA反转录得到 cDNA为模板，构建cDNA文库，构建抗菌肽数据库，与烟粉虱转录组本地Blast筛选得到 defensin部分cDNA序列，然后经RACE方法扩增得到末端序列，最后经序列拼接获得烟粉虱抗菌肽defensin基因cDNA全长序列。本发明用于表达烟粉虱抗菌肽重组蛋白的抗菌肽成熟肽基因序列是以烟粉虱抗菌肽基因全长基因双链DNA为模板，经PCR方法扩增而得到，它来源于烟粉虱抗菌肽全长基因区域所对应的基因片段。本发明所述的表达载体构建方法是按常规方法，将通过PCR方法合成的烟粉虱抗菌肽基因经酶切和分离纯化后，连接到同样酶切纯化后的具有相应酶切位点(即BamH I和 Xho I)之间，即构建成所需的含有烟粉虱抗菌肽基因的表达载体。本发明上述含有烟粉虱抗菌肽基因的大肠杆菌基因表达载体优先由本发明合成的烟粉虱抗菌肽基因与大肠杆菌表达载体pET_32a构建的重组表达载体，命名为 pET32a~Defο本发明能表达烟粉虱抗菌肽基因的大肠杆菌重组菌株优先由含有烟粉虱抗菌肽的表达载体pET32a-Def转化大肠杆菌BL21(DE3)而得到的菌株，命名为pET32a_Def-BL21。上述烟粉虱抗菌肽基因的具体制备方法是通过如下技术方案来实现选取大肠杆菌重组菌株pET32a-Def-BL21接种在IOml含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37°C培养过夜，取50 μ I菌液加入到装有50ml AMP+LB液体培养基的150ml无菌三角瓶中，37°C，150rpm 的摇箱中培养6 8h至对数期，加入IOOmM IPTG至终浓度为ImM，27°C，250rpm振荡培养。 当重组菌生长进入平台期后收集菌体，经分离纯化得到重组烟粉虱抗菌肽产品。上述酶切后非融合抗菌肽纯品,利用添加Factor Xa序列,使用Factor Xa酶切上述纯化重组烟粉虱抗菌肽蛋白，并再次纯化，得到约5kDa左右烟粉虱抗菌肽defensin肽片段。本发明利用上述得到抗菌肽进行抗菌活性检测，结果表明经过酶切纯化后的烟粉風defensin抗菌肽具有抗昆虫病原真菌活性。本发明所述烟粉虱抗菌肽基因defensin在制备具有抗菌肽活性的重组蛋白中应用。其中，所述应用的方法是通过基因重组技术使所述基因在大肠杆菌中进行表达， 获得具有抗菌活性的重组蛋白。例如将获得的烟粉虱抗菌肽基因defensin基因克隆到pET_32a (Novagen公司) 表达载体，转化到大肠杆菌BL21细胞。进行诱导表达，获得具有活性的重组蛋白(即烟粉虱抗菌肽基因defensin基因编码的抗菌肽)。所述抗菌活性的重组蛋白纯化后进行抑菌实验的结果表明重组的烟粉虱抗菌肽基因defensin基因表达的多肽具有抗真菌和酵母的活性。进一步的，利用本发明的方法通过现有基因工程方法生产还可用于烟粉虱生物防治。下面结合实验室具体的实验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方案，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Haebor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。实施案例I :烟粉虱defensin抗菌肽cDNA克隆I. I、TRIzol 法提取总 RNA
(I)将一定量(200只左右烟粉虱)冰冻lmin，放入I. 5ml离心管中，加入Iml TRIzol试剂，充分研磨匀浆，室温静置5min。(2)向离心管中加入O. 2ml氯仿，振荡15s，混合液转入TIANGEN离心管中，静置 2min。(3)4°C，12000g离心15min，取上清液，将其转入一新I. 5ml的离心管中。(4)向离心管中加入O. 5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置lOmin。(5) 4°C, 12000g 离心 IOmin,弃掉上清液。(6)向离心管中加入Iml 75 %乙醇，轻轻洗涤沉淀，4°C，7500g离心5min，弃掉上清液。(此时加入无水乙醇，可于_80°C超低温冰箱中长期保存)(7)晾干离心管，加入适量的DEPC H2O溶解(65°C促溶)，分光光度计测量0D260/ 0D280的值，比值在I. 8 2. O之间时，进行下一步实验。1.2、cDNA 第一链合成(I)往O. 5ml无菌的离心管中分别加入I μ I提取的RNA, I μ I SMART IV/5’ PCR 正向引物，1μ I CDS 111/3’PCR反向引物，加2μ I DEPC H2O使总体积达到5 μ I。 (DTT) 心。
(2)混匀离心管中的试剂并短暂离心，72°C孵育2min。
(3)迅速将离心管冰浴2min，短暂离心。
(4)往离心管中分别加入2μI 5XFrist-strand Buffer, I μ I 20mM 二硫苏糖醇 I μ I IOmM dNTP, I μ I Reverse Transcriptase反转录酶，反复吹打混勻，短暂离
(5)42°C孵育 Ih。
(6)将离心管置于冰上2 3min，终止反应。取一部分用于进一步实验，其余于-80°C超低温冰箱冷冻保存。1.3、dsDNA 合成(I)往O. 5离心管中分别加入I μ I第一链合成反应产物，5 μ I IOXLA Buffer (Mg2+free)，5 μ I Mg2+，8 μ I dNTP, I μ I SMART IV/5，PCR 正向弓I 物，I μ ICDS 111/3’PCR反向引物，O. 5μ I LA Tag DNA聚合酶，29. 5 μ I ddH20，充分混匀，短暂离心。(2)PCR仪中按以下扩增程序(95°C, 20s ;25 28X (95。。，5s ；68°C,6min))扩增。(3)取5μ1 PCR产物用于凝胶检测(检测条带所含分子量范围及条带亮暗)，取检测结果良好的I μ I产物稀释100倍用于做以后PCR的模板，其余于_80°C超低温冰箱冷冻保存。I. 4、PCR扩增烟粉虱抗菌肽defensin基因5’和3’末端操作按Clontech 公司试剂盒 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 说明书进行。根据试剂盒的要求，依据已知的Defensin基因EST序列分别设计两条上、下游引物 (见表1)，以进行巢式PCR。第一次PCR反应条件为98°C，3min ；30X (98°C，10s ；60°C, 20s ；68°C,lmin) ;68°C，6min。第二次PCR以第一次PCR产物为模板进行扩增，反应条件为 95°C，3min ；35X (95。。，25s ；63°C,20s ；72°C, lmin) ;72°C，6min。将扩增产物连接到pMD-19 载体上得到重组质粒，并用PMD-19的通用引物M13土进行序列测定，测定结果与已知序列片段进行比较和序列拼接。序列拼接结果在NCBI上进行BlastX，结果表明得到序列与大蜡螟Galleria mellonella和烟草天蛾Manduca sexta抗菌妝defensin基因高度相似，相似度分别为75%和74%。表I. PCR扩增烟粉虱抗菌肽defensin基因5’和3’末端所需引物
引物名称引物序列(5’ -3’ )def-for IGTTGGTGCGAAACCCGTAAATAAGATdef-for 2GGAGTGAACTACACCTCTGACTGCTTGAAdef-rev ITGAACTACACCTCTGACTGCTTGAAAGAdef-rev 2TAAAGGCGGACATTGTGGAAGTGC实施例2 :烟粉虱抗菌肽重组表达载体构建、表达与抑菌功能测定2. I表达载体构建(I)根据烟粉風defensin抗菌肽的序列和表达载体pET_32a (Novagen公司)的克隆位点，设计引物，并基因的5’ -端设计了 Xa因子的识别切割位点(IEGR)编码序列Def-F CGGGATCCATTGAGGGTCGCGACGTCCTCATCGGAAGTT (下划线为 BamH I 位点，粗体为Xa因子编码序列);Def-R CCGCTCGAGTTATTTACGGGTTTCGCACCAAC (下划线为 XhoI 位点)。(2)基因扩增、克隆与重组质粒筛选以烟粉虱dsDNA为模板，用上述引物进行PCR反应，扩增条件为94°C，2min预变性；94°C，15s，63°C，30s，72°C，45s，35 个循环；72°C延伸 6min。取2 μ IPCR产物，I %的琼脂糖凝胶电泳检测后，Clean UP试剂盒清洁回收PCR产物。分别以PET-32a质粒载体和上述回收的DNA作为DNA模板，配制以下反应体系Xho I 限制性内切酶I μ 1，BamH I限制性内切酶，DNA模板10 μ 1，ddH20 6 μ 1，Buffer 2 μ I。轻轻混匀，短暂离心，37°C孵育Ih。(3)用第二步的双酶切反应产物做琼脂糖凝胶电泳，切下大小合适的DNA条带做 DNA凝胶回收。(4)向PCR管中分别加入2. 5 μ I双酶切后的PCR产物，O. 5 μ I双酶切后的pET_32a 质粒载体，O. 5 μ I 的 T4Ligase DNA, I μ I 的 T4Ligase DNA Buffer, 5 μ I 的 ddH20，16°C条件下孵育，连接Ih以上。(5)将连接产物转化到感受态中，涂布于氨苄青霉素的LB培养基平板上，37°C培养过夜。挑斑培养菌液，以T7ter和S-Tag通用引物进行r_Tag反应体系PCR检测，对于阳性样品每份取100 μ I留种并送测。(6)比对测序结果，选取结果正确的留种菌液做下一步实验。2. 2重组烟粉風defensin抗菌肽表达与纯化选取测序阳性菌液在含50 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中37°C过夜振荡培养，次日，以I %的接种量连接到含150 μ g/mL氨苄青霉素的液体培养基中，待菌体生长至对数期，0D600约I. O时，加入IOOmM IPTG使其终浓度约为lmM，27°C /250rpm诱导5h后， 测0D600取样，5000rpm离心5min，PBS缓冲液(pH7. O)重悬浮菌体并加入适量上样缓冲液，并用于12% SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况，融合蛋白Trx-Def以可溶性的形式成功表达，最后利用Clontech His-tag重力纯化试剂盒纯化得到烟粉風defensin抗菌肽重组蛋白。纯化的烟粉風defensin重组蛋白经15%的SDS-PAGE凝胶电泳分析，Trx-Def融合的重组蛋白显示约25kDa大小，与预期大小一致。2. 3重组蛋白Xa因子蛋白酶切A280测定纯化后蛋白浓度，50 μ L体系中融合蛋白浓度(O. 2 μ g/μ L)，按下述体系切割，Xa因子剂量为2U，于23°C反应24h。酶切产物首先利用截留分子量为IOkDa的超滤管(Millipore, Amicon Ultra-4)去掉Trx标签及Xa因子等大于IOkDa蛋白分子,然后用截留分子量为3kDa的超滤管对其进行脱盐及浓缩，采用16% Tricine-SDS-PAGE分析。切割体系如下
Fusion proteinI Opg
IOX Buffer5μL
Factor Xa2 μL
ddH20补加到50μ 2. 5抗菌活性检测培养基为YDP培养基，供试菌株有革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、昆虫病原真菌和酵母。其中革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus);革兰氏阴性菌为肠道沙门氏菌(Salmonella enteritidis)和大肠杆菌(Escherichia coli);昆虫病原真菌为球抱白僵菌(Beuaveria bassiana)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae);植物病原真菌灰霉菌(Botrytis cinerea)酵母为毕赤酵母(pichia pastoris)。按液体生长抑制试验进行本抗菌试验，具体步骤为供试菌株在培养基(细菌培养基为LB培养基，真菌和酵母培养基为YDP培养基)中生长到0D600为O. 8后，用YDP培养基稀释到0D600为 O. 001左右，80 μ L菌体培养物中加入20 μ L不同浓度的上述酶切蛋白产物。在37°C培养 24小时，测定混合培养物0D600值，确定抗菌活性，每个试验重复3次。对照组分别为融合蛋白Trx、Xa因子切割Oh切割液、氨节青霉素。通过生长抑制试验，结果显示defensin 具有显著地抗真菌和酵母的能力。烟粉風defensin抗菌肽的抗菌活性结果如表2所示表权利要求
1.一种烟粉虱defensin抗菌肽基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.权利要求I所述烟粉虱defensin抗菌肽基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中的应用。
3.利用权利要求I所述烟粉虱defensin抗菌肽基因制备具有抗菌活性的重组蛋白的方法，其特征在于，是通过基因重组技术将所述基因在大肠杆菌中进行表达，获得具有抗菌活性的重组蛋白。
4.权利要求I所述烟粉虱defensin抗菌肽基因编码的抗菌肽，其特征在于，该抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
5.权利要求4所述抗菌肽在制备用于防治烟粉虱的药物中的应用，该药物适用的烟粉風品种为:隐种 Middle East-Asia Minor I、隐种 Mediterranean、隐种 ZHJl、隐种 ZHJ2 或隐种ZHJ3。
全文摘要
本发明涉及抗菌肽及应用，旨在提供烟粉虱抗真菌肽defensin基因及其所编码的抗菌肽与制备。该抗菌肽基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明在表达载体中引入蛋白酶Xa因子，能够有效的酶切重组融合蛋白，并根据蛋白分子大小利用超滤方式快速分离得到defensin多肽。整个过程快速简单。所得抗菌肽具有抗真菌活性，能明显抑制球孢白僵菌、金龟子绿僵菌和灰霉菌等昆虫病原真菌生长。
文档编号C12N15/12GK102586262SQ20121007327
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月19日 优先权日2012年3月19日
发明者时敏, 王知知, 陈学新 申请人:浙江大学