专利名称：唾液乳杆菌株sil1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及微生物技术领域，具体涉及一种新型益生菌唾液乳杆菌菌株SILl {Lactobacillus salivarius)及其应用。背景技术：
动物肠道中通常有一层微生物或微生物层，在正常情况下即动物处于健康状况时，并 未表现异常或致病现象，这一层微生物称为肠道微生物。它是动物胃肠道中不可缺少的组 成部分，对宿主动物绝大多数是有益无害的。使用无菌或抗生素处理的试验动物所做的大 量试验证明，由于肠道已经存在的微生物与侵入的病原菌竞争肠粘膜上的粘附位点，因此 肠道正常菌群可以竞争性排斥外来致病菌在肠道的定植。乳酸菌是动物体内的有益微生物之一，是动物肠道的正常定植菌群，其定植在肠 粘膜上皮细胞上，并抑制其它病原菌的粘附。在胃肠道400多种厌氧或好氧微生物中，乳酸 菌约占10%。研究表现，与下痢猪相比，正常仔猪肠道大肠杆菌数量明显下降，而乳酸杆菌 数大大提高；用乳酸杆菌接种仔猪，其肠组织勻浆液中大肠杆菌数量较对照组明显降低，乳 酸杆菌数量大大提高。乳酸菌的抑菌机理主要是通过自身以及代谢产物与其它微生物之间 的相互作用，来调整菌群之间的关系，从而维持微生态环境中微生物群最佳优势组合以及 这种组合的相对稳定。此外，乳酸菌易与肠粘膜上皮细胞结合，起占位作用，对有害菌具有 屏障排除能力。基于乳酸菌的诸多优点，它已成为广大从事乳酸菌食品添加剂、益生素开发、饲料 工业等领域研究人员的研究热点。其中在饲料工业上，乳酸菌常和其他益生菌一起制成微 生态制剂用于饲料，来促进畜禽特别是幼龄动物的生长发育，减少发病率和死亡率。但是， 目前乳酸菌最大的缺点就是生命力十分脆弱，无法久存。研究发现，乳酸菌必须在肠道特定 部位才能产生功效。而天然乳酸菌不耐高温、胃酸及胆盐的侵蚀，经饲料制粒后大多数乳酸 菌会死亡，很难通过胃环境安全到达肠道发挥作用，也无法吸附在肠道粘膜的适当位置，结 果只能是随着粪便排出体外，产生不了任何作用。鉴于此，强耐受力的乳酸菌株的分离和筛 选迫在眉睫，这不仅关系到绿色畜禽养殖业的可持续发展和动物性产品的安全生产，也是 保证广大人民的健康生活、保护养殖生态环境和我国进入WTO参与国际竞争的必然选择。
三
发明内容
技术问题
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种猪源唾液乳杆菌，对酸、胆盐和温度 具有良好的耐受性，能在模拟胃肠液中生长；60°C处理30min，不影响菌株的生长；对体外 共培养的大肠杆菌和沙门氏菌具有100%的抑菌效果，能在动物肠道定植，具有调节动物肠 道菌群分布和促进动物生长的功能。技术方案
为达到以上目的，是通过以下技术方案来实现的
提供一株唾液乳杆菌菌株，来源于断奶仔猪，保藏名称为唾液乳杆菌ilactobacillus■sah>ariM)SILl，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址武汉市武昌区珞珈山武汉 大学，保藏日期2010年10月沈日，保藏号CCTCC M2010281o该菌株革兰氏阳性，显微镜下呈球形或卵圆形，成对或短链状，无芽孢，无鞭毛；在 MC平板上生长，可形成粉色、表面光滑圆润的小菌落，边缘整齐，有溶钙圈；在MRS液体培养 基中呈均勻浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。最适生长温度35 38°C，适宜pH为5. 0 7.0，能在5%氯化钠肉汤中生长。能够利用蔗糖、海藻糖、果糖、乳糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽 糖、甘露醇、甘露糖、水杨苷、苦杏仁苷；不能够利用阿拉伯糖、纤维二糖、松三糖、棉子糖、鼠 李糖、核糖、木糖、山梨醇。接触酶、氧化酶阴性，不还原硝酸盐，不液化明胶。本发明的唾液乳杆菌(Zacio^ciBttS salivarius) SILl株可以用于调节动物肠 道菌群，促进动物生长。有益效果
本发明的SILl经16S rRNA鉴定为唾液乳杆菌Oacio力aci/^As salimrius\抗逆性试验表明，本发明的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SlLl具有一 定的耐酸、耐胆盐能力，能在PH3的培养液和胆盐含量为6g/L的培养液中生长；能在模拟胃 肠液中生长；60°C处理30min，不影响其生长。体外抑菌试验表明，SILl菌株对共同培养Mh的大肠杆菌0157和沙门氏菌的抑 菌率均达100%。小鼠应用试验证明，本发明的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SIL1株可 以调节肠道菌群失调小鼠的肠道菌群分布，能在小鼠肠道定植，对小鼠的生长具有促进作用。四
图1、唾液乳杆菌(Zacio^ci/^AS salivarius) SILl的生长曲线； 图2、PCR扩增产物唾液乳杆菌Oacio力aci/^As salivarius)^lLl 16s rRNA基因片段 电泳图
M: DNA Marker DL5000 ； 1 =SILl 菌株
图3、双酶切鉴定唾液乳杆菌(Zacio力aci/^As salivarius) SILl 16s rRNA基因片段 电泳图
M: DNA Marker DL2000 ；1 =SILl 菌株 图4、SILl对小鼠粪便菌群的影响
1 6日正常对照组；2 6日模型组；3 :11日正常对照组；4 11日自然恢复组 5:11日菌株治疗组；6 16日正常对照组；7 16日自然恢复组；8 16日菌株治疗组 图5 SILl对小鼠粪便菌群的影响
1、2 21日正常对照组；3、4、5 21日自然恢复组；6、7、8 21日菌株治疗组 五具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不 用于限制本发明的范围。实施例一菌株的分离
MC琼脂培养基大豆蛋白胨5g，牛肉浸膏5g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，乳糖20g，碳酸 钙10g，琼脂15g，l%中性红溶液5ml，蒸馏水1000ml, pH值6，121°C灭菌15min。
MRS液体培养基蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖 20g，吐温-80 Iml，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0. 58g，硫酸锰0. 25g，蒸馏水IOOOml， pH 值 6. 2 6. 4，121°C 灭菌 15min。27日龄健康断奶仔猪，品种为苏钟猪，来源于江苏省农科院六合动物试验基地。心 脏放血，无菌采取回肠内容物lg，于盛有5ml灭菌生理盐水的试管中，混勻lOmin，取上清划 线于MC平板，37°C恒温培养M 4 后，挑取红色有溶钙圈的菌落，反复接种筛选，直至得 到均勻的单个菌落，命名为SILl。革兰氏染色镜检菌株SILl为G+，显微镜下呈球形或卵圆形，成对或短链状，无芽 孢，无鞭毛；在MC平板上生长，可形成粉色、表面光滑圆润的针尖状小菌落，边缘整齐，有溶 钙圈；在MRS液体培养基中呈均勻浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。实施例二 菌株的理化及培养特性
1、菌株SILl能够利用蔗糖、海藻糖、果糖、乳糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、甘露 糖、水杨苷、苦杏仁苷；不能够利用阿拉伯糖、纤维二糖、松三糖、棉子糖、鼠李糖、核糖、木 糖、山梨醇。接触酶、氧化酶阴性，不还原硝酸盐，不液化明胶。菌株SILl最适生长温度35 38°C，适宜pH为5. 0 7. 0，能在5%氯化钠肉汤中生长。2、生长曲线的测定
将活化的SILl菌液以2 % (约106CfU/mL)的接种量接种于MRS液体培养基中，37°C， 160rpm,培养30h，每隔池取样，在600nm下测定吸光值，绘制生长曲线图。结果表明，SILl 培养池即进入对数生长期，14h进入稳定期。实施例三菌株的核酸鉴定 1、引物
根据GenBank中登录的乳酸菌16S rRNA的基因序列，参考其368-1049位基因片段，设 计引物
F 5' -TCGGCTCGTAAAACTCTG-3，； R5， - GGACTTAACCCAACATCTCA -3，。引物由hvitrogen公司合成，扩增片段为V3-V7，长682bp。2、16s rRNA基因序列分析
挑取单菌落置离心管中，加入50 L无菌蒸馏水重悬，沸水浴2min，12000r/min, 5min, 上清中即含16S rRNA基因。PCR扩增体系为50 L体系，93°C预变性!Min ;94°C 45s, 55°C lmin, 72°C 1. 5min, 30个循环；72°C延伸lOmin。PCR产物回收后与pMD18_T载体连接，经 氨苄抗性与蓝白斑筛选，I和III双酶切鉴定，阳性质粒由hvitrogen公司进 行测序。3、结果
用1. 2%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，在682bp处出现特异性目的条带，与预期大小 相符合(图1)。用BamH I和Hind III对细菌克隆质粒进行双酶切鉴定，片段与理论大小相 符合(图2)。测序结果与GenBank中已发表的标准序列进行同源性比较后得出SILl菌株为 唾液乳杆菌(Zacio^ciBiAs salivarius),同源性为 99%。
实施例四菌株的抗逆性研究1、耐酸、耐胆盐试验
将活化的SILl菌液以2 % (约IO6 cfu/mL)的接种量分别接种于pH为3、4、5、6的MRS 液体培养基中，以及胆盐浓度为0g/L、3g/L、6g/L的液体培养基中，每组设3个重复，37°C， 160r/min,培养他，取样测各组菌液的OD6tltlnm值。2、温度敏感试验
将活化的SILl菌液以2 % (约IO6 cfu/mL)的接种量分别接种于5管MRS液体培养基 中，每管设3个重复，分别于45°C、50°C、55°C、60°C处理30 min后，37°C，160r/min，培养8 h，取样测各组菌液的OD6tltlnm值。3、胃肠道耐受试验
将MRS液体培养基加入NaCl 5 g/L，调pH值至3. 0，121°C灭菌15 min，无菌添加胃蛋 白酶5 g/L，制成模拟胃液。将MRS液体培养基加入猪胆盐3 g/L, NaCl 5 g/L，调pH值至 8.0，121 °C灭菌15 min，无菌添加胰蛋白酶10 g/L，制成模拟肠液。将活化的SILl菌液以 2 % (约IO6 cfu/mL)的接种量分别接入到MRS液体培养基(对照)和模拟胃肠液中，每组设 3个重复，370C，200 r/min,培养12 h，取样测各组菌液的OD6tltlnm值。5、结果
从结果来看，随着培养液PH值的降低和胆盐含量的升高，菌株的生长速度相应降低， 但在PH值为3的培养液和胆盐含量为6g/L的培养液中仍能生长，说明该株菌具有一定的 耐酸、耐胆盐能力；此外，菌株对胃蛋白酶和胰蛋白酶也有一定的抵抗力，能在模拟胃肠液 中生长；从表中可以看出，随着菌株处理温度(45°C飞0°C )的升高，其OD6tltlnm值呈下降趋势， 但60°C处理30min，不影响菌株的生长。表1各组菌液的OD6tltlnm平均值
权利要求
1.一株唾液乳杆菌菌株SIL1，为唾液乳杆菌(Lac tobacillus sali varius )，保藏单 位中国典型培养物保藏中心，地址武汉市武昌区珞珈山武汉大学，保藏日期2010年10 月 26 日，保藏号=CCTCC M2010281 ；该菌株革兰氏阳性，显微镜下呈球形或卵圆形，成对或短链状，无芽孢，无鞭毛；在MC 平板上生长，可形成粉色、表面光滑圆润的小菌落，边缘整齐，有溶钙圈；在MRS液体培养基 中呈均勻浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀；最适生长温度35 38°C，适宜pH为5. 0 7. 0， 能在5%氯化钠肉汤中生长；能够利用蔗糖、海藻糖、果糖、乳糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘 露醇、甘露糖、水杨苷、苦杏仁苷；不能够利用阿拉伯糖、纤维二糖、松三糖、棉子糖、鼠李糖、 核糖、木糖、山梨醇；接触酶、氧化酶阴性，不还原硝酸盐，不液化明胶。
2.权利要求1所述菌株SILl的调节动物肠道菌群、促进动物生长中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株猪源唾液乳杆菌SIL1及其应用，属于微生物技术领域。该唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)SIL1对酸、胆盐和温度具有良好的耐受性，耐受pH3和胆盐含量为6g/L的培养液，能在模拟胃肠液中生长，60℃处理30min，不影响菌株的生长。本发明的唾液乳杆菌对体外共培养的大肠杆菌和沙门氏菌具有100%的抑菌效果，能在动物肠道定植，具有调节动物肠道菌群分布和促进动物生长的功能。
文档编号C12R1/225GK102061272SQ20101052343
公开日2011年5月18日 申请日期2010年10月28日 优先权日2010年10月28日
发明者刘小娟, 周宇, 朱小翠, 王冉, 王晓丽, 王永山, 诸玉梅 申请人:江苏省农业科学院