一种高效抑制禽源弯曲杆菌的唾液乳酸杆菌的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株具有高效抑制禽源弯曲杆菌的唾液乳酸杆菌Lactobacillus?salivarius?Scgz-11，其保藏编号为CCTCC?NO：M2014080，具有较好的耐酸、耐胆盐能力，其分泌上清液对禽空场弯曲杆菌具有很强的抑制作用，能有效抑制禽空场弯曲杆菌对细胞的黏附及入侵作用，且本发明菌株自身拥有良好的黏附能力，并可以显著提高禽类体重。可应用于制备防治禽类空场弯曲杆菌感染的药剂，或者应用于制备改善禽类肠道菌群生态平衡的药剂。
【专利说明】一种高效抑制禽源弯曲杆菌的唾液乳酸杆菌
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株新菌种及其在环境工程中的应用，具体涉及一种高效抑制禽源弯曲杆菌的唾液乳酸杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002]益生菌(Probiotics)被动物摄入一定的数量后,产生有利于宿主健康作用的一类微生物活体，其中乳酸菌是最为常见的一类益生菌，主要包括乳杆菌、链球菌和双歧杆菌等属，具有调节胃肠道失衡，增强机体免疫能力，促进消化等功能，能够抑制肠道病原菌生长，治疗病原菌引发的疾病，如腹泻和肠炎等。目前，已有许多研究将益生菌的有益功效应用于预防和治疗胃肠道病原菌感染引起的疾病，例如用于Helicobacter pylori, Escherichiacoli, Salmonell等病原菌引起的感染。[0003]目前，乳酸杆菌制品在调节免疫性疾病，降低胆固醇，预防癌症等各方面都有一定疗效。乳酸杆菌制品临床上用于预防感染性疾病有一个很好的基础理论，而且安全性能高，但仅少部分乳酸杆菌制品在临床应用中发挥作用，因此，仍需继续寻找抑菌效果更好的菌株。
[0004]弯曲杆菌是一类在微需氧条件下生长的革兰氏染色阴性菌，呈逗点状或S形。弯曲杆菌属主要有胎儿弯杆菌、粪弯杆菌以及痰液弯杆菌3种，其中的空肠弯曲杆菌(C.jejuni)和结肠弯曲杆菌被认为是造成动物和人腹泻的主要致病菌之一。弯曲杆菌可引起火鸡的肝炎和蓝冠病，雏鸡的坏死性肝炎，犊牛、仔猪的腹泻等多种疾病；也有报道称弯曲杆菌能够引起牛、绵羊等反刍动物的流产。同时，弯曲杆菌被认为是引起人肠炎的主要病原菌。人感染弯曲杆菌后，可能出现血便和腹痛的症状，此外，空肠弯曲杆菌感染还可能会导致严重的继发病——格林一巴利综合症(GBS)，该病属于脱髓鞘障碍导致急性神经肌肉麻痹。因此，十分有必要发展新的方法来预防和降低C.jejuni感染，进一步保障食品安全和人类健康，随着生物学研究领域的兴起，利用具有抑制病原菌功效的益生菌来预防C.jejuni感染逐渐成为研究的热点。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一株新菌种:唾液乳酸杆菌Zac tobaciIlus sali variusScgz-11。
[0006]本发明的另一目的在于提供唾液乳酸杆菌Lactobacillus salivarius Scgz-1I在制备防治禽类空场弯曲杆菌感染的药剂中的应用。
[0007]本发明所采取的技术方案是:
申请人:将菌株保藏在位于武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏中心于2014年3月12日收到 申请人:提供的菌株。保藏中心给予该培养物的保藏号为CCTCC NO:M2014080，提议的分类命名为Zacio如salivarius Scgz-11，已于 2014年3月17日鉴定保藏的菌株是存活的。[0008]Lactobacillus salivarius Scgz-11在制备防治禽类空场弯曲杆菌感染的药剂中的应用。
[0009]Lactobacillus salivarius Scgz-11在制备改善禽类肠道菌群生态平衡药剂中的应用。
[0010]本发明的有益效果是:
I)本发明唾液乳酸杆菌salivarius Scgz-1l是一种具有高效抑制空场弯曲杆菌的益生菌，预防和降低空场弯曲杆菌对家禽的感染，对保障食品安全和人类健康具有重要意思。
[0011]2)本发明菌株是从健康动物分离出来的菌株，安全可靠，并且通过多重检查筛选方法，证明其的可靠稳定。
[0012]3)本发明菌株是以针对治疗空场弯曲杆菌而开发的菌株，对空场弯曲杆菌具有针对性，并且效果良好。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为唾液乳酸杆菌Scgz-1l的电子显微镜图；
图2为唾液乳酸杆菌Scgz-1l的生长曲线；
图3为唾液乳酸杆菌Scgz-1l对弯曲杆菌的抑制现象；
图4为不同处理组鸡苗的体重。
【具体实施方式】
[0014]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
[0015]实施例1
一、唾液乳酸杆菌Scgz-1l的来源
该唾液乳酸杆菌为本发明人于2013年中从广东养殖场的健康鸡群中分离得到，现由华南农业大学兽医学院禽病研究室保存和提供。
[0016]二、唾液乳酸杆菌Scgz-1l的鉴定和分类
经过本发明人实验室系统鉴定表明该株为唾液乳酸杆菌。
[0017](I)生化鉴定
根据《伯杰细菌鉴定手册》，做如下生化试验:过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚试验、硫化氢试验、V-P试验和动力试验。该七项生化试验均为阴性。判定所筛选出的ScgZ-1l菌株属于乳酸菌(Lactobacillus)属。
[0018](2) 16S rRNA 基因测序
设计引物序列:fDl:5p-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3p，rDl: 5p_AAGGAGGTGATCC AGCC_3p，PCR反应参照宝生物公司rTaq DNA聚合酶的使用说明书进行，PCR反应体系(50μυ为:ddH20 21PL、rTaq (Premix Taq) 25μL、引物 fDl (20Mmol/L) ?μL、引物 rDl (20Mmol/L) ?μL,模板 DNA 2μL0 PCR 反应条件为:94°C预变性 5min ;94°C，45s，55°C，45s，72°C，90s，35 个循环；72°C延伸lOmin。反应结束后取6μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶(0.5Pg/mL EB)电泳检测。将目的产物送上海美吉生物医药科技有限公司进行DNA双向测序。将测序结果与Genbank数据库中不同菌株16S rRNA基因序列进行同源性比较，比较结果显示所筛选出的Scgz-1l菌株与唾液乳酸杆菌成员相似度最高，说明其为唾液乳酸杆菌。
[0019]三、唾液乳酸杆菌Scgz-1l的主要特性 I)生物学形态特征
菌体形态特征:菌体呈杆状，一般呈单个、成对或短链状存在，如图1所示。
[0020]菌落形态特征:在MRS琼脂培养基上能形成均匀明显的菌落:其菌落呈圆形，边缘整齐，乳白色，不透明，不形成芽孢。
[0021]2)生长特征:兼性厌氧菌生长，生长温度范围32~42°C (最适37°C )，生长pH范围为pH 6~8 (最适pH6.5)。
[0022]3)生长曲线
选取唾液乳酸杆菌将其复壮后，通过MRS琼脂培养基两次传代培养，再将菌株接种于MRS肉汤，37°C培养12h左右作为种子液。再将种子液按培养基总体积的1%接种于事先准备好的含等量MRS肉汤的离心管中，于37°C静置培养。其间每隔2h取出一支，用分光光度计测定肉汤的(》6_?值，计算菌体浓度，将实验结果绘制成Scgz-1l的生长曲线，如下图2所示:
结果表明，唾液乳酸杆菌从第9h到第19h为对数增长期，20h候进入平台期，细菌几乎停止生长，活菌数量和凋亡的细菌量处于一个平衡时期。
[0023]益生菌的一个重要性质是对病原菌的抑菌活力，当益生菌在动物肠道内达到一定数量时，可以抑制肠道中及自然界中某些有害微生物的生长，测定益生菌的抑菌活力可用牛津杯法(也叫管碟法)，此方法是国内外测定抗生素效价通用方法，也是各国药典规定的方法。
[0024]四、唾液乳酸杆菌Scgz-1l对体内弯曲杆菌的抑制作用
I)牛津杯试验
根据牛津杯定量扩散法(王昌禄，胡王旬，何艳贞.1999.一株新型乳酸菌素产生菌的分离及其鉴定.天津轻工业学院学报)，取100 PL已培养36h的弯曲杆菌MH肉汤菌液，用无菌棉签蘸取菌液均匀涂于改良mCCD培养基表面，放于37°C培养箱10 min，待培养基表面水分蒸发完全。用镊子夹取牛津杯放置于平皿中，然后每个牛津杯中加入200 PL发酵上清液，然后将培养基平皿置于微需氧环境下42°C培养36~48 h，观察牛津杯周围抑菌圈，并测量其直径；同时分别设置阳性对照和阴性对照实验，阳性对照选用植物乳酸杆菌aCCC11095(购于广东西微生物菌种保藏中心)的发酵上清液，阴性对照选用无菌水。
[0025]上述发酵上清液为将Scgz-1l保藏菌种以2%接种量接种于MRS液体培养基中，于37°C静置培养18~24 h，传代三次后，离心(8000 r/min, 20 min，4°C )，分别收集上清液及菌体，上清液经0.22 ym无菌微孔滤膜过滤后，4°C保存，即为发酵上清液。
[0026]实验结果如图3所示，从中可以看出在装有Scgz-1l菌株发酵上清液的牛津杯周围出现了明显的抑菌圈，抑菌圈直径为22mm左右，比阳性对照植物乳酸杆菌accc11095的抑菌圈还大，说明该唾液乳酸杆菌Scgz-1l对弯曲杆菌的生长具有很好的抑制作用。
[0027]2)模拟胃液的耐受试验
益生菌 在动物体内发挥益生作用，首先必须能够以活菌状态通过胃才能进入肠道，胃液有强酸性，PH在1.5-3之间，可以杀死进入胃部的细菌，因此益生菌必须具有一定的耐酸性。进入肠道后，益生菌会面临肠液中各种酶和胆汁酸的不良环境，益生菌对于胆盐的抗性是其在肠道存活、生长以及发挥功效的重要条件。因此对胃液和胆盐的耐受能力是筛选潜在益生菌应考察的重要指标。目前大多通过测定益生菌在模拟胃肠道环境中的生长状况来评价其耐受真实胃液和胆汁的能力，为益生菌能否在胃肠道中发挥健康益生作用提供依据。
[0028]1.耐酸性实验
将上述牛津杯试验中具用抑菌作用的Scgz-1l菌株用MRS肉汤进行增殖培养，制备IO8CFU/mL浓度的菌液，再按2% (v/v)的量分别接种于pH值为2和3的10 mL MRS液体培养基中，置于37°C恒温培养箱中，培养4 h后吸取100 PL菌液进行梯度稀释，选择合适稀释倍数作平板活菌计数，其中PH值为2的培养基中Scgz-1l菌株存活率为26.5%，pH值为3的存活率为33.3%。说明本发明菌株在酸性环境中可以很好地生存。
[0029]2.耐胆盐试验
同耐酸性实验的操作过程， 制备IO8 CFU/mL浓度的菌液，再按2% (v/v)的量接种于胆盐浓度为2g/L的MRS液体培养基中，置于37°C恒温培养箱，培养4 h后吸取100 μL菌液进行梯度稀释，选择合适稀释倍数作平板活菌计数(苗玉和，刘岩，闻艳丽，等.2011.猪源乳酸杆菌的分离鉴定及生物学特性分析.中国兽药杂志)，其存活菌的浓度为4Χ 105cfu/ml，存活率为20%。
[0030]3)唾液乳酸杆菌Scgz-1l的黏附性
乳酸菌的黏附性具有菌株特异性和宿主特异性，黏附性强的乳酸菌能延长与宿主细胞的相互作用时间，从而更好地增强机体的免疫应答；乳酸菌与肠上皮细胞黏附使其发挥最佳的益生功能；乳酸菌对肠道上皮细胞的黏附作用有助于其在肠道定植、增强乳酸菌与肠道细胞之间的信号交流、抑制病原菌在肠道的定植和提高机体的免疫力，调节粘膜免疫系统，保护宿主肠道健康，乳酸菌的黏附性是决定其免疫调节活性的重要因素，因而乳酸菌的黏附性是评价其作为益生菌的重要标准。
[0031]1.对Hela细胞间的黏附作用
将培养好的Hela细胞消化后，按每孔Iml接种于24孔(浓度lX105/ml)细胞培养板，18h长成单层(每孔约3 X IO5个细胞)；Hank液洗涤，各组每孔分别加入0.9ml DMEM培养液(含1%胎牛血清)、0.1ml PBS(含2 X 107CFU/mL唾液乳酸杆菌Scgz-1I )，37°C孵育2h ;吸去菌液，PBS漂洗三次；各孔加入1ml含0.01% TritonX-1OO的PBS裂解单层细胞；吸出各孔悬液，混匀，经1: 100稀释后各取100 μL涂布于Mrs培养基，培养36h计数菌落，黏附力用黏附细菌数lQg 1Q cfu/mL值表示。
[0032]计算结果为:唾液乳酸杆菌Scgz-1l与Hela细胞间的黏附力为6.041，具有统计学意义，结果说明唾液乳酸杆菌Scgz-1l与乳杆菌与上皮黏膜细胞间具有很好的粘附结合作用。
[0033]4) Scgz-1l抑制空场弯曲杆菌对HeLa细胞的黏附作用
1.竞争实验
将培养好的Hela细胞消化后，按每孔Iml接种于24孔(浓度lX105/ml)细胞培养板，18h长成单层(每孔约3 X IO5个细胞)；Hank液洗涤，分为两组，A组每孔分别加入0.8mlDMEM培养液(含1%胎牛血清)、0.Iml PBS (含2 X 107cfu/ ml空场弯曲杆菌)和0.1ml菌株Scgz-1l上清液，B组每孔分别加入0.9ml DMEM培养液(含1%胎牛血清)、0.Iml PBS (含2X107cfu/ ml空场弯曲杆菌)；37°C孵育2h ;吸去菌液，PBS漂洗三次；各孔加入1ml含
0.01% TritonX-1OO的PBS裂解单层细胞；吸出各孔悬液，混匀，经1: 100稀释后各取100 PL涂布于改良C⑶培养基，48h计数菌落，黏附力用黏附细菌数IQgltl cfu/ml值表示，至少3次生物学重复。。
[0034]计数结果表示空场弯曲杆菌对照组的黏附力为3.3，而同时加入菌株Scgz-1l的空场弯曲杆菌的黏附力为2.69，这一结果说明竞争实验中，唾液乳酸杆菌Scgz-1l对空场弯曲杆菌粘附HeLa细胞具有明显抑制作用0° < 0.05)。
[0035]2.置换实验
将培养好的Hela细胞消化后，按每孔Iml接种于24孔(浓度I X IO5个/ml)细胞培养板，培养18h长成单层(每孔约3 X IO5个细胞)；Hank液洗涤，各组每孔分别加入0.9mlDMEM培养液(含1%胎牛血清)、0.1ml PBS (含2 X 107cfu/ ml空场弯曲杆菌悬液)；37°C孵育2h，吸去菌液，PBS漂洗三次，将其分为两组，A组每孔加入各组每孔分别加入0.9ml DMEM培养液(含1%胎牛血清)和0.1ml PBS (含2 X IO7Cfu/ ml菌株Scgz-11), B组每孔加入各组每孔分别加入0.9ml DMEM培养液(含1%胎牛血清)和0.1ml PBS ;37°C孵育2h ;吸去菌液，PBS漂洗三次；各孔加入1ml含0.01% TritonX-1OO的PBS裂解单层细胞；吸出各孔悬液，混匀，经1: 100稀释后各取100 PL涂布于改良C⑶培养基，48h计数菌落，黏附力用黏附细菌数lQg 10 cfu/ml值表示，至少3次生物学重复。
[0036]计数结果表示在不加入菌株Scgz-1l的B组中，空场弯曲杆菌黏附力为3.3，而在后续加入菌株Scgz-1l 的A组中，空场弯曲杆菌的黏附力为2.93，这一结果说明置换实验中，唾液乳酸杆菌Scgz-1 I对空场弯曲杆菌粘附HeLa细胞具有明显抑制作用0°<0.05)。
[0037]3.排除实验
将培养好的Hela细胞消化后，按每孔Iml接种于24孔(浓度lX105/ml)细胞培养板，18h长成单层(每孔约3 X IO5个细胞)；Hank液洗涤，分为两组，A组每孔分别加入0.9mlDMEM培养液(含1%胎牛血清)、0.1ml PBS (含2 X 107cfu/ ml空场弯曲杆菌)，37°C孵育2h ;B组每孔分别加入0.8ml DMEM培养液(含1%胎牛血清)、0.1ml PBS (含菌株2 X IO7Cfu/ml Scgz-11)，37°C孵育 Ih 后，再加入 0.1ml PBS (含 2 X 107cfu/ ml 空场弯曲杆菌)，37°C孵育lh，吸去两组的菌液，PBS漂洗三次；各孔加入1ml含0.01% TritonX-1OO的PBS裂解单层细胞；吸出各孔悬液，混匀，经1: 100稀释后各取100 μL涂布于改良CXD培养基，48h计数菌落，黏附力用黏附细菌数IQgltl cfu/ml值表示，至少3次生物学重复。
[0038]计数结果表示在只有空场弯曲杆菌的情况下，空场弯曲杆菌黏附力为3.31，而在加入菌株Scgz-1l培养后，后续再加入空场弯曲杆菌，空场弯曲杆菌的黏附力为2.08，这一结果说明在排除实验中，唾液乳酸杆菌Scgz-1l对空场弯曲杆菌粘附HeLa细胞具有明显抑制作用0° <0.05)。
[0039]综上所述，在上述竞争、置换、排除3种作用方式中，无论以哪种作用方式，唾液乳酸杆菌Scgz-1l对空场弯曲杆菌粘附HeLa细胞均具有明显的抑制作用iP < 0.05)。
[0040]5)动物体内实验
购入一日龄SPF鸡苗60只，随机分为A、B、C三组，每组20只，A组从一日龄开始口服唾液乳酸杆菌Scgz-1 I悬液(2 X 107cfu/ml) 200ul/只，一天一次，B、C组从一日龄开始口服同体体的生理盐水，其他处理一样，直到第7天为止；第八日龄给A、B两组口服空场弯曲杆菌悬液(2 X 107cfu/ml )200ul/只，一天一次，C组口服同体积的生理盐水，其他处理一样。每日观察并记录鸡的精神状况，食欲，饮水，粪便等情况。在投喂唾液乳酸杆菌Scgz-1l第0d、8d、lld、17d、21d称量其体重，绘制曲线图如图4所示。
[0041]从图4中可以看出，口服唾液乳酸杆菌Scgz-1l的A组鸡苗体重在12天后开始明显高于口服空场弯曲杆菌的B组体重，并且这种体重差随着培养时间的延长越来越明显，另外，在培养18天后，A组鸡苗体重开始明显重于C组对照组体重。
[0042]另外，根据对各实验组鸡苗其他方面的观察，口服唾液乳酸杆菌Scgz-1lA组鸡食欲旺盛，肛门周围绒毛洁净无粪便，肌肉丰满有弹性，羽毛皮肤整齐，有光泽。口服空场弯曲杆菌B组中部分鸡出现肛门周围绒毛带毛带有白色稀粪或有绒毛被粪便粘连的情况，羽毛无光泽。
[0043]上述结果说明，本发明的唾液乳酸杆菌Scgz-1l不仅可以有效抑制空场弯曲杆菌对禽类的伤害作用，可能还起到强健禽类肠胃的抵抗、吸收能力，促进禽类健康、快速地生长。
[0044]综上所述，所述的唾液乳酸杆菌Scgz-1l具有以下特性:
O抑制空场弯曲杆菌生长；
2)具有耐酸性，在pHl.5^3的环境生存良好；
3)具有耐胆 盐能力，能耐受:胆盐水平是0.2wt% ；
4)对细胞有较好的黏附能力；
5)抑制空场弯曲杆菌黏附细胞；
6)抑制空场弯曲杆菌对鸡的影响，提高鸡的体重。
[0045]根据上述实验结果,本发明的salivarius Scgz-1l菌株可应用于制备防治禽类空场弯曲杆菌感染的药剂，或者应用于制备改善禽类肠道菌群生态平衡的药剂。
[0046]人体口服益生菌到达肠道对益生菌来说是一种艰难的考验。其中益生菌的数量和保护技术至关重要。经过胃液的低pH，肠道中的各种消化酶和胆汁作用，益生菌才能到达肠道的特定位置。当积累到足够的数量时，益生菌粘附在肠细胞上，发挥其生理功能。在这一过程中菌种的存活率和活性都受到很大的影响。多种研究表明，益生菌在酸奶以及发酵食品中很难生存。益生菌制品中的益菌的数量至少达到IO6个/mL，益生菌才能在肠道内发挥其作用，而发酵乳制品中的益生菌的生物活性较低。其中双歧杆菌和嗜酸乳杆菌在酸性和胆盐的环境中存活量较低。
[0047]目前很多学者都把提高益生菌的数量和存活率作为研究的重点。在乳制品提高益生菌的数量和存活率的方法有很多:选择耐受性的菌种；在牛奶中增加膳食微营养物质，如氨基酸和多肽类物质；添加益生元；提高酸奶对pH的缓冲能力。然而，这些方法与微胶囊技术相比都有一定的局限性。微胶囊技术是利用天然的或者合成的高分子材料，将目标物包裹起成微小胶粒的一种技术。它使目标物与外界环境相隔绝，起到一种保护作用，保持目标物最大限度的活性。通常这种胶粒的半径为5~250um。制备个微胶囊的过程称为微胶囊化技术。利用微胶囊技术制备的益生菌微胶囊，要能耐低PH环境、胆汁及各种酶的作用，并能在肠道的特定位点中快速的释放，以免排除体外。
[0048]因此可以进一步'療冷Lactobacillus salivarius Scgz-11菌株的防治禽类空场弯曲杆菌感染或者改善禽类肠道菌群生态平衡的药剂制备成微胶囊制剂，应用到临床生产上。微胶囊制剂制备过程中可以通过包埋技术和冻干技术，让菌株做成粉末状态，以方便运输和保存；通过微胶囊技术可以提高细菌耐受胃酸胆盐的能力，提高细菌定植于机体肠道的数量 。
【权利要求】
1.一株唾液乳酸杆菌，其分类命名为to如&77心salivarius Scgz-11，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO:M2014080。
2.权利要求1所述的如^77心salivariusScgz-1l在制备防治禽类空场弯曲杆菌感染的药剂中的应用。
3.权利要求1所述的salivariusScgz-1l在制备改善禽类肠道菌群生态平衡药剂中的 应用。
【文档编号】C12N1/20GK103952357SQ201410183250
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】罗开健, 黄永兴 申请人:华南农业大学