专利名称：一种检测基因突变的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测基因突变的方法。
背景技术：
病原微生物的不断变异是造成病原微生物免疫逃逸和抗药性的根本原因，如能对重要病原微生物流行过程中基因组变异进行检控及时检测出抗原表位漂移及抗药性突变的出现，这对预测病原微生物流行趋势，及早采取相应的免疫措施或及时更换治疗药物具有重要的作用。尽管病原微生物变异及抗药性突变检测在疾病预防和治疗中 都具有极高的应用价值，但因缺乏高效、低廉能克服基因组高背景的检测方法，使其难以应用到临床实践中。Sanger测序法虽一直是突变检测广泛应用的平台，但其灵敏度较低，PCR产物混合测序时只能检测到> 20%的突变，单个克隆测序又费力耗时。另外，在病原微生物混合感染中病原微生物的分离和鉴定也是临床实践中遇到的
一大难题。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测基因突变的方法。本发明提供了一种DNA分子测序的方法，包括如下步骤(I)以来自一个待测样本的双链DNA分子为模板，用单链DNA片段甲和单链DNA片段乙组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物，得到目的待测双链DNA分子(目的待测双链DNA分子即目的基因片段或带有样品条码的目的基因片段)；所述目的待测双链DNA分子由单链DNA分子I和单链DNA分子2组成，且单链DNA分子I和单链DNA分子2反向互补；所述单链DNA片段甲为所述单链DNA分子I的5’端区域；所述单链DNA乙包括所述单链DNA分子2的5’端区域；(2)将步骤(I)的PCR扩增产物进行磷酸化；(3)将步骤(2)的产物单链化并与单链DNA片段丙及dNTP共孵育，所述单链DNA分子I的5’端区域与所述单链DNA片段丙的3’端区域配对形成双链，所述单链DNA分子I的3’端区域与所述单链DNA片段丙的5’端区域配对形成双链；在DNA聚合酶的作用下，所述单链DNA分子I的5’端区域与3’端区域通过与所述单链DNA片段丙的分子条码区域互补的核苷酸连接成环；所述单链DNA片段丙自5’末端至3’末端依次包括三个区域所述单链DNA分子2的5’端区域、分子条码区域和所述单链DNA分子2的3’端区域；所述分子条码区域由选自A、T、C和G的10至16个核苷酸组成；(4)将步骤(3)的产物用核酸外切酶进行消化，去除没有成环的单链DNA分子；(5)以步骤(4)的产物为模板进行滚环复制；(6)将步骤(5)的产物的粘末端补平；(7)将步骤(6)的产物用核酸外切酶进行消化，去除单链DNA分子；
(8)将步骤(7)的产物进行超声破碎并回收与待测双链DNA分子大小近似的片段；(9)将步骤(8)回收的片段进行末端修复和缺口连接；(10)将步骤(9)的产物进行磷酸化；(11)将步骤(10)的产物进行第一次测序；(12)完成步骤(11)后，以所述单链DNA片段甲为测序引物进行第二次测序，读取分子条码信息；(13)将具有相同分子条码的测序结果进行拼接，每种分子条码获得一个具体的测
序结果。
所述单链DNA片段乙可为所述单链DNA分子2的5’端区域；所述单链DNA片段丙可由所述单链DNA分子2的5’端区域、所述分子条码区域和所述单链DNA分子2的3’端区域组成。所述待测样本为两种以上时，采用相应数量的样品条码分别进行标记；所述样品条码由选自A、T、C和G的6个核苷酸组成；所述单链DNA乙的5’端还具有所述样品条码区域；所述单链DNA片段丙中，在所述单链DNA分子2的5’端区域和所述分子条码区域之间，还具有与所述样品条码区域反向互补的DNA区域；所述方法中，将每种所述待测样本分别进行所述步骤(I)，混合后进行所述步骤(2)。所述单链DNA片段乙可由所述单链DNA分子2的5’端区域和所述样品条码区域组成；所述单链DNA片段丙可由所述单链DNA分子2的5’端区域、与所述样品条码区域反向互补的DNA区域、所述分子条码区域和所述单链DNA分子2的3’端区域组成。以上任一所述方法均可用于检测基因变异。所述方法用于检测单个样本中的目的基因变异时，将所述方法得到的各个测序结果分别与目的基因的现有序列进行比对，从而判断目的基因发生的突变；所述来自一个待测样本的双链DNA分子为来自一个待测样本的基因组DNA或cDNA。所述方法用于检测多个样本中的目的基因变异时，将所述方法得到的各个测序结果分别与目的基因的现有序列进行比对，从而判断目的基因发生的突变；所述来自一个待测样本的双链DNA分子为来自一个待测样本的基因组DNA或cDNA。所述目的待测双链DNA分子可为500_1000bp。所述步骤(8)中，所述与待测双链DNA分子大小近似的片段具体可为500-1000bp的片段。所述以来自一个待测样本的双链DNA分子具体可为来自293T细胞的cDNA。所述目的待测双链DNA分子具体可为序列表的序列I所示的双链DNA分子。所述步骤(8)中，所述与待测双链DNA分子大小近似的片段具体可为600-1000bp的片段。本发明克服了新一代测序平台读出序列较短的不足，提供了一种能将同一分子不同短序列拼装在一起的方法。本发明的特征是通过高通量测序，在单分子水平上进行基因变异的检测，且可在同一基因上检出多点突变。本发明可用于病原微生物变异的高灵敏性检测和病原微生物混合感染的快速甄别。
图I为两轮测序的流程示意图。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。293T细胞(ATCC CRL-11268) 0实施例中均采用Nano-100_微量分光光度计测定DNA含量。实施例1、293T细胞中Bcr-Abl基因变异的检测一、制备 cDNAI、提取293T细胞的总RNA。2、以步骤I提取的总RNA为模板，采用NEB公司的逆转录试剂盒制备cDNA(双链)。二、目的片段高保真扩增I、以步骤一得到的cDNA为模板，用单链DNA片段甲和单链DNA片段乙组成的引物对，在Phusion DNA聚合酶(NEB公司的一种高保真DNA聚合酶)的作用下进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。使用ZYMO公司的DNA纯化试剂盒纯化回收PCR扩增产物。单链DNA 片段甲5’ -AGGGAGGGTGTACCATTACAGGA-3’ ；单链DNA 片段乙5’ -TTCTCCCCTACCAGGCAGTTTC-3’。PCR扩增的反应体系为50ul，其中含有Iul双链cDNA、2. 5ul DNA片段甲(IOuM)、
2.5ul DNA 片段乙(IOuM)和 Iul dNTP (each IOmM)。PCR扩增的反应条件98°C 30s,98°C 10s、66°C 10s、72°C 30s，15 个循环(10-20 个循环均可)；72°C 7min ;10°C保存。 2、取步骤I得到的PCR扩增产物(约300ng)，使用NEB的T4DNA磷酸化酶进行磷酸化(采用50ul体系)，然后采用ZYMO公司的DNA纯化试剂盒纯化回收。3、取步骤 2 的产物(约 IOOng)、10ul 单链 DNA 片段丙 IulUOXAmpligasebuffer2ul，用紫外线处理后的ddH20定容至18ul ;然后依次进行如下处理(使双链DNA分子变性为两条反向互补的单链DNA分子，即单链DNA分子I和单链DNA分子2，单链DNA分子I与单链DNA片段丙通过两个互补区域结合):20°C 4min、95°C 5min、58°C 90min ；然后加入 IOmM dNTP (each IOmM) IulUOU Taq Stoffel Fragment (ABI) O. 5ul、5UAmpligase(Epi)O. 5ul ;然后依次进行如下处理(单链DNA分子I的5’端区域与3’端区域通过与单链DNA丙的分子条码区域互补的核苷酸连接成环)58°C 15min、37°C lmin,然后4°C保存。DNA片段丙为单链DNA，序列如下5，-TCCTGTAATGGTACACCCTCCCT-MB-TTCTCCCCTACCAGGCAGTTTC-3，。其中MB区域由16个核苷酸组成，该16个核苷酸选自A、T、C和G ;也就是单链DNA片段丙代表一组DNA，该组DNA中，除了 MB区域，其它区域都相同，因为MB区域代表庞大的信息量(416种可能)，远大于待测分子数，可确保不同的分子上引入不同的条码，从而做到每个分子上引入条码的唯一性。4、取20ul步骤3的产物、2ul EXoI和O. 4ulExoII混合并进行如下处理(通过核酸外切酶EXoI切除未成环的单链DNA片段)37°C 45min,80°C 20min, 10°C保存备用。、
5、取步骤 4 的产物(约 40ng)、25mM dNTP (Epicentre) 0.8ul、10mg/mlBSA(NEB)0. 4ul,100 μ M N6T2(hexamer, IDT)2ul、10 X phi29buffer(Epicentre)2ul、phi29DNA聚合酶(100U，Epicentre) Iul、DMSO 2ul，用紫外处理的H2O定容至20ul ;然后依次进行如下处理(以单链环状DNA为模板进行滚环复制)28°C 3h，65°C lOmin，然后10°C保存；无水乙醇沉淀回收DNA分子然后用20ul H2O溶解。6、取步骤 5 回收的 DNA 分子 14ul、25mM dNTP (Epicentre) O. 5ul、10Xphi29buffer (Epicentre) 5ul>100U phi29DNA 聚合酶(Epicentre) 2ul、H2O (Ambion) 28. 5ul ;进行如下处理(补平粘末端)30°C 2h，65°C 3min，10°C保存。7、取步骤 6 的产物 47ul、10XSl buffer(pH4. 6,300mM NaAc,500mM NaCl,10mMZnS04)20ul、400U SI 核酸酶(USB) Iul、H2O(Ambion) 132ul ;然后进行如下处理(去除单链DNA) 37°C 30min ;然后添加IOul IOOmM EDTA停止反应。
8、取200ul步骤7的产物，在冰浴上进行超声破碎处理(Duty = 50%, Output =
6,2times, each time 15sec),回收 600-1000bp 的 DNA 片段。9、取 20ul 步骤 8 回收的片段、10Xbuffer2(NEB) IOulUOmM dNTP (Bioline) 5ul、T4DNA 聚合酶(3U，NEB)2ul、E. coli DNA 聚合酶 I (10U，NEB) 2ul、H2O (Ambion) 61ul ;然后进行如下处理(末端修复、缺口连接)25°C Ih, 75°C 10min，4°C保温。10、使用ZYMO公司DNA纯化试剂盒纯化回收步骤9的产物，然后使用NEB的T4DNA磷酸化酶进行磷酸化(采用50ul体系)，然后采用ZYMO公司的DNA纯化试剂盒纯化回收。11、采用Solexa测序Kit (ILUMINA)按试剂盒的说明进行第一次测序。12、以步骤I中的单链DNA片段甲为测序引物，在第一次测序的基础上，进行第二次测序，读取分子条码信息(两轮测序的流程示意图见图I)。13、将具有相同分子条码的测序结果进行拼接，每种分子条码获得一个具体的测
序结果。Bcr-Abl基因片段的野生型序列如序列表的序列I所示，经过上述步骤，293T细胞中的Bcr-Abl基因得到了 5种测序结果，分别如下第一种结果与序列I 一致；第二种结果在序列I的320-404位发生了缺失；第三种结果在序列I的基础上存在着I个突变，自5’末端第262位的G变成了 C ;第四种结果在序列I的基础上存在着2个突变，分别是自5’末端第202位的G变成了 T、第399位的T变成了 C ;第五种结果在序列I的基础上存在着2个突变，分别是自5’末端第388位的C变成了 A、第514位的G变成了 C。
权利要求
1.一种DNA分子测序的方法，包括如下步骤 (1)以来自一个待测样本的双链DNA分子为模板，用单链DNA片段甲和单链DNA片段乙组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物，得到目的待测双链DNA分子；所述目的待测双链DNA分子由单链DNA分子I和单链DNA分子2组成，且单链DNA分子I和单链DNA分子2反向互补；所述单链DNA片段甲为所述单链DNA分子I的5’端区域；所述单链DNA乙包括所述单链DNA分子2的5’端区域； (2)将步骤(I)的PCR扩增产物进行磷酸化； (3)将步骤(2)的产物单链化并与单链DNA片段丙及dNTP共孵育，所述单链DNA分子I的5’端区域与所述单链DNA片段丙的3’端区域配对形成双链，所述单链DNA分子I的3’端区域与所述单链DNA片段丙的5’端区域配对形成双链；在DNA聚合酶的作用下，所述单链DNA分子I的5’端区域与3’端区域通过与所述单链DNA片段丙的分子条码区域互补的核苷酸连接成环；所述单链DNA片段丙自5’末端至3’末端依次包括三个区域所述单链DNA分子2的5’端区域、分子条码区域和所述单链DNA分子2的3’端区域；所述分子条码区域由选自A、T、C和G的10至16个核苷酸组成； (4)将步骤(3)的产物用核酸外切酶进行消化，去除没有成环的单链DNA分子； (5)以步骤(4)的产物为模板进行滚环复制； (6)将步骤(5)的产物的粘末端补平； (7)将步骤(6)的产物用核酸外切酶进行消化，去除单链DNA分子； (8)将步骤(7)的产物进行超声破碎并回收与待测双链DNA分子大小近似的片段； (9)将步骤(8)回收的片段进行末端修复和缺口连接； (10)将步骤(9)的产物进行磷酸化； (11)将步骤(10)的产物进行第一次测序； (12)完成步骤(11)后，以所述单链DNA片段甲为测序引物进行第二次测序，读取分子条码息; (13)将具有相同分子条码的测序结果进行拼接，每种分子条码获得一个具体的测序结果O
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述待测样本为两种以上，并采用相应数量的样品条码分别进行标记；所述样品条码由选自A、T、C和G的6个核苷酸组成；所述单链DNA乙的5’端还具有所述样品条码区域；所述单链DNA片段丙中，在所述单链DNA分子2的5’端区域和所述分子条码区域之间，还具有与所述样品条码区域反向互补的DNA区域；所述方法中，将每种所述待测样本分别进行所述步骤(I)，混合后进行所述步骤(2)。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述单链DNA片段乙为所述单链DNA分子2的5’端区域；所述单链DNA片段丙由所述单链DNA分子2的5’端区域、所述分子条码区域和所述单链DNA分子2的3’端区域组成。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述单链DNA片段乙由所述单链DNA分子2的5’端区域和所述样品条码区域组成；所述单链DNA片段丙由所述单链DNA分子2的5’端区域、与所述样品条码区域反向互补的DNA区域、所述分子条码区域和所述单链DNA分子2的3’端区域组成。
5.权利要求I至4中任一所述方法在检测基因变异中的应用。
6.权利要求I或3所述的方法的如下应用检测单个样本中的目的基因变异；所述应用中，将所述方法得到的各个测序结果分别与目的基因的现有序列进行比对，从而判断目的基因发生的突变；所述来自一个待测样本的双链DNA分子为来自一个待测样本的基因组DNA 或 cDNA。
7.权利要求2或4所述的方法的如下应用检测多个样本中的目的基因变异；所述应用中，将所述方法得到的各个测序结果分别与目的基因的现有序列进行比对，从而判断目的基因发生的突变；所述来自一个待测样本的双链DNA分子为来自一个待测样本的基因组DNA 或 cDNA。
全文摘要
本发明公开了一种检测基因突变的方法。本发明提供了一种DNA分子测序的方法，包括如下步骤(1)得到目的待测双链DNA分子；(2)磷酸化；(3)在DNA聚合酶的作用下，单链DNA分子1的5’端区域与3’端区域通过与单链DNA片段丙的分子条码区域互补的核苷酸连接成环；(4)用核酸外切酶消化；(5)滚环复制；(6)粘末端补平；(7)用核酸外切酶消化；(8)超声破碎；(9)末端修复和缺口连接；(10)磷酸化；(11)第一次测序；(12)第二次测序，读取分子条码信息；(13)获得结果。本发明可用于病原微生物变异的高灵敏性检测和病原微生物混合感染的快速甄别。
文档编号C12Q1/68GK102676654SQ20121007277
公开日2012年9月19日 申请日期2012年3月19日 优先权日2011年3月17日
发明者倪挺, 刘翟, 朱鈞, 杨怀义 申请人:中国科学院微生物研究所