专利名称：一种直接从土壤或其他基质中快速检测鉴定香蕉穿孔线虫的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学检测鉴定技术领域，具体涉及一种直接从土壤或其他基质中快速检测鉴定香蕉穿孔线虫的方法。
背景技术：
害藍穿系歲电XRadopholussimilis (Cobb) Thorne, 1949)是一种迁移性植物内寄生线虫，已报道的寄主植物超过250种(O’Bannon，1977)，严重为害香蕉(ifesa spp.)、柑橘(CYtras spp.)、胡椒(/ /" nigrum、、生姜{Zingier o//ici/ a7e)等多种经济植物和观赏植物(Luc et al, 1990 ；Richardson et al, 1993 ；Uchida et al,2003 ；Sundararaju etal，1979)，香蕉穿孔线虫广泛分布于热带和亚热带的大部分香蕉产区和温带地区的温室中，已报道有该线虫分布的国家和地区超过90个(谢辉，2006)，是诸多国家的重要检疫危险性植物有害生物(Cotton J et al ;0EPP/EPP0，2008)，也是中国禁止进境植物检疫性有害生物(中华人民共和国农业部，2007)。香蕉穿孔线虫最早是由美国线虫学家Cobb在1891年从采自斐济的香蕉(ifesa sp.)根部发现的，从19世纪开始随着香蕉球茎和蕉苗等种植材料在香蕉种植国家和地区间传播，20世纪60年代该线虫随着观赏植物传播到法国、比利时等欧洲国家的温室中，到20世纪末世界上大多数香蕉种植区都有该线虫分布(Gowen etal, 1990 ；Loof, 1991 ；ffillams et al, 1973 ；Marin et al，1998)。中国台湾在 1971 年从美国夏威夷引进的火鹤花上发现香蕉穿孔线虫(罗宗爵等，1973);中国内地口岸，从20世纪80年代开始多次从进境香蕉苗和观赏植物上截获香蕉穿孔线虫(林奇力，1986 ;宋绍等，1999 ;陈勇等，2002 ;钟国强等，1999 ;孙国坤，2004 ;张绍生等，2003 ;李一农等，2004 ;赵立荣等，2004 ;钟国强等，2005 ;钟国强等，2004 ;黄发余等，2001a ;黄发余等，2001b ;黄发余等，2002 ;蒋寒等，2004)。可见，随着经济及农业生产和农产品贸易迅速发展，植物种苗等种植材料在国家和地区间调运的数量不断增加，而其中很多植物是香蕉穿孔线虫的寄主，从而促使了香蕉穿孔线虫在世界广泛的传播。由于香蕉穿孔线虫对作物为害所造成的损失非常大，要有效阻止香蕉穿孔线虫在国家和地区间的传播和扩散，需要加强对引进和调运的香蕉穿孔线虫寄主植物及其携带土壤或基质进行检测，并准确快速的检测鉴定可能携带的香蕉穿孔线虫。香蕉苗和观赏植物是目前携带传播香蕉穿孔线虫风险最大的寄主植物，因此加强对可能携带该线虫的植物种植材料及其粘附的土壤或其他栽培基质的检测至关重要。但常规检测方法要首先对可疑植物携带的土壤或者基质进行分离，在体视显微镜下对分离到的线虫进行形态观察，然后挑出疑似香蕉穿孔线虫，再进行具体的形态学鉴定或者进行分子检测鉴定。这种检测鉴定方法需要的时间相对较长，并且操作人员需具备专门的植物线虫鉴定技能和经验才能在体视显微镜下检测鉴定并挑出疑似香蕉穿孔线虫。本课题组已成功建立了从植物组织中直接检测鉴定香蕉穿孔线虫的分子生物学技术(刘一帆等.从混合线虫样品和植物组织中直接检测香蕉穿孔线虫的ITS-PCR方法.中国农业科学，2011，44(19) : 3991-3998)，而运用分子生学方法直接检测鉴定土壤或基质中香蕉穿孔线虫的技术尚未有报道。目前利用分子生物学方法直接检测鉴定土壤中线虫的报道很少。Qiu等(2006)用土壤DNA提取试剂盒和通用引物检测鉴定出混在土壤中的南方根结线虫(Meloidogyneincogniia)、花生根结线虫CK arenaria)和爪睡根结线虫Ql javanica) ；Yan和Smiley (Guiping Yan etc. , Detection and Discrimination of Pratylenchusneglectus and P. thornei in DNA Extracts from Soil, plant disease, November2008，Volume 92，Number 11:1480-1487)利用自制的DNA抽提缓冲液提取含有落选短体线虫iPratylenchus fleWeciiAs)和索恩短体线虫{P. thornei )的土壤DNA,并用其所计设的特异引物和建立的DNA提取及纯化方法，实现了直接检测鉴定土壤中的这2种线虫的目的。
发明内容
本发明的目的是在Yan和Smiley研究的基础上进行优化，得出一种可以直接从土 壤或其他基质中快速检测鉴定香蕉穿孔线虫的方法。本发明通过以下技术方案实现上述目的
一种直接从土壤或其他基质中快速检测鉴定香蕉穿孔线虫的方法，步骤如下
(I)待检样品中DNA提取
称取待检样品，与等重的直径0. 5 mm玻璃珠一起移至尖底离心管(优选规格为15mL的尖底离心管)中，加入体积比为1:1的磷酸缓冲液和SDS缓冲液，翻转3 4次；
再加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇，振荡后以3 000 rpm的速度离心，上清转移至一 I. 5 mL离心管；
加入预冷的醋酸钠，混匀，_20°C静置5 min，常温离心，上清转移至另一新I. 5 mL离心
管;
加入冷异丙醇，静置20min，离心，沉淀加入体积百分含量为70%的乙醇洗涤，离心，弃上清，重复洗涤一次，离心；
沉淀自然风干，加入超纯水静置lOmin，获得DNA粗提液。(2)使用 Promega 公司的 Wizard DNA Clean-up Systems 试剂盒纯化步骤(I)的DNA提取液。(3)PCR检测以纯化的DNA为模板，SEQ ID NO: Γ2所示核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，如果扩增出518bp的核苷酸序列，则证明待检样品中有香蕉穿孔线虫。上述步骤(I)主要参照文献(YanG , Smiley R ff. Detection anddiscrimination of Pratylenchus neglectus and P. thornei in DNA extracts fromsoil. Plant Disease, 2008，92 (11) : 1180-1487)的方法进行，但其中部分方法做了修改1)使用与加入待检样品等重且直径为0. 5 mm的玻璃珠(ks I mm)；2)将待检样品和玻璃珠放入15 mL尖底离心管中(Ks 2 mL螺帽离心管)；3)离心时，转速设置为3 000 rpm(vs 16 000 g)。上述检测方法步骤(2 )是直接使用商品试剂盒，按试剂盒说明书操作即可。与Yan和Smiley (2008)的方法相比，使用试剂盒操作规范、易推广，DNA纯化效果好、被检测灵敏度高。
作为一种优选方案，上述检测方法步骤(3)所述PCR扩增反应使用(东洋纺)Τ0Υ0Β0公司的KOD FX酶进行PCR扩增，该酶具有高扩增率和高保真性等特征，扩增条带清晰。上述检测方法中步骤(3)所述PCR扩增反应优选反应体系为25PL :DNA模板5 μ ,2 XPCR buffer 12. 5 PL，2mmol/L 的 dNTP 5 μ , 10 Mmol/L 的 SEQ ID NO: I 引物 O. 75 μ ,10 Mmol/L的SEQ ID N0:2引物0. 75 μ ,ΚΟ FX酶0.5 μ ，用三蒸水补足体积；反应程序为94°C预变性2 min，98°C变性10 s，50°C退火30 s，68°C延伸I min，从变性到延伸进行35个循环，然后72°C再充分延伸5 min。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
本发明建立的直接检测鉴定土壤或基质中的香蕉穿孔线虫的技术，采用了 Yan和Smiley (2008)的DNA提取方法，但DNA纯化未采用Yan和Smiley (2008)的方法，而是采用Promega公司的Wizard DNA Clean-up Systems试剂盒,使DNA的纯化效果更好、被检 测灵敏度更高，使用本发明建立的PCR反应体系及程序和本课题组设计的特异性引物进行PCR扩增，实现了直接检测鉴定出混在土壤或基质中的香蕉穿孔线虫，灵敏度达到从O. 5 g土壤或基质中检测出I条香蕉穿孔线虫。本发明建立的检测方法可直接从土壤或其他基质中快速检测鉴定香蕉穿孔线虫的技术，不需对所采集的待检测样品进行线虫分离和在体视显微镜进行初步的形态鉴定及挑虫等过程，直接对土壤或其他基质进行总DNA的提取和纯化，使用香蕉穿孔线虫ITS区特异性引物进行常规PCR扩增，若O. 5g土壤或其他基质中有一条香蕉穿孔线虫即能扩增出约500bp的特异片段，因此本发明的检测鉴定方法具有简便快速、省工和灵敏的优点。本发明的方法使用常规PCR仪和常规的PCR方法，是目前最为基础的常用的分子生物学仪器和方法，因此实用性强易于推广。本发明的方法可以实现香蕉穿孔线虫病的早期诊断，防止香蕉穿孔线虫病突发成灾，可以加快口岸检验检疫机关对进出口植物和基质的检测水平和检测速度，避免将带有香蕉穿孔线虫的植物和基质输入中国，同时加快口岸验放速度，减少货物在货存场存放的时间和费用；提闻我检验检疫机关在国际贸易中的地位和形象。
图I.用香蕉穿孔线虫与土壤混合样品的DNA模板进行特异性引物PCR扩增，其中a: 1-3. O. 5 g加入50条香蕉穿孔线虫的土壤样品，4-6，土壤样品；b: 1-3. 0.5 g 土壤中加入5条香蕉穿孔线虫，4-6. O. 5 g 土壤中加入4条香蕉穿孔线虫；c: 1-3. 0.5 g 土壤中加入3条香蕉穿孔线虫，4-6. 0.5 g 土壤中加入2条香蕉穿孔线虫，7-9. 0.5 g 土壤中加入I条香蕉穿孔线虫；M Marker DL2000。图2.从发病巴西蕉根际土壤DNA模板中用特异性引物PCR扩增检测香蕉穿孔线虫，1-1 5-2 :发病巴西蕉根际土壤；6_1，6-2 :灭菌土 ；7 :三蒸水；M Marker DL2000。图3.用香蕉穿孔线虫与基质混合样品的DNA模板进行特异性引物PCR扩增结果，a: 1-3.加入50条香蕉穿孔线虫的O. 5 g基质样品,4-6,土壤样品；b: 1-3. 0.5 g基质中加入5条香蕉穿孔线虫，4-6. O. 5 g基质中加入4条香蕉穿孔线虫；c: 1-3. 0.5 g基质中加入3条香蕉穿孔线虫，4-6. 0.5 g基质中加入2条香蕉穿孔线虫，7-9. 0.5 g基质中加Λ I条香蕉穿孔线虫；M Marker DL2000。图4.从发病孔雀竹芋根际基质DNA模板中用特异性引物PCR扩增检测香蕉穿孔线虫，1-1飞-2.发病孔雀竹芋根际基质；6-1，6-2.灭菌土；7.三蒸水；M :Marker DL2000。
具体实施例方式实施例I从含有香蕉穿孔线虫的土壤样品中快速检测鉴定香蕉穿孔线虫
试验材料香蕉穿孔线虫采自红掌根际土壤的种群，本实验室在25°C培养箱内培养保存在胡萝卜愈伤组织上；土壤为采自大田香蕉根际土壤。具体实施步骤如下
1.香蕉穿孔线虫与土壤混合样品总DNA的提取
1.1称取O. 5 g上述大田土壤样品，装入15 mL灭菌尖底离心管中，加入等重量的直径为O. 5 mm的小玻璃珠；
1.2从培养香蕉穿孔线虫的胡萝卜愈伤组上分离获得香蕉穿孔线虫，在显微镜下分别挑取50、5、4、3、2及1条香蕉穿孔线虫分别放进不同的装有0.5 g 土壤的15 mL尖底离心管中，加入磷酸盐缓冲液(100 mM NaH2PO4, pH 8. O)和SDS缓冲液(100 mM NaCl, 500 mMTris, pH 8. 0,10% SDS)各 300μ ，翻转 3-4 次；
1.3加入氯仿异戊醇(体积比24:1) 400 μ ，用漩涡振荡器以中速振荡30 s，3 000rpm离心5 min,将上清(小于600 μ )转移至I. 5 mL离心管中；
1.4加入300 PL预冷的NaOAc (3Μ，ρΗ5. 2)，上下颠倒混匀，置于_20°C冷冻箱中放置5 min,取出后以12 OOOrpm离心5 min,将上清(不超过650 KL)转移至一新I. 5 mL尖底离心管中；
1.5加入600 μ 冷的异丙醇，室温放置20 min用于沉淀DNA，然后12 OOOrpm离心5min,弃上清液，加入700 mL体积百分含量为70%的无水乙醇，轻轻旋转，充分洗涤DNA沉淀，12 000 rpm离心5 min,再弃上清,重复洗漆一次；
1.6将DNA沉淀置于室温，待其自然风干后，加入100 PL超纯水，室温放置10 min，使DNA充分溶于水中获得DNA粗提液，可直接进行下一步实验，也可放_20°C保存备用。2.香蕉穿孔线虫与土壤DNA粗提液的纯化
2.I 先混勻纯化试剂盒(Wizard DNA Clean-up Systems, Promega)中装有溶液 Resin的小瓶(若有沉淀，37°C水浴10 min)，取I mL Resin到保存的100 μ L DNA粗提液中，颠倒混匀；
2.2去掉10 mL注射器针头，与试剂盒中的纯化柱拧紧在一起，加入步骤(I)的混合液到注射器管中，过滤混合液；
2.3加入2 mL 80%异丙醇到注射器管中，再次过滤；
2.4将纯化柱放入I. 5 mL离心管中，12 000 rpm离心2 min ；
2.5将纯化柱转移至另一新I. 5 mL离心管中，加入50 μ L在65°C水中预热的TE缓冲液(10 mM Tris, I mM EDTA,pH 8. O),静置 I min, 12 000 rpm 离心 20 s,收集离心管中的DNA，得到纯化的DNA，可直接用于下一步实验或_20°C保存备用。3从香蕉穿孔线虫与土壤混合样品纯化的DNA中特异性检测香蕉穿孔线虫DNA片段3.I合成已设计的香蕉穿孔线虫ITS区特异引物
上游引物 PF (5，-CTACAAATGTGACGCGAA-3，SEQ ID N0:1),
下游引物 PR (5，-CMTCTGC ACAA TGAACATAC-3，SEQ ID N0:2)；
3.2香蕉穿孔线虫特异性扩增PCR反应体系和程序如下
在200 μ L PCR管中，配置25 μ L反应 体系取步骤2. 5 DNA模板5 μ L,2XPCRbuffer (TOYOBO 公司)12.5 μ L, dNTP (2 mM each) 5 yL (TOYOBO)，上游引物 PF(10 μ Μ) O. 75 μ L，下游引物 PR (10 μ Μ) O. 75 μ L，KOD FX 酶(1U / μ L) O. 5 μ L(TOYOBO)，其余用三蒸水补足。在Bio-rad S1000 PCR仪上设定反应程序为94°C预变性2 min，98°C变性10 s,50°C退火30 s，68°C延伸I min，从变性到延伸进行35个循环，然后72°C再充分延伸5 min。把各PCR反应管放入PCR仪内，盖好盖子，按设定程序进行PCR扩增。3. 3琼脂糖凝胶电泳检测
待3. 2 PCR反应结束后，取3 μ L产物在已经加入Goldview DNA燃料的1%琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为121 V，电泳结束后在凝胶成像系统上进行观察、拍照和记录，若出现500 bp的特异性片段说明有香蕉穿孔线虫的存在(见图I)。实施例2直接从发生香蕉穿孔线虫病的香蕉根际土壤中快速检测鉴定香蕉穿孔线虫
试验材料本实验室在温室大棚内盆栽接种香蕉穿孔线虫并且发病的巴西蕉根际土壤。具体实施步骤如下
取发病巴西蕉根际土壤约50(Tl 000g,充分混勻,称取5份0. 5 g 土壤(编号1-5),此夕卜，再称取0.5 g灭菌土(编号6)，分别放入15 mL灭菌离心管中，加入等重量的直径为0.5 _的小玻璃珠；其他步骤同实施例1，检测结果见图2。由图2可知，感染香蕉穿孔线虫的巴西蕉根际土壤DNA经过PCR检测有目的片段出现，而没有香蕉穿孔线虫的土壤DNA则未有检测到目的片段。实施例3从香蕉穿孔线虫和基质混合的样品中快速检测鉴定香蕉穿孔线虫
试验材料香蕉穿孔线虫的准备和获得同实施例1，基质购自广州芳村绿源园艺植物材料场。具体实施步骤如下
称取0. 5g基质，装入15mL灭菌离心管中，加入等重量的直径为0. 5mm的小玻璃珠。其他步骤同实施例I。检测结果见图3。实施例4直接从发生香蕉穿孔线虫病的孔雀竹芋根际基质中快速检测鉴定香蕉穿孔线虫
试验材料经鉴定发生香蕉穿孔病的孔雀竹芋根际土壤，采自华南农业大学花卉种植室。具体实施步骤如下
取发病孔雀竹芋根际基质土，充分混匀，称取5份，每份0. 5g基质土，编号1-5，此外，再称取0. 5g灭菌基质土，编号6，6份样品分别放入15mL灭菌离心管中，加入等重量的直径为0. 5mm的小玻璃珠。其他后续步骤同实施例I。检测结果电泳图见图4，由该图可知，感染香蕉穿孔线虫的孔雀竹芋根际基质土 DNA经过PCR检测有目的片段出现，而没有香蕉穿孔线虫的基质土 DNA则未有检测到目的片段。以上实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的保护范围不受上述实施例的任何限制，其他的任何不背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化 等，均应视为本发明等效的置换方式，包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种直接从土壤或其他基质中快速检测鉴定香蕉穿孔线虫的方法，其特征在于步骤如下 (1)待检样品中DNA提取 称取待检样品，与等重的直径O. 5mm玻璃珠一起移至尖底离心管中，加入体积比为I: I的磷酸缓冲液和SDS缓冲液，翻转3 4次； 再加入体积比为24:1的氯仿和异戊醇，振荡后以3 OOO rpm的速度离心，上清转移至一 I. 5 mL离心管； 加入预冷的醋酸钠，混匀，_20°C静置5min，常温离心，上清转移至另一新I. 5 mL离心管; 加入冷异丙醇，静置20min，离心，沉淀加入体积百分含量为70%的乙醇洗涤，离心，弃上清，重复洗涤一次，离心； 沉淀自然风干，加入超纯水静置lOmin，获得DNA粗提液； (2)使用Promega 公司的 Wizard DNA Clean-up Systems 试剂盒纯化步骤(I)的 DNA粗提液； (3)PCR检测以纯化的DNA为模板，SEQ ID NO: I 2所示核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，如果扩增出518bp的核苷酸序列，则证明待检样品中有香蕉穿孔线虫。
2.根据权利要求I所述直接从土壤或其他基质中快速检测鉴定香蕉穿孔线虫的方法，其特征在于步骤(3)所述PCR扩增反应使用的酶为TOYOBO公司的KOD FX酶。
3.根据权利要求2所述直接从土壤或其他基质中快速检测鉴定香蕉穿孔线虫的方法，其特征在于步骤(3)所述PCR扩增的反应体系为25PL :DNA模板5 PL，2XPCR buffer.12. 5 PL，2mmol/L 的 dNTP 5 μ , 10 MmoI/L 的 SEQ ID NO: I 引物 0.75 μ , 10 MmoI/L 的SEQ ID NO:2引物0. 75 μ , KOD FX酶O. 5 μ ，用三蒸水补足体积；反应程序为94°C预变性2 min，98°C变性10 s，50°C退火30 s，68°C延伸I min，从变性到延伸进行35个循环，然后72°C再充分延伸5 min。
全文摘要
本发明公开了一种直接从土壤或其他基质中快速检测鉴定香蕉穿孔线虫的方法，是先提取待检测样品中的DNA，经过Promega公司的WizardDNAClean-upSystems试剂盒纯化后作为模板，以SEQ ID NO:1～2所示序列为引物进行PCR扩增，如果能够扩增出518bp的目的条带，则证明待检测样品中含有香蕉穿孔线虫。该方法适用于香蕉栽培土壤或其他基质的检测，检测结果准确，灵敏度高，适用范围广，应用前景广阔。
文档编号C12Q1/68GK102703582SQ20121007201
公开日2012年10月3日 申请日期2012年3月19日 优先权日2012年3月19日
发明者刘一帆, 徐春玲, 李冬丽, 李静, 谢辉, 赵传波 申请人:华南农业大学