专利名称：一种用于生态土壤系统基质dna的提取方法
技术领域：
本发明属于土壤微生物学领域，具体涉及一种用于生态土壤系统基质DNA的提取 方法。
背景技术：
20世纪80年代以来，生态土壤系统受到广泛关注，在提高净化效率的同时，污染 物的去除已由经验工程走向定性、定量分析。在生态土壤系统中，由于长期种植植物，形成 了独特的基质微生物群落，它们积极参与系统基质物质转化过程，在污染物去除、植物养分 有效化和基质层结构的改良等方面起着重要作用，因此对基质微生物相进行深入研究具有 重要意义。研究者曾利用传统方法对土壤中的微生物进行了广泛研究，但近年来科学研究 发现自然界中绝大部分微生物不能纯培养。因此，20世纪80年代中期以来，一些微生物学 家开始通过免培养法，直接利用分子生物学的方法对环境中微生物的存在、群落结构、功能 等情况进行研究。免培养法的前提是提取土壤微生物总DNA。提取高质量的DNA是免培养 法的基础和关键。在提取土壤微生物总DNA时，不仅要最大限度地保证所提DNA的代表性， 而且要保证片段足够大、杂质少、适合后期的分子生物学操作。20世纪90年代，国内外在这 方面作了大量的研究，但目前常规抽提方法，如SDS-酚氯仿抽提法提取的DNA产量低且杂 质较多，特别是腐殖酸等杂质会严重影响后续的分子生物学实验操作，降低所得信息的精 确度。目前，随着分子生物学技术的应用范围越来越广，针对不同土壤类型微生物DNA提取 技术的研究迫在眉睫。本发明将为进一步研究生态土壤系统微生物分布与污染物去除率的 相关关系提供技术支持。
发明内容
本发明公开了一种用于定性、定量评价生态土壤系统基质功能菌的微生物基因组 DNA提取方法。本发明用于生态土壤系统基质DNA的提取方法，其步骤是
(1)在细胞裂解前对样品进行预处理称取土样，加入TE缓冲液，涡旋振荡1分钟，放入 超声波常温水浴10分钟，上清液中再加TE缓冲液，摇勻，在4°C，10，OOOXrpm下离心5分 钟，移去上清液；
(2)经过预处理后的土样中加入磷酸钠缓冲液和MT缓冲液，置于!^astft 印仪器上2 分钟，速度5. 5，冰上冷却后，在4°C，14，000 X g下离心15分钟，上清液中加入PPS试剂，在 4°C, 14, OOOXg下离心5分钟，上清液中加入Binding Matrix悬浮液，待蛋白质沉淀，移 去上清液，混合物转移至SPIN 滤管中，在4°C，14，000 X g下离心后，加入SEWS-M，在4°C， 14，OOOXg下离心，移去SPIN 滤管，放入试剂盒提供的试管中，室温干燥5分钟，加入DES 和重悬的DNA洗脱液体，在4°C，14，OOOXg下离心后转移洗脱的DNA到试管中进行浓度分 析，分离的DNA，贮存于-20°C。本发明的创新之处在于通过土壤预处理，去除腐殖质，提高DNA产量，所提取的基
3质微生物DNA可直接应用于分子操作，具有简便，重复性好，准确可靠的特点。
具体实施例方式供试土样为3种生态土壤系统基质，系统中种植植物分别为芦苇、菖蒲和茭白。实施例一SDS-酚氯仿抽提法
称取Ig 土壤样品，加入Irnl 0. lmol/1磷酸缓冲液(pH 8. 0)，加入直径为0. 1,0. 5和 5mm玻璃珠各0. 5g，振荡1分钟，溶菌酶5mg，终浓度为2. 5mg/ml，室温振荡15分钟，放置冰 箱30分钟，加125μ1 20%的SDS溶液振荡处理15分钟，离心，分装EP管，加酚(1 1体积) 抽提1次，氯仿-异戊醇(1:1体积)抽提2次，加0. 6体积异丙醇，室温放置1小时，离心， 70%乙醇清洗，200μ1 TE溶解。实施例二 本发明
在细胞裂解前对样品进行预处理，称取5g 土样，加入5ml TE缓冲液，涡旋振荡1分钟， 放入超声波常温水浴10分钟，上清液中再加5ml TE缓冲液，摇勻，在4°C，10，OOOXrpm下 离心5分钟，移去上清液。经过预处理后的土样中加入978μ1磷酸钠缓冲液(pH 8. 0分2次 加)，转移至Lysing Matrix E试管中(取自试剂盒)，再加入122μ1 MT缓冲液，置于i^astft·印 仪器上2分钟，速度5. 5，冰上冷却后，在4°C，14，OOOXg下离心15分钟，上清液中加入 250μ1 PPS试剂，在4°C，14，000 Xg下离心5分钟，上清液中加入Iml Binding Matrix悬 浮液，翻转混合，静置待蛋白质沉淀，移去上清液，混合物转移至SPIN 滤管(取自试剂盒) 中，在4°C，14，000 X g下离心2分钟后，加入500μ1 SEWS-M,在4°C，14，000 X g下离心1分 钟，移去SPIN 滤管，放入试管中，室温干燥5分钟，加入75μ1 DES和重悬的DNA洗脱液，在 414, OOOXg下离心1分钟后转移洗脱的DNA到试管中进行浓度分析，分离的DNA，贮存 于-20 0C ο基质DNA的提取结果对比见表1。由表1可知，本发明方法在DNA提取效率上表现 出很大的优势，提取的DNA产量平均值达到了 58. 68Pg/g 土，而SDS-酚氯仿抽提法DNA得 率相对较低。
权利要求
1. 一种用于生态土壤系统基质DNA的提取方法，其特征在于包括以下步骤(1)在细胞裂解前对样品进行预处理称取土样，加入TE缓冲液，涡旋振荡1分钟，放入 超声波常温水浴10分钟，上清液中再加TE缓冲液，摇勻，在4°C，10，OOOXrpm下离心5分 钟，移去上清液；(2)经过预处理后的土样中加入磷酸钠缓冲液和MT缓冲液，置于FastPr印仪器上2 分钟，速度5. 5，冰上冷却后，在4°C，14，000 X g下离心15分钟，上清液中加入PPS试剂，在 4°C, 14, OOOXg下离心5分钟，上清液中加入Binding Matrix悬浮液，待蛋白质沉淀，移 去上清液，混合物转移至SPIN 滤管中，在4°C，14，000 X g下离心后，加入SEWS-M，在4°C， 14，OOOXg下离心，移去SPIN 滤管，放入试剂盒提供的试管中，室温干燥5分钟，加入DES 和重悬的DNA洗脱液体，在4°C，14，OOOXg下离心后转移洗脱的DNA到试管中进行浓度分 析，分离的DNA，贮存于-20°C。
全文摘要
本发明属于土壤微生物学领域，具体涉及一种用于生态土壤系统基质DNA的提取方法。该方法是在细胞裂解前先对样品进行预处理，再将经过预处理后的土样中加入磷酸钠缓冲液和MT缓冲液，分离DNA。本发明通过土壤预处理，去除腐殖质，提高DNA产量，所提取的基质微生物DNA可直接应用于分子操作，具有简便，重复性好，准确可靠的特点。
文档编号C12N15/10GK102094004SQ201010589338
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者王延华 申请人:南京师范大学