专利名称：与番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2连锁的分子标记方法
技术领域：
本发明涉及与番茄黄化曲叶病抗性基因Ty-2相连锁的分子标记方法，属于农业生物技术工程领域。
背景技术：
番爺黄化曲叶病毒病(Tomato yellow leaf curl disease TYIXD)是番爺上的重要病害，该病害是由双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)的番爺黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus TYLCV)引起的。该病害首次是在以色列发现的，随着栽培历史的延伸，加之全球气候变暖、国际间贸易活动加强和烟粉虱介体在世界各地扩展，该病害对世界范围内的番茄生产造成严重危害，主要集中于热带和亚热带地区，目前已在地中海地区、美国南部地区、日本、加勒比海等众多国家和地区发生。20世纪 90年代传入我国，目前,广东、广西、浙江、上海、江苏、安徽、云南、山东、北京、河南等地相继发生并给当地番茄生产造成巨大的损失。番茄黄化曲叶病毒病一旦发生，化学防治难以奏效，只有种植抗病品种才是最根本有效的防治方法。最为严重的是，我国现有栽培品种对番茄黄化曲叶病毒病均不表现抗性。因此，培育适合我国种植的、抗番茄黄化曲叶病的番茄新品种刻不容缓。传统番茄育种方法中，选育抗病材料是通过接种鉴定，根据植株的表型进行筛选。该方法会因为接种不充分或发病条件不适宜而影响选择效率，难以准确、快速地筛选出具有抗病基因的个体植株。另外番茄黄化曲叶病抗性基因全部来自野生番茄(Pilowsky 等，1974)，抗病基因常与不良性状基因紧密连锁。利用传统育种方法打破不良连锁所需的群体大、周期长、效率低，而分子标记技术的发展与应用，为实施品种分子设计提供了重要的技术支撑，利用分子标记辅助选择育种可以节省一半以上的时间。SSR标记是以SSR多态性为基础的遗传标记，均匀、随机、广泛分布在整个基因组， 已广泛应用于遗传图谱构建、品种指纹图谱绘制、品种纯度检测及目标性状分子标记筛选等领域。本发明采用BSA方法和SSR技术，筛选与黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2紧密连锁的标记，以实现黄化曲叶病毒病抗性的标记辅助育种，加速我国抗番茄黄化曲叶病毒病番茄新品种的选育进程。
三、发明内容技术问题
本发明针对上述情况，应用分子生物学方法以含有Ty-2抗性基因的、抗TYLCV的番茄自交系CLN2777A为材料，筛选和寻找新的、稳定存在的与TYLCV抗性基因Ty-2紧密连锁的分子标记，用于抗TYLCV标记辅助选择育种。技术方案
一种与番爺黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2连锁的分子标记引物,其特征在于 正向引物序列为 GCCTTTTCCCACTTATATTCCTCTC 反向引物序列为ACACATACGACGTTCCGTCA
上述引物用于番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2的分子标记方法为
1)番爺基因组DNA的提取；
2)用所述引物对番茄基因组DNA进行PCR扩增；
a、PCR反应体系模板 DNA IOng/μ Ιμ ;引物对 4 pmmol/L I. O μ I ； 10XPCR Buffer I. 0μ I ；25mmol/L MgCl2I. 0 μ I ; lOmmol/L dNTPsO. 25 μ I ； 5U/μ I rTaq DNA Polymerase 0. I μ I ；ddH20 5. 65 μ I ；
b、反应程序94°C预变性5min;每个循环94°C变性30 sec，56°C退火45 sec, 72 °C 延伸I min,共36个循环,最后72°C延伸10 min。3)对PCR扩增产物进行电泳，如果有178bp的分子标记谱带，则为抗病植株，表明番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2存在。
有益效果
TYIXD是目前我国番茄生产上威胁最为严重的病害之一。本发明利用SSR技术和BSA法筛选得到的与Ty-2抗性基因连锁的SSR分子标记， 标记带型简单，可直接应用于标记辅助选择。 该标记是一个基于PCR技术的共显性标记，跟RFLP、AFLP等标记相比，可显著降低成本，节省劳力。将该标记应用于苗期选择，不仅可以减少工作量，而且能够避免因接种不充分难以准确筛选出具有抗病基因的个体植株，从而加速育种进程。
四
图I SSR标记TES0344在亲本间和抗感病组间的扩增情况
(M 100bp Marker I ； Pl :抗病亲本CLN2777A ；P2 :感病亲本TMXA48-4-0 ;1_5 :F2 抗病单株；6-10 F2感病单株)
图2 SSR标记TES0344在F2群体中的验证
(M 50bp marker ;1_10 F2代抗病单株11-20 F2代感病单株)
图3 SSR标记TES0344在11份自交系材料中的验证
(M 50bp 分子量标准 I: CLN2762A 2: CLN2764A 3: CLN2768A 4:CLN2777A 5:CLN2777B 6:CLN2777C 7:CLN2777E 8:CLN2777F 9:CLN2777G 10:CLN2777H 11: CLN2026D)
五具体实施例方式
I.供试材料
应用抗病系CLN2777A (见参考文献与抗TYLCV基因连锁的AFLP标记筛选及CAPS标记的转化·江苏农业学报，2011,27 (5):1047-1052)为父本，感病系TMXA48-4-0 (见参考文献与抗TYLCV基因连锁的AFLP标记筛选及CAPS标记的转化.江苏农业学报，2011， 27 (5):1047-1052)为母本配置杂交组合，得到F1后，再自交得到F2分离群体，利用苗期人工烟粉虱(见参考文献与抗TYLCV基因连锁的AFLP标记筛选及CAPS标记的转化.江苏农业学报，2011,27 (5) :1047-1052)接种鉴定。具体做法是挑选饱满的番茄种子播于苗床上，幼苗达到2叶I心时分苗。待番茄幼苗长至四叶一心时，转到饲养烟粉虱的纱网笼中，进行病毒接种。接种7d后喷施杀虫剂， 随后将番茄幼苗定植于田间。定植4周后调查群体发病情况，病情调查分级为0=没有明显症状；1=叶缘轻微黄化；2=叶片明显黄化卷曲，植株仍生长；3=叶片严重黄化卷曲皱缩，植株停止生长。
2.基因组DNA的提取
番茄叶片研磨后立即加入预热至65°C的O. 6ml 2%CTAB抽提缓冲液中，在65°C水浴中提取30min，这期间轻轻倒置样品试管3次。打开试管加入O. 6ml的氯仿-异戊醇(24 :1)， 轻轻翻转，使两者混合均匀，放入离心机中10 000 rpm离心10 min。移液器轻轻地吸取上清夜，转入另一个新试管中。然后加入等体积的经过预冷的异丙醇，轻轻摇勻，12000 rpm 离心10 min后将上清夜移去，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上。 60 sec后，直立离心管，加入500 μ 的75%乙醇，漂洗2次，将试管置于室温下晾干，加入 50 μ 灭菌无离子水，使DNA溶解，置于-20°C保存、备用。
3.SSR分子标记的分析 A.抗感基因池构建
采用BSA法分别构建抗病基因池和感病基因池，用于SSR多态性引物的筛选。提取F2 单株DNA后，选取极端抗病和感病的各5个单株DNA等量混合。B. SSR多态性引物筛选
Hanson等将Ty-2定位在11号染色体长臂上TG36和TG393标记之间(Hanson PM, et al. Mapping a wild tomato introgression associated with tomato yellow leaf curl virus resistance in a cultivated tomato line .J Am Soc Hortic Sci, 2000, 15:15 -20)。本发明根据该定位结果及Kenta Shirasawa (Kenta Shirasawa, et al. An interspecific linkage map of SSR and intronic polymorphism markers in tomato. Theor Appl Genet. 2010 (121) : 731-739)构建的番茄SSR遗传图谱，在11号染色体末端 TG36 到 TG393 区间内查找到 7 个 SSR 标记,从 http://www. kazusa. or. jp/tomato/ 下载引物序列，委托上海生工合成。SSR标记的PCR反应体系为模板DNA IOng/μ 1μ I ； 引物对 4 pmmol/L I. O μ I ； 10XPCR Buffer I. 0 μ I ;25mmol/L MgCl2L 0 μ I ; lOmmol/L dNTPsO. 25 μ I ; 5U/ μ I rTaq DNA Polymerase 0. I μ I ；ddH20 5. 65 μ I。PCR 反应程序为94°C预变性5 min;每个循环94°C变性30 sec，56°C退火45 sec，72°C延伸I min， 共36个循环，最后72°C延伸10 min。PCR产物在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行分离鉴定，银染显色，然后在可见投射仪上观察、记录实验结果。B.结果与分析
利用上述7对SSR引物在抗性亲本CLN2777A和感病亲本TMXA48-4-0间进行多态性筛选，结果只有一对引物TES0344能够在抗感亲本中扩增出多态性，将该引物对接种后构建的抗病/感病池及F2群体进一步进行扩增鉴定，扩增的多态性稳定。分子标记筛选结果表明，I个SSR标记与番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2紧密连锁，能够扩增出178bp的片段。该标记的引物为TES0344
TES0344F GCCTTTTCCCACTTATATTCCTCTC TES0344R ACACATACGACGTTCCGTCA
即用引物TES0344扩增含有黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2的育种材料DNA，如果能扩增出178bp的片段，则标志着Ty-2基因的存在。通过对含有Ty-2的抗病亲本CLN2777A、感病亲本TMXA48-4-0杂交和自交得到的F2代290个单株田间调查结果和分子标记图谱数据进行连锁分析(分析软件MAPMARKER (Version 3.0))，发现所筛选到的标记与番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2紧密连锁(见图2)，连锁距离(7. 8 cM)。为了检验该标记的可靠性，本实验应用10份抗病自交系材料和I份感病自交系材料(所用自交系材料名称及基因类型详见表1，见参考文献与抗TYLCV基因连锁的AFLP标记筛选及CAPS标记的转化.江苏农业学报，2011,27 (5) :1047-1052)进行了验证，结果如图3所示，感病材料09-S-NJ-12 PCR扩增出194bp的条带，10份抗病材料中有9份(基因型均为Ty-2/Ty-2)能够扩增出178bp的条带，只有抗病材料09-S-NJ-10 (基因型为Ty-2/ ty-2)能够同时扩增出194bp和178bp两条带，抗性表型与标记基因型完全一致，进一步说明将该标记应用于分子标记辅助选择育种是可行的。上述实施用来解释说明本发明，而不是对本发明进限制，在被发明的精神权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
表I验证标记可靠性所用的番茄材料
材料名称基因型
权利要求
1.一种与番爺黄化曲叶病毒病抗性基因Ty_2连锁的分子标记引物,其特征在于 正向引物序列GCCTTTTCCCACTTATATTCCTCTC反向引物序列ACACATACGACGTTCCGTCA权利要求I所述引物用于番茄黄化曲叶病毒病抗性基因的分子标记方法，其特征是1)番爺基因组DNA的提取；2)用权利要求I所述引物对番茄基因组DNA进行PCR扩增；3)对PCR扩增产物进行电泳，如果有178bp的分子标记谱带，则为抗病植株，表明番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2存在。
2.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述步骤2)的PCR扩增反应中a、PCR反应体系模板 DNA IOng/μ Ιμ ;引物对 4 pmmol/L I. O μ I ； 10XPCR Buffer I. 0μ I ；25mmol/L MgCl2I. 0 μ I ; lOmmol/L dNTPsO. 25 μ I ； 5U/μ I rTaq DNA Polymerase 0. I μ I ；ddH20 5. 65 μ I ；b、反应程序94°C预变性5min;每个循环94°C变性30 sec，56°C退火45 sec，72°C 延伸I min，共36个循环，最后72。<3延伸10 min。
全文摘要
本发明公开了一种与番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2连锁的分子标记方法，属于农业生物技术工程领域。用与番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2连锁的分子标记引物番茄基因组DNA进行PCR扩增；如果有178bp的分子标记谱带，则为抗病植株，表明番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2存在。将该标记应用于标记辅助选择育种中，可以克服常规育种中番茄黄化曲叶病毒病抗性鉴定稳定性和重复性较差、费时费力等缺点，进而加快抗番茄黄化曲叶病毒病番茄新品种的育种进程。
文档编号C12Q1/68GK102604941SQ201210073489
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月20日 优先权日2012年3月20日
发明者余文贵, 杨玛丽, 赵丽萍, 赵统敏 申请人:江苏省农业科学院