专利名称：一种常染色体隐性遗传性共济失调相关基因的制作方法
技术领域：
本发明属于分子病理学领域，涉及一种常染色体隐性遗传性共济失调(autosomal recessive cerebellar ataxia, ARCA)亚型的相关基因CHIP(突变型)(下文中也称为 “CHIP基因”或“STUB1基因”)。本发明还涉及含有所述常染色体隐性遗传性共济失调亚型相关基因突变型的重组载体、含有该重组载体的重组细胞以及所述基因的编码蛋白。
背景技术：
常染色体隐性遗传共济失调(autosomalrecessive cerebellar ataxia, ARCA) 是一组罕见的、具有高度临床和遗传异质性的神经退行性疾病。目前已发现有近百种ARCA 亚型，其典型特征是多在30岁之前发病，根据种族不同其发病率约为I 4/10万。其临床表现多样，且不同亚型有着较大差异，可累及到神经、心血管、内分泌、骨骼等多个系统， 以平衡障碍、躯干或肢体的姿势或运动性震颤、构音障碍、吞咽困难、眩晕、复视等为主要表现，也可伴有其他多种表现，如视网膜病、周围神经病、不自主运动、认知功能障碍或癫痫
坐寸o按照ARCA已知的发病机制，主要可分为5种类型线粒体共济失调、代谢性共济失调、DNA修复损伤导致的共济失调、先天性共济失调和退行性共济失调。但尚有很多亚型无法归类到以上5个类别中。目前已克隆出ARCA不同亚型的50多种不同的致病基因，例如 FRDA、POLG、C10orf2、a_TTP、MTP、PHYH、PEX7、ATM、MREl 1A、APTX、SETX、TDPl、ATCAY、SACS、 SILl...但由于ARCA分类繁多，部分亚型仅有个例报道，且ARCA家系相对较少而且家系内患者较少，因此难以精确定位致病基因。新的致病基因的发现，有利于进一步研究发病机制及研发新药。CHIP 基因又名 STUBl (STIP1 homologous and u box-containing protein I),定位于16pl3. 3，含有7个编码区和2个非翻译区，mRNA全长1646bp，57 968bp是其开放阅读框，在不同物种进化过程中较为保守，编码一个由303个氨基酸残基构成的分子量大小为35KDa的CHIP蛋白单体。CHIP基因的编码产物热休克蛋白70羧基端作用蛋白(carboxyl terminus of Hsc70interacting protein, CHIP)是Ballinger CA.等人发现的同时具有辅助伴侣分子和泛素连接酶功能的蛋白质。CHIP蛋白几乎在所有的器官中都有表达，但在代谢活性高或蛋白质更新速度较快的器官组织如骨骼肌、心脏和脑中高表达，而在胰腺、肺、肝、胎盘和肾脏中的表达水平相对较低。CHIP蛋白由TPR、U_box及中间螺旋区等具有特征性的结构域组成，它通过TPR结构和热休克蛋白相互作用，而通过U-box实现泛素化连接酶功能。CHIP蛋白作为辅助分子伴侣蛋白和泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system, UPS)通路间的中间分子，将分子伴侣系统和UPS有效结合在一起，一旦分子伴侣系统恢复错误折叠蛋白失败， CHIP将发挥其泛素连接酶的功能将分子伴侣的底物泛素化，促进其降解，因此CHIP在选择异常蛋白质是否进行降解的过程中发挥了重要的作用。蛋白质的错误折叠和聚集是很多神经退行性疾病共有的病理特征，因此CHIP与帕金森氏病、阿尔茨海默病、遗传性共济失调等疾病的发生有着密切的关系。此外，CHIP作为TGF-P /BMP信号途径中关键调节因子 Smads的相互作用蛋白，可能在TGF-P信号传导途径中发挥重要作用。CHIP还与p53、ASKl 激酶、雄激素/雌激素的代谢和功能有着紧密的联系。
目前为止，尚未发现CHIP基因突变与某种特异性的疾病直接相关。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的ARCA亚型的致病基因的5种突变基因型，提供含有所述ARCA亚型致病基因CHIP突变型的重组载体、含有上述重组载体的重组细胞、所述 ARCA相关基因的编码蛋白以及能够检测突变基因型的试剂盒。发明人应用全基因组外显子测序结合候选基因筛查的方法在一个ARCA家系(A家系)中发现一种ARCA亚型相关基因CHIP的一种新的突变——CHIP基因三号外显子区域
c.493C > T(P. L165F)的纯合突变，导致其493位碱基C突变为T，其编码蛋白氨基酸序列第165位的亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)，具体序列如SEQ ID NO :2所示。该氨基酸位点位于CHIP蛋白的TPR和Ubox中间的链接区域。此两点正常基因组参考序列为C，患者两点均突变为T。通过对家系所有成员进行CHIP基因突变检测，发现A家系中的其他患者均有该位点纯合突变，而家系中部分正常人为该位点杂合突变，为携带者，说明CHIP基因突变在该家系中与疾病表型共分离。发明人又对另外两个ARCA家系，进行CHIP基因的突变检测，其中B家系中发现 CHIP基因的另外两种新的突变——第一个位点c. 389A > T (P. N130I)，其389位碱基A突变为T，其编码蛋白氨基酸序列中第130位的天冬酰胺(N)突变为异亮氨酸(I)，具体序列如SEQ ID N0:3所示。其编码的氨基酸天冬酰胺及其附近位点位于保守区域；第二个位点
c.441G > T (P. W147C)，其441位碱基G突变为T，导致CHIP基因编码的氨基酸序列中第147 位的色氨酸(W)突变为半胱氨酸(C)。具体序列如SEQ ID N0:4所示。其编码的氨基酸色氨酸及其附近位点位于保守区域。患者c. 389A > T(P. N130I)和c. 441G > T(P. W147C) 复合杂合突变，患者父亲和弟弟c. 389A > T(P. N130I)杂合突变；患者母亲c. 441G >T(P. W147C)杂合突变。在C家系中也发现了两种新的突变——第一个位点C.621C > G(P.Y207X)，导致其621位C突变为G，发生截短突变，使得CHIP基因转录的mRNA中编码第207位的酪氨酸 (Y)的密码子突变为终止密码子。具体序列如SEQ ID N0:5所示。第二个位点在c. 707G > C(P. S236T)，其707位G突变为C，导致CHIP基因编码的氨基酸序列中第236位的丝氨酸
(S)突变为苏氨酸(T)。具体序列如SEQ ID N0:6所示。患者为两位点复合杂合突变，患者弟弟和母亲为c. 707G > C(P. S236T)杂合突变，患者父亲为c. 621C > G(P. Y207X)杂合突变，家系中其余正常人未发现突变。说明CHIP基因突变在该家系中与疾病表型共分离。随后的500名正常人的CHIP基因突变检测中未发现上述突变，排除了单个核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)的可能性,从而确定CHIP基因是一种 ARCA亚型的致病基因。正常人的CHIP基因序列如SEQ ID NO 1所示。本发明提供了一种如SEQ ID NO :2所示的人类CHIP基因突变序列，所述CHIP基因第493位碱基C突变为T。进一步，本发明提供了一种如SEQ ID NO :3所示的人类CHIP基因突变序列，所述 CHIP基因第389位碱基A突变为T。进一步，本发明提供了一种如SEQ ID NO :4所示的人类CHIP基因突变序列，所述 CHIP基因第441位碱基G突变为T。进一步，本发明提供了一种如SEQ ID NO :5所示的人类CHIP基因突变序列，所述 CHIP基因第621位碱基C突变为G。进一步，本发明提供了 一种如SEQ ID NO :6所示的人类CHIP基因突变序列，所述 CHIP基因第707位碱基G突变为C。正常CHIP基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。本发明提供了如SEQ ID NO. 2所示基因突变序列对应的氨基酸序列(SEQ ID NO. 8)，所述氨基酸序列第165位的亮氨酸(L)突变为苯丙氨酸(F)。进一步，本发明提供了如SEQ ID NO. 3所示基因突变序列对应的氨基酸序列(SEQ ID NO. 9)，所述氨基酸序列第130位的天冬酰胺(N)突变为异亮氨酸(I)进一步，本发明提供了如SEQ ID NO. 4所示基因突变序列对应的氨基酸序列(SEQ ID NO. 10)，所述氨基酸序列第147位的色氨酸(W)突变为半胱氨酸(C)。进一步，本发明提供了如SEQ ID NO. 5所示基因突变序列对应的氨基酸序列(SEQ ID NO. 11)，所述氨基酸序列于第207位的原本为酪氨酸(Y)处提前终止。进一步，本发明提供了如SEQ ID NO. 6所示基因突变序列对应的氨基酸序列(SEQ ID NO. 12)，所述氨基酸序列第236位的丝氨酸(S)突变为苏氨酸(T)。进一步，本发明提供了一种检测上述CHIP基因突变型的方法，包括如下步骤(I)对基因材料进行聚合酶链扩增反应，获取产物；(2)对产物进行核苷酸序列测定，以确定所述生物样本中是否含有CHIP基因的突变；其中，步骤(I)中所述聚合酶链扩增反应采用的扩增引物对选自SEQ ID NO. 2、3、
4、5和6表示的序列中突变位点前后15-30bp长的序列，优选为如SEQ ID NO 13-22所示的序列；本领域技术人员还可以根据聚合酶链扩增反应的要求，设计更多种的引物，以扩增出包含本发明所述变异的核苷酸序列。聚合酶链扩增反应程序为(1)用SEQ ID NO. 13-16 所示序列的引物对来检测CHIP基因的I号和2号外显子，其反应条件为94°C热启动2min， 再按以下的过程循环33次94°C变性30s，然后降温至64°C退火30s，72°C 30s。再保持 72°C 7min，然后降至4°C保持；(2)用SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 18所示序列的引物对来检测CHIP基因的3号外显子，其反应条件为94°C热启动2min，再按以下的过程循环32次 94°C变性30s，然后降温至58°C退火30s，72°C 30s。再保持72°C 7min，然后降至4°C保持；
(3)用SEQ ID NO. 16和SEQ ID NO. 20所示序列的引物对来检测CHIP基因的4、5、6号外显子，其反应条件为94°C热启动2min，再按以下的过程循环33次94°C变性30s，然后降温至61°C退火30s，72°C 45s。再保持72°C 7min，然后降至4°C保持；⑷用SEQ ID NO. 21和 SEQ ID NO. 22所示序列的引物对来检测CHIP基因的7号外显子，其反应条件为94°C热启动2min，再按以下的过程循环33次94°C变性30s，然后降温至62°C退火30s，72°C 30s。再保持72°C 7min，然后降至4°C保持。
进一步，本发明提供了一种检测上述CHIP基因突变型的试剂盒，包括聚合酶链反应试剂，如dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液；聚合酶链反应扩增体系中所适应的引物对，序列如SEQ ID NO :13-22所示。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，例如，所述的引物可以依据已知的核苷酸序列设计，通常为15-30个碱基，GC含量为 45-50%左右，在适当的温度下与末端特异性结合，其可利用专门的计算机程序设计，所述的用于PCR反应的DNA聚合酶是能够用于PCR扩增的酶。试剂盒的反应体系为(1)用SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14所示序列的引物对来检测CHIP基因的I号外显子，其反应体系为每组分用量LA tag酶0. lul，正反向引物分别为0. 2ul，gDNA模板(50ng/ul) lul, ddH20
3.lul, dNTPs 0.4ul，2XGC bufferl 5ul。(2)分别用 SEQ ID NO. 15-22 所示序列的引物对来检测CHIP基因的2-7号外显子，其反应体系为每组分用量SYBR酶7. 5ul，正反向引物分别为 0. 75ul, gDNA 模板(50ng/ul) I. 5ul, ddH20 4. 5ul。本发明还提供了含有CHIP突变型基因的重组载体以及含有重组 载体的重组宿主细胞，其中，重组载体由空载体p3x-flag—CMV-myC-24和插入该空载体的CHIP突变型基因组成；重组宿主细胞的宿主细胞为HEK293细胞。人工拼接合成CHIP野生型基因DNA双链片段(SEQ ID NO. I)后，在其两端分别添加酶切位点，其序列分别为SEQ ID NO. 31和SEQ ID NO. 32。用Nestled PCR的方法分别合成5种CHIP突变型基因DNA片段。之后将CHIP野生型和突变型基因DNA片段分别转导入质粒p3x-flag—CMV-myC-24中，然后用相同质粒浓度的 p3x_flag—CMV-myc-24 空载体，p3x_flag-CMV-myc-24-chip 野生型质粒及 5 种 CHIP 突变型的质粒转染J1EK293细胞。最后对转染后的HEK293细胞进行检测。 在HEK293细胞中转染了相同质粒浓度的p3x_f lag—CMV-myc-24空载体， p3x-flag-CMV-myc-24-chip野生型质粒及5种CHIP突变型的质粒，转染48h后提取蛋白， western-blot检测flag-chip融合蛋白的表达。结果显示CHIP基因突变型的蛋白表达水平与野生型相同。SODl (G85R)是E3连接酶CHIP的已知底物(文献已报道)，在EGFP-S0D1 (G85R) 的稳定表达细胞系J1EK293细胞中，转染野生型CHIP可导致EGFP-S0D1(G85R)降解。但转染5种CHIP突变型的细胞组降解EGFP-S0D1 (G85R)的能力下降，底物表达水平高于转染野生型CHIP质粒组。将转染了 CHIP (SEQ ID NO. I)及其突变体(SEQ ID NO. 2、3、4、5、6)的质粒分别转染RFP-SODl (G85R)的稳定表达细胞系HEK293细胞，发现CHIP及其突变体均表达在细胞质中，且和RFP-SODl (G85R)均存在共定位。在EGFP-SODI (G85R)的稳定表达细胞系中，相同质粒浓度的 p3x-f lag—CMV-myc-24 空载体，p3x_f lag-CMV-myc-24-chip 野生型质粒及 5 种 CHIP 突变型质粒，转染24h后，用5mM MG132处理16小时后，用GFP抗体进行免疫共沉淀实验，转染野生型CHIP (SEQ ID NO. I)的细胞中能增加EGFP-S0D1(G85R)的多聚泛素链，而转染其他突变体的细胞则能减少其多聚泛素链，同时能看到底物EGFP-S0D1 (G85R)和野生型CHIP是结合的，而SEQ ID NO. 8所示的CHIP突变型结合底物的能力下降，SEQ ID NO. 11所示CHIP 突变型则不能结合底物EGFP-SODI (G85R)。根据本发明提供的CHIP基因序列变异的位点，应用本发明的试剂盒，对三个ARCA 家系中的个体进行了检测。结果显示一个家系所有的ARCA患者都具有SEQ ID NO. 2所示纯合突变，先证者父亲、母亲、奶奶、哥哥为SEQ ID NO. 2所示杂合突变；一个家系中的ARCA患者具有SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示的复合杂合突变，其父亲和弟弟具有SEQ ID NO. 3 所示杂合突变，其母亲具有SEQ ID NO. 4所示杂合突变；还有一个家系中的ARCA患者具有 SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示的复合杂合突变，其弟弟和母亲具有SEQ ID NO. 6所示杂合突变，其父亲具有SEQ ID NO. 5所示的杂合突变。而各家系其余正常人个体和500名正常对照都没有上述突变。
本发明首次发现了 CHIP基因突变可以导致ARCA的发病。本发明首次发现并克隆了 ARCA亚型的致病基因CHIP的5种突变基因型，对ARCA 的发病机制的研究以及诊断、产前诊断和治疗提供了分子理论基础。同时对这种ARCA亚型致病基因CHIP的野生及突变型分子功能的研究也可以为CHIP的其他相关功能如其在信号传导途径中的作用等的研究提供新的思路。本发明的试剂盒能简便、快捷、高效地检测CHIP的5种基因突变型。
图I为突变序列SEQ ID NO. 2的示意图；图2为突变序列SEQ ID NO. 3和4的不意图；图3为突变序列SEQ ID NO. 5和6的不意图；图4为A、B、C三个家系的家系图；图5为CHIP野生型及其突变型蛋白在细胞中的表达水平；图6为CHIP野生型及其突变型蛋白降解底物能力示意图；图7为CHIP野生型及其突变型蛋白结合底物的能力及其泛素连接酶功能研究示意图；图8为CHIP野生型及其突变型蛋白的亚细胞定位及与底物RFP-SODl (G85R)共定位示意图。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明进行更为详细的描述，但是以下描述仅用于对本发明进行解释性说明，并不对本发明的保护范围进行任何的限制，本发明的保护范围仅以权利要求书限定的范围为准。实施例I :CHIP基因突变chrol6 :671573 ;1，C/T的检测方法(I)标本采集与处理。发明人对家系A中5名正常人(男3名、女2名)、4名ARCA 患者(男I名，女3名)进行详细的病史、家族史的调查及全面的体格检查和相关辅助检查。 在签署知情同意书以后，每人取肘静脉血10ml(枸橼酸钠抗凝)，4°C保存，两周内依照《分子克隆》第二版从血液中提取DNA的方法提取DNA。(2)对样本DNA目标片段进行PCR体外扩增。根据ARCA相关基因序列SED ID NO. 23设计如下引物；正向引物；F:5’ -GACGGGCAGTCTGTGAAGG-3’ (SED ID NO. 13)反向引物；R:5’ -CATCACCCTCGTGGTTTCG-3，(SED ID NO. 14)反应体系和反应条件如下表1、2所示
表IPCR反应体系
权利要求
1.一种分离的常染色体隐性遗传性共济失调相关基因突变型，其具有SEQ ID NO. 2、3、 4、5或6所示的序列。
2.一种分离的蛋白，具有SEQ ID NO 8、9、10、11或12表示的氨基酸序列。
3.—种检测权利要求I所述基因突变型的方法，包括如下步骤(1)对基因材料进行聚合酶链扩增反应，获取产物；(2)对产物进行核苷酸序列测定；其中，步骤(I)所采用的扩增引物对选自SEQ ID NO. 2、3、4、5和6表示的序列中突变位点前后15-30bp长的序列。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤(I)所采用的扩增引物对选自 SEQ ID NO. 13-22所示的序列。
5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，其聚合酶链扩增反应程序为用SEQ ID NO. 13-16所示序列的引物对来检测CHIP基因的I号和2号外显子时，其反应条件为94°C热启动2min，再按以下的过程循环33次94°C变性30s，然后降温至64°C退火30s，72°C 30s ;再保持72°C 7min，然后降至4°C保持；用SEQ ID NO. 17和SEQ ID NO. 18所示序列的引物对来检测CHIP基因的3号外显子时，其反应条件为94°C热启动2min，再按以下的过程循环32次94°C变性30s，然后降温至 58°C退火30s，72°C 30s ;再保持72°C 7min，然后降至4°C保持；用SEQ ID NO. 19和SEQ ID NO. 20所示序列的引物对来检测CHIP基因的4、5、6号外显子时，其反应条件为94°C热启动2min，再按以下的过程循环33次94°C变性30s，然后降温至61°C退火30s，72°C 45s ;再保持72°C 7min，然后降至4°C保持；用SEQ ID NO. 21和SEQ ID NO. 22所示序列的引物对来检测CHIP基因的I号外显子时，其反应条件为94°C热启动2min，再按以下的过程循环33次94°C变性30s，然后降温至 62°C退火30s，72°C 30s ;再保持72°C 7min，然后降至4°C保持。
6.一种用于检测权利要求I所述基因突变型的检测试剂盒，其特征在于，引物对选自 SEQ ID NO. 2、3、4、5和6表示的序列中突变位点前后15-30bp长的序列中至少一对引物对。
7.一种用于检测权利要求I所述基因突变型的检测试剂盒，其特征在于，含有的引物对为SEQ ID NO. 13-22所示的序列中至少一对引物对。
8.按照权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，其反应体系如下用SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14所示序列的引物对来检测CHIP基因的I号外显子时，其反应体系为每组分用量LA tag酶0. lul，正反向引物分别为0. 2ul，gDNA模板(50ng/ ul) lul, ddH20 3. lul, dNTPs 0. 4ul,2XGC bufferl 5ul ；分别用SEQ ID NO. 15-22所示序列的引物对来检测CHIP基因的2-7号外显子时， 其反应体系为每组分用量SYBR酶7. 5ul，正反向引物分别为0. 75ul，gDNA模板(50ng/ ul) I. 5ul, ddH20 4. 5ul。
9.一种重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，其特征在于，所述空载体为p3X-flag—CMV-myc-24，所述目的基因为权利要求I所述的突变型序列。
10.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述重组宿主细胞含有权利要求9所述的重组载体，所述宿主细胞为HEK293。
全文摘要
本发明公开了一种新的ARCA亚型的致病基因的5种突变基因型，还公开了含有所述ARCA亚型致病基因CHIP突变型的重组载体、含有上述重组载体的重组细胞、所述ARCA相关基因的编码蛋白以及能够检测突变基因型的试剂盒。
文档编号C12N5/10GK102618559SQ20121007249
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月19日 优先权日2012年3月19日
发明者唐北沙, 夏昆, 李家大, 江泓, 王俊岭 申请人:中南大学湘雅医院