专利名称：一种Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种转基因动物模型的制备方法，尤其涉及一种Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型的制备方法。
背景技术：
耳聋是导致言语交流障碍的常见致残疾病。耳聋不但严重阻碍儿童的言语、认知发育和学习发展，也给成年和老年人的工作、生活、人际交往带来严重影响，已成为世界性的公共卫生问题。它不但影响个人及家庭，而且给全社会带来沉重的负担。据WHO 2005年估计全球听力残疾人达2. 78亿，占世界总人口 4. 6% ;80%的听力残疾人生活在中、低收入国家。2006年我国第二次残疾人抽样调查结果显示各类残疾人的总数为8296万，其中听力言语残疾者达2780万，占残疾人总数的33. 52%。在新生儿中耳聋的发病率约为1/1000， 其中一半以上是由于遗传因素造成的，以常染色体隐性遗传为多见[参见胡浩，部玲仟， 梁德生，夏家辉.非综合征型感音神经性聋相关基因研究进展.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2005，40(8) =633-637.孙悍军，袁慧军，韩东一.非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的研究进展.中华耳科学杂志，2005，3 (2) :150-156.]。耳聋的发病率随年龄的增长而增长，据估计45岁以下大约有5%，而80岁以上有大约50%的人群患有听力障碍，究其病因， 仍是遗传因素占主导地位[参见孙悍军，袁慧军，韩东一.非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的研究进展.中华耳科学杂志，2005，3 (2) :150-156.]。在目前的耳聋患者中有约占 50%的患者为遗传性耳聋，而遗传性耳聋中又有超过50%是由单一基因的突变造成的。遗传性耳聋分为综合征型(Syndrome deafness)和非综合征型(Non-syndrome deafness)两类(http://hereditaryhearingloss.org)。综合征型耳聋伴有其它症状，70%的遗传听力减退不伴有其它症状，故称为非综合征型耳聋。非综合征型耳聋的遗传模式有常染色体显性(autosomal-dominant, DFNA)、常染色体隐性(autosomal-recesive, DFNB)、X 连锁，Y 连锁及线粒体遗传5种。目前已有54个常染色体显性位点(DFNA)、71个隐性位点(DFNB)、5 个X连锁以及I个Y连锁位点被发现。在这54个常染色体显性耳聋(DFNA)位点中，成功克隆的耳聋基因只有 25 个(http://hereditaryhearingloss. org)。2000年7月，王晓东实验小组首次报道从HeLa细胞中分离出一种新型线粒体蛋白质，命名为第2个线粒体衍生的胱胺酸蛋白酶激活剂，即Smac (second mitochondria-derived activator of caspase)[参见Du C, Fang M, Li Y, Li L, Wang X， Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition. Cell，2000，102 :33-42.]。同时，Vaux 实验小组报道从293T细胞中分离出一种蛋白质，命名为低等电点凋亡抑制蛋白(IAPs)直接结合蛋白(direct IAP binding protein with low PI, DIABLO)经过对比分析 Smae 和 DIABLO 完全等同，合并称为 Smac/DIABLO[参见Verhagen AM, Ekert PG, Pakusch M, Silke J，Connolly LM, Reid GE，Moritz RL, Simpson RJ, Vaux DL Identification of DIABL0，amammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins. Cell，2000，102 (I) :43-53.]。免疫分析确定 Smac/DIABLO 定位于线粒体内，参与线粒体途径的凋亡。当细胞受到凋亡剌激(包括抗癌药物、电离辐射、化学信号和DNA 损伤)时，伴随细胞色素C由线粒体释放到胞质中，与抑制caspase活性的凋亡抑制蛋白家族(IAPs)作用，达到促进凋亡的作用(参见Espinosa M，Cantu D，Lopez CM，De Ia Garza JG，Maldonado VA, Melendez-Zajgla J. SMAC is expressed de novo in a subset of cervical cancer tumors. BMC Cancer，2004，4 :84.)。Smac/DIABLO 可与现已发现的所有IAPs结合消除凋亡蛋白抑制物的作用以提高caspase活性，其功能与果蝇凋亡蛋白 ReaPer、Hid、Grim 相似，但其基因顺序明显不同[参见Vucic D, Franklin MC, Wallweber HJ, Das K，Eckelman BP, Shin H，Elliott L0, KadkhodayanS, Deshayes K，Salvesen GS, Fairbrother WJ. Engineering ML-IAP to produce an extraordinarily potent caspase 9inhibitor !implications for Smac—dependent anti—apoptotic activity of ML-IAP. Biochem J，2005，385(Pt I) :11-20 ;Silke J, Verhagen AM, Ekert PG, Vaux DL. Sequence as well as functional similarity for DIABLO/Smac and Grim，Reaper and Hid Cell Death Differ, 2000, (12) :1275. ]D Smac/DIABLO是线粒体中的正常蛋白，在细胞凋亡时 Smac/DIABLO释放入细胞浆中，Smac/DIABLO的促凋亡活性需线粒体的参与。Smac/DIABLO 的过度表达可提高细胞对凋亡剌激如紫外线照射、化疗药物等的敏感性。Smac/DIABLO多妝包含239个氨基酸，经PCR及westernblot、northernblot检测，Smac/DIABLO在人正常组织心、肝、肾、脾、前列腺、胸腺、肠等中有较高度表达[参见Du C，Fang M，Li Y，Li L， Wang X. Smac,amitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition. Cell，2000，102 :33-42.]。Cheng 等(2011)[参见Cheng J，Zhu Y, He S, Lu Y，Chen J, Han B, Petrillo M， Wrzeszczynski K0，Yang S，Dai P，Zhai S，Han D，Zhang MQ,Li W,Liu X，Li H，Chen ZY, Yuan H. Functional mutation of SMAC/DIABLO,encoding a mitochondrial proapoptotic protein,causes human progressive hearing loss DFNA64. Am J Hum Genet，2011，89(I) 56-66.]研究发现Smac/DIABLO包含7个外显子，同时发现在人类的胚胎组织(妊娠17周) 中Smac/DIABLO广泛表达，高表达在睾丸、肾上腺和耳中。在发育的小鼠耳蜗中，从E18. 5 到PO Smac/DIABLO在毛细胞中被显著上调。Smac/DIABLO在小鼠内耳发育的不同阶段的广泛分布及毛细胞中的特异富集，都表明Smac/DIABLO的功能与内耳和毛细胞的发育和内稳态密切相关。Cheng 等(2011)[参见Cheng J，Zhu Y，He S，Lu Y，Chen J，Han B, Petrillo M， Wrzeszczynski K0，Yang S，Dai P，Zhai S，Han D，Zhang MQ,Li W,Liu X，Li H，Chen ZY, Yuan H. Functional mutation of SMAC/DIABLO,encoding a mitochondrial proapoptotic protein,causes human progressive hearing loss DFNA64. Am J Hum Genet，2011，89 (I) 56-66.]将中国一个六代相传耳聋家系的致病基因定位于一个新的常染色体显性遗传非综合征型耳聋基因位点，人类基因组命名委员会(HUGO)将其命名为DFNA64，通过直接测序找到与耳聋表型共分离的Smac/DIABLO基因c. 377C > T杂合突变。Smac/DIABLO是线粒体内膜上非常重要的细胞凋亡相关蛋白，直接参与cytC/APAFl/CASP9凋亡通路中促细胞凋亡的发生。该研究还发现Smac/DIABLO的p. S126L突变体可引起细胞内野生型和突变型Smac/DIABLO大量降解，引发线粒体膜电位慢性损伤。进一步的研究需要在动物模型中验证和分析突变型Smac/DIABLO对内耳毛细胞的损伤作用。目前国际上尚未见此类动物模型的报道。因此，建立一种Smac/DIABLO基因突变转基因小鼠的动物模型以实现模拟人类耳聋疾病(DFNA64)的相关研究势在必行。
发明内容
针对目前耳聋疾病研究中存在的问题，本发明的目的是克服在人体研究中的不可操作性，构建Smac/DIABLO基因突变转基因载体；本发明的再一目的是利用该转基因载体， 通过原核注射和胚胎移植技术，提供一种Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型。本发明所述Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型的制备方法，步骤是(I)利用pcDNA3. I (+)构建载体将Smac/DIABLO基因的cDNA序列连入载体 pcDNA3. I (+)的KpnI和BamHI两个酶切位点之间，将IRES-eGFP序列连入载体pcDNA3. I (+) 的EcoRV和XhoI两个酶切位点之间；设计诱变引物扩增PCR引入c. 371C > T突变；经过测序验证突变后，用KpnI和XhoI双酶切已诱变的质粒中的cDNA+IRES-eGFP片段和空质粒 pcDNA3. I (+)，再进行连接、转化、培养、提质粒，构建得到Smac/DIABLO基因突变型载体质粒-pcSIG,所述pcSIG质粒的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示；其中，上述诱变引物序列是 M371-F GAAGATGAATTTCCAGGAGGAAG,M371-R CCAAGTAAAC TTGTATATTGTCGGT ；(2)原核注射和胚胎移植建立转基因小鼠模型将突变型载体质粒pcSIG线性化， 通过显微注射注入合子的原核中，37°C培养I 3h，然后将注射质粒并培养存活的合子移植到假孕母鼠输卵管中，以PCR扩增鉴定所生后代，确定是否得到Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠；其中，上述PCR扩增引物序列是cDNA-F GCGGTACCATGGCGGCTCTGAGAAGT,eGFP-R GCCTCGAGTTAC TTGTACAGCTCGTC ；(3)对得到的转基因小鼠进行基因型鉴定用Real-time PCR验证得到的转基因小鼠Fl代是否有突变基因的表达，若有，即确定获得Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型；其中，上述Real-time PCR引物序列是cDNA-RT-F CACCTACGCGCTGATTGAAG,cDNA-RT-R CTGCCACACCTCAT CTTCCT。 上述Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型的制备方法中所述 pcDNA3. I (+)载体的核苷酸序列如SEQ ID No. 2 ;所述Smac/DIABLO基因的cDNA的核苷酸序列如SEQID No. 3 ;所述IRES-eGFP的核苷酸序列如SEQ ID No. 4。本发明成功利用哺乳动物高效表达载体pcDNA3. I (+)建立并实现了 Smac/DIABLO 基因突变致聋的转基因小鼠模型的制备。本发明的突出效果是(I)常规方式获得了 Smac/DIABLO基因突变转基因小鼠。(2)利用本发明的方法制作的Smac/DIABLO基因突变转基因小鼠模型能够较好的模拟人类DFNA64型耳聋疾病的临床表现。(3)本发明方法获得的Smac/DIABLO基因突变转基因小鼠模型可以作为耳聋治疗药物的筛选平台，并且通过进一步的对Smac/DIABLO基因突变小鼠研究和分析，能够揭示致病基因突变导致耳聋的分子机制，为下一步预防和治疗提供有力支持。
图I转基因载体构建图示。图2诱变反应图示。图3转基因突变型和野生型序列测序结果对比。图4原核注射图示。图5转基因小鼠阳性筛选结果。其中左图为对照引物扩增产物，右图为转基因阳性引物扩增产物(所用DNA与左图对应)。图6相对定量结果柱状图。其中相对定量值RQ取log2对数为纵轴作柱状图，图中红色方框内为突变型转基因，无方框为野生对照。
具体实施例方式下面结合实施例具体描述Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型的制备方法，但所述内容并不限制本发明保护的内容。实施例I :Smac/DIABL0基因突变转基因载体的设计和构建I.载体设计利用pcDNA3. I (+)构建载体，将Smac/DIABLO基因的cDNA及IRES-eGFP分别连接于Promoter-CMV与bGH-polyA之间的多克隆位点区域。在引物两端引入酶切识别位点及保护碱基，cDNA两端酶切识别位点分别KpnI和BamHI，IRES-eGFP两端酶切识别位点分别为 EcoRV 和 XhoI。其中上述pcDNA3. I (+)载体的的核苷酸序列如SEQ ID No. 3 ；Smac/DIABLO基因的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No. 3 ；IRES-eGFP的核苷酸序列如SEQ ID No. 4。转基因载体图谱见附图I。2.载体构建2. I提取脑组织总RNAI)取⑶I品系小鼠一只，处死后取新鲜脑组织约lOOmg，加入适量液氮，匀浆器中研磨至粉末2)加入 Iml Trizol,室温静置 5min3)加入200 μ I氯仿，混匀后静置2min4)移入 I. 5ml 离心管中，4°C离心 12000Xg, 15min5)取上层无色透明液体约500 μ I移入新的I. 5ml离心管6)加入500 μ I异丙醇，混匀，静置IOmin7)4°C离心 12000 X g, IOmin,弃上清0049]8)加入lml 70%乙醇，混勻，4°C离心12000Xg,5min,弃上清9)空气中晾干，加入 100 u 1 RNase-Free Water 溶解，_80°C保存2.2反转录卩0 反应体系20 ul
ddH204.2 [i\
lOxRT Buffer2 ^1
25x dNTPs0.8
10x RT Random Primers2 [^1
Multi Scribe Reverse Transcripase1 ^il
RNA10 [il反应条件
权利要求
1.一种Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型的制备方法，步骤是(1)利用pcDNA3.I (+)构建载体将Smac/DIABLO基因的cDNA序列连入载体 pcDNA3. 1(+)的KpnI和BamHI两个酶切位点之间，将IRES-eGFP序列连入载体pcDNA3. I (+) 的EcoRV和XhoI两个酶切位点之间；设计诱变引物扩增PCR引入c. 371C > T突变；经过测序验证突变后，用KpnI和XhoI双酶切已诱变的质粒中的cDNA+IRES-eGFP片段和空质粒 pcDNA3. I (+)，再进行连接、转化、培养、提质粒，构建得到Smac/DIABLO基因突变型载体质粒-pcSIG,所述pcSIG质粒的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示；其中，上述诱变引物序列是M371-F GAAGATGAATTTCCAGGAGGAAG,M371-R CCAAGTAAAC TTGTATATTGTCGGT ；(2)原核注射和胚胎移植建立转基因小鼠模型将突变型载体质粒pcSIG线性化，通过显微注射注入合子的原核中，37°C培养I 3h，然后将注射质粒并培养存活的合子移植到假孕母鼠输卵管中，以PCR扩增鉴定所生后代，确定是否得到Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠；其中，上述PCR扩增引物序列是 cDNA-F GCGGTACCATGGCGGCTCTGAGAAGT, eGFP-R GCCTCGAGTTAC TTGTACAGCTCGTC ；(3)对得到的转基因小鼠进行基因型鉴定用Real-timePCR验证得到的转基因小鼠 Fl代是否有突变基因的表达，若有，即确定获得Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型；其中，上述Real-time PCR引物序列是 cDNA-RT-F CACCTACGCGCTGATTGAAG, cDNA-RT-R CTGCCACACCTCAT CTTCCT。
2.如权利要求I所述Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型的制备方法，其特征是所述pcDNA3. 1(+)载体的核苷酸序列如SEQ ID No. 2 ;所述Smac/DIABLO基因的cDNA 的核苷酸序列如SEQ ID No. 3 ;所述IRES-eGFP的核苷酸序列如SEQ ID No. 4。
全文摘要
本发明公开了一种Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型的制备方法，是利用pcDNA3.1(+)构建Smac/DIABLO基因突变型载体质粒pcSIG；然后将pcSIG质粒线性化，通过显微注射注入合子的原核中，培养，再移植到假孕母鼠输卵管中，以PCR扩增鉴定所生后代，确定是否得到Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠；用Real-time PCR验证得到的转基因小鼠F1代是否有突变基因的表达，最终获得Smac/DIABLO基因突变致聋的转基因小鼠模型。本发明方法获得的Smac/DIABLO基因突变转基因小鼠模型可以作为耳聋治疗药物的筛选平台，并利用所述模型分析，能够揭示致病基因突变导致耳聋的分子机制，为下一步预防和治疗提供有力支持。
文档编号C12N15/85GK102604991SQ20121007385
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月20日 优先权日2012年3月20日
发明者卢宇, 张剑, 朱玉华, 程静, 袁慧军, 高建刚 申请人:山东大学