启动子及其用途的制作方法

专利名称：启动子及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程领域。具体地，本发明涉及启动子及其用途。更具体地，本发明涉及启动子、表达盒、表达载体、制备转基因植物或其衍生物的方法、启动子的用途、用于扩增启动子的引物对。
背景技术：
自上世纪八十年代首次获得转基因植物以来，植物基因工程技术在解决人类所面临的粮食、能源和环境危机等方面发挥了很大的作用并显示了良好的前景，但在其发展过程中也不可避免的遇到了一些问题，例如利用组成型强启动子结合功能基因来改良作物品质时，往往会由于目的基因表达的时间(发育阶段特异性)或空间(组织器官特异性)不能很好地控制而导致改良效果不明显，或者由于这些组成型启动子诱导基因表达量太高而对植物的生长发育造成影响。另外，在多基因转化时如果重复使用同一个启动子，也会由于启动子序列的高同源性可能导致基因沉默。组织特异性启动子有时也称为器官特异性启动子，在这类启动子的驱动下，基因的表达只限于某些特定的器官或组织部位，并表现发育调节的特性。组织特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，增加区域表达量，同时也可以避免植物营养的不必要浪费。随着植物基因工程技术的发展，这一特性必然使组织特异性启动子作为一种重要的顺式作用元件在生物反应器、选育抗虫、抗病、抗旱、抗高渗胁迫等抗逆特性的转基因植物优良品种等领域得到更加广泛的应用。维管束是维管植物(蕨类植物、裸子植物和被子植物)的叶和幼茎等器官中，由初生木质部和初生韧皮部共同组成的束状结构。其中初生木质部包括管状分子(导管分子或管胞)、薄壁组织细胞和纤维；初生韧皮部包括筛分子(筛管分子或筛胞)、伴胞(被子植物特有)、薄壁组织细胞和厚壁组织细胞。维管束彼此交织连接，构成初生植物体输导水分、无机盐及有机物质的一种输导系统——维管系统，并兼有支持植物体的作用。然而，目前已经鉴定的维管束特异启动子较少，仍有待进一步研究。

发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。本发明是基于发明人的下列发现而完成的发明人发现JMJ18启动子能够驱动报告基因(GUS、GFP或RFP)在转基因植物的维管束伴胞细胞中特异表达，从而可以为伴胞细胞的功能研究、抗维管束病害和开花时间调控的植物基因工程提供更佳的启动元件。在本发明的一个方面，本发明提出了一种分离的启动子。根据本发明的实施例，该启动子包含如下所示的核苷酸序列(SEQ ID NO :1)，或者包含下列核苷酸序列的互补序列acaagacaga agaagcagga aacaagaaga ttcgtctcta atcgattgaa agtacaacac 60aagacttgat taaaagtacc acaaatttgc atctttcttt tgttttacac attttgtttc 120、
ttttagtttt cctcagttga tcaaactctc atgtggagat gtttttgtcg tgatttattt 180tatttctaat aagattcaag aaccttattt ttattctaca atttgacttc tctgtacttt 240ctgatctatc tcaaaagtat agctacaaaa aataataaat actaaattac ggggacgaaa 300taatgaaact ttcatctcca tttcctttaa aacgacgcgt tttggataaa aaaacgaaac 360ggtcaaactc tttacttttc cgacgcggag agaaacctaa aaccaaagac gacgttcgac 420gaacgatcac ggaagaacaa caaatggcat agaaccgtaa aataaacaga aagctgaggg 480taattcagta ttttccgcat aaatattaga tcatcgtacg gtacggtgtg gtgatcaaac 540gctgatccgt taaaaactct tgagagtgcg ttttctttgg cgggtgttct ctaacttcct 600cgtttctcca gattctttac ttcaaatcac tctcttgtct tttctctgtc tcaatctctt 660atttttaaat attcacatac ttcaattttc atggttttta ttttttttat ctaaaattat 720ataatatttg atagaaaaaa aaagaagatt cgtataacat catcagagat aatctcaaat 780acacttcttc ttcttctcga aatctcagcc gttcgtttgt ggtaatctcc ttctcgactt 840ttcctttttt tttttaaacc tcttttgtaa ttttgtagta aataatattt ttaagttcct 900tatcgtggtt aagttcggtt tgttttgttt tataatgtgt tccttcttat tcgtcgttac 960tactaggtca attaaatctc tttcttaaat tttcccagat ttgggtattt ctaactttaa 1020ctgcgaattc aattcttata gcattaattg ggccaaaaca aaagaaccaa aaaactttca 1080agctttttct cctttgatag gtaaaaaaag attgattttc atgaatttaa atatctgtga 1140tttttgatgt tcttgttatt gttcctctgt ttgtgaattc aattagggtt aggaactttt 1200ttttttttta acttctcttt attttgatat atcgatattt gtttttgttg ataacatcgt 1260tttcttatct tttttttttt tctcagtttc attggctctc aatcgaagaa aacttttagc 1320ttacaaaatc tgctttgagt agtattgatt tttcaattca t 1361该启动子的长度为1361bp，因而，在本发明中，具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的启动子，有时也称为JMJlS1.3kb。根据本发明的实施例，该启动子还可以具有额外的核苷酸序列，例如，根据本发明的实施例，本发明提出了一种启动子，该启动子具有如下列所示的核苷酸序列(SEQ ID NO2)，或者包含下列核苷酸序列的互补序列tgcgagttct tctttcaatg tgagtaaatg ttaaatctta tctctctctt tctcttaaaa 60tgtactagct actttcttta taataataaa gtgcttttac ccctttttgc agcaaaagcc 120tgagatcatt gtagttgaat accctgatga ttctgtagct gaaactgtaa gattatatac 180aattcttttg ccttttgagg tgcttgtaat tgattcttga aacgtttttt gaaacattgt 240gctttttggt tgtgttttgt taggtgagaa tggttgcaac aaagagagta gtagaagtag 300aacaagacaa gacagaagaa gcaggaaaca agaagattcg tctctaatcg attgaaagta 360caacacaaga cttgattaaa agtaccacaa atttgcatct ttcttttgtt ttacacattt 420tgtttctttt agttttcctc agttgatcaa actctcatgt ggagatgttt ttgtcgtgat 480ttattttatt tctaataaga ttcaagaacc ttatttttat tctacaattt gacttctctg 540tactttctga tctatctcaa aagtatagct acaaaaaata ataaatacta aattacgggg 600acgaaataat gaaactttca tctccatttc ctttaaaacg acgcgttttg gataaaaaaa 660cgaaacggtc aaactcttta cttttccgac gcggagagaa acctaaaacc aaagacgacg 720
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3。拟南芥的AtSUC2启动子可以驱动⑶S在拟南芥的韧皮部中特异性表达(Truernit etal.，1995)，免疫组化分析表明AtSUC2蛋白特异性的存在于伴胞细胞中(Stadler et al.，1996)，因此，AtSUC2启动子是一个伴胞细胞特异表达的启动子。拟南芥转运蛋白Sultrl ；3启动子驱动GFP在转基因拟南芥的子叶和根的伴胞细胞特异表达(Naoko et al.， 驳病毒(CoYMV)启动子驱动GUS报告基因在转基因烟草根、茎和叶的伴胞细胞中特异表达(Matsuda et al. ,2002)。由此，通过将根据本发明实施例的启动子与外源基因(目的基因)相连，以便实现在植物维管束组织伴胞中特异性表达外源基因(目的基因)，从而为植物赋予期望的性能。可以采用的目的基因的实例包括但不限于抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗除草剂、抗虫、抗逆以及产量、品质和开花相关基因的至少一种。根据本发明的实施例，可以采用的外源基因(目的)基因可以为选自雪花莲凝集素(GNA)基因、马铃薯卷叶病病毒(PLRV)外壳蛋白基因、马铃薯卷叶病病毒(PLRV)复制酶基因、FLC基因、FT基因(MdFTl)的至少一种。关于这些基因的详细描述，可以参见例如下列文献，通过参照将其并入本文Rao KV, Rathore KS,Hodges TK,et al. , Expression of snowdrop lectin (GNA)in transgenic rice plants confers resistance to rice brown planthopper. Plant J,1998,15 :469，在该文献中，Rao等利用韧皮部特异性启动子(来自水稻蔗糖合成酶RSsl基因)驱动雪花莲凝集素(GNA)基因在水稻韧皮部内特异性表达，与35S启动子相比，具有更佳的抗水稻褐飞虱效果；Yuan Z, Zhao C, Zhou Y, Tian Y Aphid-resistant transgenic tobacco plantsexpressiong modified gna gene. Acta Botanica Sinica,2001,43 :592,在该文献中，Yuan等采用韧皮部特异性启动子CoYMV驱动雪花莲凝集素(GNA)基因在烟草韧皮部内特异性表达，获得较35S启动子更佳的抗蚜虫效果；Michael WG, Stuart C, Peter MW. Expression patterns of vascular-specificpromoters RolC and Sh in transgenic potatoes and their use in engineeringPLRV-resistant plants. Plant Mol. Biol. ,1997,33 :729,在该文献中，Michael 等米用维管束特异性启动子RolC驱动马铃薯卷叶病病毒(PLRV)外壳蛋白基因在马铃薯维管束中的特异性表达，获得了抗马铃薯卷叶病的转基因株系；Ehrenfeld N, Romano E, Serrano C, Arce-Johnson P. Replicase mediatedresistance against potato leafroll virus in potato Desir ee plants. Biol Res.,2004,37 :71，在该文献中，Nicole等利用维管束特异性启动子RolA驱动马铃薯卷叶病病毒(PLRV)复制酶基因在马铃薯维管束中的特异性表达，获得了较35S启动子更佳的抗马铃薯卷叶病效果；
Iain S,Yuehui H,Franziska T,et al. The transcription factor FLC confersa flowering response to vernalization by repressing meristem competence andsystemic signaling in Arabidopsis. Genes Dev. , 2006, 20 :898,在该文献中，Iain 等利用伴胞特异性启动子SUC2或韧皮部特异性启动子RolC驱动FLC基因在拟南芥中的特异性表达导致开花时间的延迟；Trankner C, Lehmann S, Hoenicka H, et al. , Over-expression of anFT-homologous gene of apple induces early flowering in annual and perennialplants. Planta，2010，232 :1309，在该文献中，Trankner等利用伴胞特异性启动子SUC2驱动苹果中的FT基因(MdFTl)在拟南芥以及重要的经济树种杨树和苹果树中的特异性表达，导致了开花时间的明显提前。进而,在本发明的第二方面,本发明提出了一种表达盒(expression cassette)。根据本发明的实施例，该表达盒包含前面所述的启动子以及目的基因，其中目的基因与启动子可操作地连接。由此，利用该表达盒，能够有效地在植物维管束组织伴胞中特异性表达外源基因(目的基因)。在本发明中所使用的术语“连接”应做广义理解，可以是直接相连，也可以是通过媒介间接相连。在本发明中所使用的术语“可操作地连接”是指这样的一种连接方式，其能够使得连接在一起的两个元件能够发挥其正常的功能，例如启动子能够驱动目的基因按照其阅读框进行表达。根据本发明的实施例，启动子和目的基因的连接方式并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，目的基因位于启动子的3’侧。由此，可以进一步提闻目的基因的表达效率。根据本发明的实施例，表达盒中所包含的目的基因的类型并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，目的基因可以为选自抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗除草剂、抗虫、抗逆以及产量、品质和开花相关基因的至少一种。由此，可以为植物赋予期望的性能。根据本发明的实施例，可以采用的目的基因可以为选自雪花莲凝集素(GNA)基因、马铃薯卷叶病病毒(PLRV)外壳蛋白基因、马铃薯卷叶病病毒(PLRV)复制酶基因、FLC基因、FT基因(MdFTl)的至少一种。根据本发明的实施例，表达盒中还可以进一步包含额外的核酸序列，以便为表达盒赋予额外的有益效果。根据本发明的具体实例，表达盒中可以进一步包含选自负责组织特异性和时间特异性表达的元件、调控组成型表达的元件和增强子的至少一种。根据本发明的实施例，表达盒中可以进一步包含35s增强子、SV40增强子、Q翻译增强序列等。在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，该表达载体中包括前面所描述的根据本发明实施例的启动子。由此，利用该载体，可以方便地将外源基因引入植物中，从而使得外源基因在本发明实施例的启动子的驱动下，在植物维管束组织伴胞中特异性表达。由此，根据本发明的实施例，上述表达载体进一步包括目的基因，所述目的基因与所述启动子可操作地相连。如前所述，启动子与目的基因的连接方式并不受特别限制。根据本发明的具体实例，目的基因可以位于所述启动子的3’侧。由此，可以进一步提高目的基因的表达效率。另外，根据本发明的进一步实施例，表达载体上还可以进一步包含同源重组序列，以便促进启动子连同目的基因与植物的基因组发生同源重组，例如可以通过将目的基因设置在启动子的3’侧，将同源重组序列分别设置在启动子的5’侧和目的基因的3’侦U。在本文中，术语“5’侧”和“3’侧”分别与“上游”和“下游”可以互换使用。根据本发明的实施例，表达载体中所包含的目的基因的类型并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，目的基因可以为选自抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗除草剂、抗虫、抗逆以及产量、品质和开花相关基因的至少一种。由此，可以为植物赋予期望的性能。根据本发明的实施例，可以采用的目的基因可以为选自雪花莲凝集素(GNA)基因、马铃薯卷叶病病毒(PLRV)外壳蛋白基因、马铃薯卷叶病病毒(PLRV)复制酶基因、FLC基因、FT基因(MdFTl)的至少一种。根据本发明的实施例，表达载体中还可以进一步包含额外的核酸序列，以便为表达盒赋予额外的有益效果。根据本发明的具体实例，表达盒中可以进一步包含选自负责组织特异性和时间特异性表达的元件、调控组成型表达的元件和增强子的至少一种。根据本发明的实施例，表达载体中可以进一步包含35s增强子、SV40增强子、Q翻译增强序列等。根据本发明的实施例，表达载体的类型不受特别限制，只要是能够在植物细胞中表达外源基因即可。可以是质粒、病毒。根据本发明的实施例，可以采用的载体为质粒PCAMBIA2300, pBI121。在本发明的第四方面，本发明还提出了一种制备转基因植物或其衍生物的方法。根据本发明的实施例，该转基因植物中前面所述的根据本发明实施例的表达盒，并且制备该转基因植物或其衍生物的方法包括，在植物的至少一部分中引入前面所述的根据本发明实施例的表达载体。由此，可以有效地使得所得到的植物或其衍生物中，外源基因(目的基因)在根据本发明实施例的启动子的控制下，在植物维管束组织伴胞中特异性表达，进而，可以为植物赋予期望的性质。根据本发明的实施例，可以利用该方法进行转基因处理的植物(也可称为受体植物)的类型并不受特别限制。根据本发明的一些实施例，可以采用的植物为选自蕨类植物、裸子植物和被子植物的至少一种。根据本发明的一些实例，可以采用的植物包括但不限于水稻、小麦、玉米、高粱、大豆、芸苔属、两节荠属、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、拟南芥属、菜豆属、花生、苜蓿、燕麦、油菜籽、大麦、燕麦、黑麦(Rye)、粟、蜀黍、小黑麦、单粒小麦、斯佩尔特小麦(Spelt)、双粒小麦、亚麻、格兰马草(Gramma grass)、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麦草、甘蔗、红莓苔子、番木瓜、香蕉、红花、油棕、香瓜、苹果、黄瓜、石斛、剑兰、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、芸苔、甜菜、咖啡、薯蓣、观赏植物和松类。根据本发明的具体实施例，可以采用的植物为拟南芥。在本发明中所使用的表达方式“转基因植物的衍生物”应做广义理解，其既可以是转基因植物的一部分例如转基因植物的种子、组织或者细胞，也可以是转基因植物的后代或其一部分。由此，根据本发明的具体实例，转基因植物的衍生物为转基因植物的种子、组织或者细胞的至少一部分。根据本发明的实施例，在植物的至少一部分中引入表达载体的方法并不受特别限制。根据本发明的一些实施例，可以采用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法、基因重组病毒感染方法、转座子载体法、电转导法、显微注射法、花粉管通道(pollen tube pathway)、超声介导转化法、碳化硅介导转化法、电穿孔法、激光微束法、聚乙二醇(PEG)法、磷酸钙转化法、DEAE-葡聚糖法。根据本发明的具体实例，可以通过农杆菌介导法，在植物的至少一部分中引入根据本发明实施例的表达载体。由此，可以进一步提高制备转基因植物或其衍生物的效率。根据本发明的实施例，引入表达载体的植物部位的类型并不受特别限制，可以是植物的组织，也可以是植物的细胞。根据本发明的实施例，该方法还可以进一步包括，对引入表达载体的植物的至少一部分进行培养。由此，可以从植物的部分组织或者细胞，得到维管束组织伴胞中特异性表达目的基因的植物，进而为所得到的植物赋予期望的性质。由此，根据本发明的第五方面，本发明提出了根据本发明实施例的启动子的用途，其用于在植物维管束组织伴胞中特异性表 达目的基因。根据本发明的最后一个方面，本发明提出了一种用于扩增根据本发明实施例的启动子的引物对。根据本发明的实施例，该引物对包括第一引物和第二引物，其中第一引物包含如SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列，第二引物包含如SEQ ID NO :5或7所示的核苷酸序列。利用该引物对，能够有效地从拟南芥扩增根据本发明实施例的启动子。在本文中所使用的术语“第一”和“第二”仅仅是用于区别两种引物，而绝不以任何方式明示或者暗示其重要性或者数目的不同，另外第一引物和第二引物也可以进一步包括多种不同的引物。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。


本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中图I是根据本发明的一个实施例的植物表达载体的T-DNA区图谱。其中，LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；P35S表示CaMV35S的启动子；Hygromycin表示潮霉素抗性基因；NPTII表示新霉素磷酸转移酶II基因，T35S是CaMV35S的终止子；OTS表示P -葡萄糖苷酸酶基因；GFP表示绿色荧光蛋白基因；RFP表示红色荧光蛋白基因；Tnos表示胭脂碱合成酶(nos)基因的终止子^JMJlSukb是JMJ18长度为1.3kb的启动子(SEQ ID NO I)；PJMJlSukb是JMJ18长度为1.7kb的启动子(SEQ ID NO 2) ;PAtSUC2是拟南芥SUC2基因的启动子，JMJ18是JMJ18基因的CDS15A-E分别为植物表达载体JMJlS1.3kb:⑶S，JMJlS1Jkb:⑶S，JMJ18L3kbJMJ18-GFP, JMJ18L3kbJMJ18-RFP 和 AtSUC2: JMJ18-GFP 的 T-DNA 区域。图2是根据本发明一个实施例的JMJlSukb:⑶S转基因植物的⑶S染色分析，结果显示91% (22/24)的转基因植物有相似的表达模式。其中，(A) 9天龄的植物；(B) 7天龄植物的根；(C) 24天龄的连座叶；(D)花。图中2A、2C、2D中标尺为1mm，图2B中的标尺为0.1mm。12天龄植物的切片结果分别显示在图2E(顶端)和图2F(根)中，标尺为50iim。7天龄植物的GUS染色显示于图2G (成熟根)和图2H (根尖)中，标尺为50 y m。图3是根据本发明一个实施例的JMJlSukb:⑶S转基因植物的⑶S染色分析。结果表明21个用来做GUS染色的株系都显示相似的表达模式。其中，(A)用来做GUS的两个启动子的区域示意图。黑色实心框表示外显子，黑线表示内含子，灰线表示基因间序列；(B) 7天龄的子叶，标尺为Imm ； (C) 20天龄植物的连座叶，标尺为Imm ； (D) 10天龄植物的根，标尺为0. 5cm ; (E)-(J)为(D)图中标出的不同区域,标尺为0. 1mm。图4是根据本发明一个实施例的JMJ18H: JMJ18-GFP转基因植物的GFP荧光观察。显示了 7天龄幼苗的(A)成熟根、(B)根尖、(C)下胚轴和子叶的连接部分、(D)下胚轴和(E)花瓣。标尺分别为 50iim、50iim、100iim、50iim 和 20 u m0图5是根据本发明一个实施例的用共定位的方法证明JMJ18启动子的伴胞细胞特异性。其中，用7天龄的幼苗，观察JMjlSukb = JMJlS-GFP(A)、SUC2:JMJ18-GFP(B)转基因植物根中的GFP荧光，标尺都是50 u m。JMJ18L3kbJMJ18-RFP和SUC2: JMJ18-GFP的双转基因植物显示JMJ18伴胞特异性的表达，(C)GFP荧光、(D)RFP荧光、(E)可见光、(F)拼合的图，标尺为25 u m。
具体实施例方式下面通过具体实施方式
，结合附图对本发明做进一步详细描述，但不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海英骏生物技术公司合成,测序由北京三博远志生物技术有限责任公司完成，PCR试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶购自宝生物工程有限公司，pEASY-Blunt连接试剂盒购自北京全式金生物技术公司，T4DNA连接酶购自NEB公司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体 pCAMBIA 1300 和 pCAMBIA 2300 来自 CAMBIA 公司。实施例I JMJ18启动子(JMJ18U和JMJ18H启动子的统称)的分离和鉴定克隆JMJ18L3kb启动子所需引物引物1:5' -ctgcag ACAAGACAGAAGAAGCAGGAAAC-3' (SEQ ID NO :5)引物2:5' -tctaga ATGAATTGAAAAATCAATACTACTCAA-3' (SEQ ID NO 6)克隆JMJlSh7kb启动子所需引物引物3:5' -ctgcag TGCGAGTTCTTCTTTCAATGTG-3' (SEQ ID NO :7)引物2:5' -tctaga ATGAATTGAAAAATCAATACTACTCAA-3' (SEQ ID NO 6)引物I和引物3中序列ctgcag为PstI的酶切位点，引物2中序列tctaga为XbaI的酶切位点。分别利用JMJlSukb启动子和JMJlSukb启动子的正反向引物，以拟南芥(Col生态型)基因组DNA作为模板，进行扩增，反应条件是94°C预变性5分钟；94°C变性30秒；55°C退火30秒；72°C延伸2分钟；30个循环；72°C延伸10分钟。反应结束后，PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入pEASY-Blunt，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明所扩增序列分别为预期的JMJlSh3kb启动子(如序列表中SEQ ID No :I所示)和JMJlSh7kb启动子序列(如序列表中SEQ ID No 2所示)。实施例2构建植物表达载体JMJlSh3kb = GUS和JMJlSh7kbAUS分别将测序验证已经插入JMJlSukb启动子和JMJlS1I启动子序列的质粒用PstI和XbaI双酶切，得到JMJlS1.3kb启动子和JMJ18H启动子。分别将两个不同长度的启动子用T4DNA连接酶连入同样用PstI和XbaI双酶切的载体pCAMBIA130035S:⑶S，获得植物表达载体JMJ18L31tb:⑶S和JMJlSh7kb:⑶S，其T-DNA区的图谱如图IA和B。实施例3农杆菌介导的拟南芥的遗传转化利用热激法将植物表达载体JMJlS1.3kb⑶S和JMJlS1.7kb:⑶S分别转入农杆菌GV3101 菌株。
选取正值花期的拟南芥植株作为受体植物，于转化前剪去果荚和已经完全开放的花蕾，仅留下刚刚露白及幼嫩花蕾。挑取单个农杆菌克隆接种于5mL YEB培养基(利福平125iig/mL，卡那霉素100 u g/mL)中，于28°C下培养24小时。按照I : 100在500mL YEB培养基中进行扩增培养，继续培养12小时左右至OD6tltl值I. 0-1. 2 ;然后在室温通过5500g离心15min收集菌体。用转化介质(0. 5XMS大量元素，I XMS微量元素，I X铁盐，I XMS有机，5%的蔗糖，0. 03%Silwet L-77,0. 5g/L MES，0. 01mg/L 6-BA，pH 5. 7)悬浮菌体密度至 0D600 为 0. 8 左右；将含有农杆菌的转化介质倒入IOOmL烧杯中，将刚刚开花的拟南芥倒置其上，使得整个花序连同莲座基部的叶片都浸入转化介质中，维持5min;取出拟南芥，将其侧卧放在干净的塑料托盘上，并用薄膜覆盖避光保湿恢复24hr ;将拟南芥扶起，培养液浇透后，放在光下正常培养，转化后植株正常的开花生长，3-4周待长角果完全枯黄、欲开裂时，即可收获种子。实施例4转基因拟南芥⑶S基因表达的组织化学检测X-Gluc 母液IOOmg X-Gluc 溶于 5ml DMF。X-Gluc 基液50mM PBS pH7. 0, IOmM EDTA *2Na,0. I % Triton-100，5mM铁氢化钾，0. 5mM亚铁氢化钾。X-Gluc 使用液50 U I 母液 +950 U I 基液。选择合适大小的带有⑶S报告基因的转基因幼苗或特定组织浸入⑶S染液中，37°C染色过夜，吸去反应液，乙醇梯度脱色，显微镜观察照相。对JMJlS1Ib = GUS转基因植株的各组织器官进行⑶S染色分析，结果表明JMJ18启动子是一个表达比较广泛的启动子，在幼苗的根、子叶、初生的真叶中都有表达(图1A、B)；在成熟苗的连座叶、花当中也有表达(图1C、D)。通过进一步观察发现JMJ18无论在哪个组织器官的表达都具有一个共性，即JMJ18启动子只在这些组织器官的维管组织中表达。从结构上和细胞活性功能上判断，JMJ18启动子在维管组织筛管表达。为了进一步确认JMJ18启动子的表达模式，取12天龄的JMJ18H: JMJ18-GUS的幼苗，经过GUS染色和石蜡包埋，切片观察JMJ18启动子的表达模式。结果显示JMJ18启动子在茎顶端初生维管组织表达，并不在顶端分生组织(SAM)表达(图1E);在叶片中JMJ18启动子只在维管束的韧皮部表达(图1E);在根的切片中JMJ18启动子也只在韧皮部表达(图1F)。同时，还对根中JMJ18启动子的表达进行了更进一步的分析，尤其是在根尖。在成熟根中的结果与切片观察一致，只在韧皮部表达JMJ18启动子在根尖前维管组织表达，随着发育成熟JMJ18启动子又只在韧皮部表达(图1G、H)。另外，对JMJlSi.^JMJlS-GUS转基因植株的各组织器官也进行了⑶S染色分析，发现两个不同长度的JMJ18启动子具有相似的表达模式，无论是在子叶、真叶还是根中都只在维管组织表达(图2B、C)。用JMJlSi.^JMJlS-⑶S转基因植株分析了在根的不同发育阶段JMJ18启动子的表达模式(图2D-J)。在比较长的侧根和主根的根尖，它只能在初生韧皮部检测到GUS染色，而在侧根生成以及不同长度的侧根中JMJ18启动子也只在维管组织的韧皮部表达。 通过不同长度的启动子融合⑶S报告基因对JMJ18启动子的研究显示JMJ18启动子是一个韧皮部特异性表达的启动子。
实施例5利用JMJ18H: JMJ18-GFP转基因分析JMJ18启动子的表达特异性5. I 植物表达载体 JMJ18h 3kb JMJ18-GFP 的构建用于克隆JMJ18⑶S的引物引物4:5' -tctaga ATGGAAAATCCTCCATTAGAATC-3' (SEQ ID NO 8)引物5:5' -ggatcc c CATCAAATCTACTCCGAAAAGTT-3' (SEQ ID NO 9)弓丨物4中序列tctaga为XbaI的酶切位点，引物5中序列ggatcc为BamHI的酶切位点。利用JMJ18⑶S的正反向引物，以拟南芥(Col生态型)基因组cDNA作为模板，进行扩增，反应条件是94°C预变性5分钟；94°C变性30秒；55°C退火30秒；72°C延伸2分钟；30个循环；72°C延伸10分钟。反应结束后，PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入pEASY-Blunt，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明所扩增序列为预期的JMJ18⑶S序列(如序列表中SEQ ID No 3所示)。将测序验证已经插入JMJ18⑶S序列的质粒用XbaI和BamHI双酶切，得到JMJ18的⑶S ;将实施例I中测序验证已经插入JMJlSukb启动子的质粒用PstI和XbaI双酶切，得到JMJlSh3kb启动子。将JMJlSh3kb启动子和JMJ18⑶S用T4DNA连接酶同时连入用PstI和BamHI双酶切的载体pCAMBIA1300 35S:GFP，获得植物表达载体JMJlS1Jkb: JMJ18-GFP，其T-DNA区的图谱如图1C。5. 2 转 JMJ18U: JMJ18-GFP 拟南芥的获得按照实施例3所示的方法，获得转JMJlSu^JMJlS-GFP的拟南芥。简言之，利用热激法将植物表达载体JMJlSukb: JMJ18-GFP转入农杆菌GV3101菌种，通过蘸花法对拟南芥进行遗传转化，获得转JMJlSukb: JMJ18-GFP的拟南芥。5. 3转基因植物的GFP荧光观察对转基因植株的不同组织器官进行GFP荧光观察，成熟的根(图4A)、根尖(图4B)、胚轴和茎尖的连接部(图4C)、下胚轴(图4D)和花瓣(图4E)等多种组织中都只能在韧皮部的伴胞中观察到GFP荧光，表明JMJ18启动子只在韧皮部的伴胞中表达。实施例6SUC2: JMJ18-GFP转基因植株的获得和表达特异性分析6. I植物表达载体AtSUC2: JMJ18-GFP的构建克隆AtSUC2启动子所需引物引物6:5' -ctgcag AAAATCTGGTTTCATATTAATTTCA-3' (SEQIDN0:10)引物7:5' -tctaga ATTTGACAAACCAAGAAAGTAAGA-3' (SEQ ID NO 11)弓丨物6中序列ctgcag为PstI的酶切位点，引物7中序列tctaga为XbaI的酶切位点。利用AtSUC2启动子的正反向引物，以拟南芥(Col生态型)基因组DNA作为模板，进行扩增，反应条件是94°C预变性5分钟；94°C变性30秒；55°C退火30秒；72°C延伸2分钟；30个循环；72°C延伸10分钟。反应结束后，PCR产物经I %琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入pEASY-Blunt，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明所扩增序列为预期的AtSUC2启动子序列(如序列表中SEQ IDNo 4所示)。将测序验证已经插入AtSUC2启动子序列的质粒用PstI和XbaI双酶切，得到AtSUC2启动子。将AtSUC2启动子用T4DNA连接酶连入同样用PstI和XbaI双酶切的载体、JMjlSukb = JMJlS-GFP,获得植物表达载体AtSUC2:JMJ18-GFP，其T-DNA区的图谱如图1E。6. 2SUC2: JMJ18-GFP转基因植株的获得按照实施例3所述的方法，获得转SUC2: JMJ18-GFP的拟南芥。简言之，利用热激法将植物表达载体SUC2: JMJ18-GFP转入农杆菌GV3101菌种，通过蘸花法对拟南芥进行遗传转化，获得转SUC2:JMJ18-GFP的拟南芥。6. 3SUC2启动子的表达特异性分析
AtSUC2启动子是研究的比较清楚的维管束组织伴胞细胞特异性表达的启动子。观察SUC2:JMJ18-GFP转基因植株7天龄幼苗根中的GFP荧光(图5B)，发现与JMJlSukb:JMJ18-GFP转基因植株根中的表达模式非常相似(图5A)。因此，基本可以确认JMJ18启动子是一个伴胞特异性表达的启动子。实施例7利用JMJ18H: JMJ18-RFP和SUC2: JMJ18-GFP双转基因植株确定JMJ18启动子的表达特异性7. I 植物表达载体 JMJlSh3kb: JMJ18-RFP 的构建将实施例I中测序验证已经插入JMJlS1.3kb启动子的质粒用PstI和XbaI双酶切，得到JMJlSukb启动子；将实施例5中测序验证已经插入JMJ18⑶S序列的质粒用XbaI和BamHI双酶切，得到JMJ18的CDS。将JMJlS1.3kb启动子和JMJ18CDS用T4DNA连接酶同时连入用PstI和BamHI双酶切的载体pCAMBIA230035S:RFP，获得植物表达载体JMJlSh3kb: JMJ18-RFP，其 T-DNA 区的图谱如图 1D。7. 2JMJ18L3kbJMJ18-RFP 和 SUC2: JMJ18-GFP 双转基因植株的获得按照实施例3所述的，方法获得JMJ18h 3kb JMJ18-RFP和SUC2: JMJ18-GFP双转基因植株。简言之，将JMJlSukb:JMJ18-RFP转化农杆菌GV3101菌株，利用蘸花法对转SUC2: JMJ18-GFP的拟南芥纯合体再次进行遗传转化，获得JMJlS1.3kb JMJ18-RFP和SUC2: JMJ18-GFP双转基因植株。7. 3JMJ18L3kbJMJ18-RFP 和 SUC2: JMJ18-GFP 双转基因植株的荧光观察对JMJ18H: JMJ18-RFP和SUC2: JMJ18-GFP双转基因植株7天龄幼苗的根进行荧光观察，发现GFP和RFP共定位于伴胞细胞中(图5C-F)。因此，JMJ18启动子是一个维管束伴胞细胞特异表达的启动子。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
权利要求
1.一种分离的启动子，其特征在于，包含SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，或者与SEQIDNO :I互补的核苷酸序列。
2.根据权利要求I所述的启动子，其特征在于，包含SEQID NO :2所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO :2互补的核苷酸序列。
3.ー种表达盒,其包含 权利要求I或2所述的启动子；以及 目的基因，所述目的基因与所述启动子可操作地相连， 任选地，所述目的基因位于所述启动子的3’侦牝 任选地，所述目的基因为抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗除草剤、抗虫、抗逆以及产量、品质和开花相关基因的至少ー种。
4.ー种表达载体，其特征在于，包括权利要求I所述的启动子， 任选地，进ー步包括目的基因，所述目的基因与所述启动子可操作地相连， 任选地，所述目的基因位于所述启动子的3’侦牝 任选地，所述目的基因为抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗除草剤、抗虫、抗逆以及产量、品质和开花相关基因的至少ー种， 任选地，所述表达载体进一歩包括负责组织特异性和时间特异性表达的元件、调控组成型表达的元件和增强子的至少ー种。
5.ー种制备转基因植物或其衍生物的方法，其中，所述转基因植物中包含权利要求3-5任一项所述的表达盒，所述方法包括 在植物的至少一部分中引入权利要求4所述的表达载体， 任选地，对引入所述表达载体的植物的一部分进行培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述植物为选自蕨类植物、裸子植物和被子植物的至少ー种， 任选地，所述植物为拟南芥。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转基因植物的衍生物为所述转基因植物的种子、组织或者细胞的至少一部分。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，通过农杆菌介导法，在植物的至少一部分中引入所述表达载体。
9.根据权利要求I所述的启动子的用途，其用于在植物維管束组织伴胞中特异性表达目的基因。
10.一种用于扩增权利要求I所述的启动子的引物对，其特征在于，包括 第一引物，所述第一引物包含如SEQ ID NO :6所不的核苷酸序列；和 第二引物，所述第二引物包含如SEQ ID NO :5或7所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及启动子及其用途。更具体地，本发明涉及启动子、表达盒、表达载体、制备转基因植物或其衍生物的方法、启动子的用途、用于扩增启动子的引物对。根据本发明实施例的启动子包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO1互补的核苷酸序列。通过将根据本发明实施例的启动子与外源基因相连，能够实现在植物维管束组织伴胞中特异性表达外源基因。
文档编号C12N5/10GK102628043SQ20121007323
公开日2012年8月8日 申请日期2012年3月19日 优先权日2012年3月19日
发明者杨红春, 马力耕, 马天宇 申请人:首都师范大学