专利名称：用于增强免疫功能的乳杆菌的制作方法
技术领域：
本发明是关于免疫功能增强剂，其可以增加人体干扰素的产生并增强人体免疫功能。
干扰素(IFN)由多种细胞产生，如白细胞、成纤维细胞和T淋巴细胞，它在受病毒感染时产生并保护其它细胞不受病毒感染。因此，干扰素具有抑制病毒繁殖的作用。
几种干扰素中，据报道IFN-α的产量在患癌症、糖尿病、结核病等的病人中降低，产IFN-α的能力与对感染的敏感性成负性相关。
另外，还报道了IFN-γ的产量在癌症病人中降低，而在患桥本氏病和自身免疫病等的病人中产量增高。
还已知IFN-γ的产生对人体免疫功能的贡献不同于IFN-α的产生所反映的贡献。
因此，产生IFN-α和IFN-γ的能力被作为评价人体免疫功能的有用参数。
增强这些免疫功能被认为可改善免疫功能缺陷病人的一般状况和生活质量。
为了增强免疫功能，已建议服用IFN或使用强免疫增效剂如OK 432。
已知自然杀伤细胞(NK)活性与癌症病人状况相关，众所周知服用IFN可增强NK细胞的活性。
但是，重复使用IFN或免疫增效剂如OK 432发现会引起副作用。如内环境紊乱、发热和不适。
因此，不是服用IFN，而是发展了免疫功能增强剂，其可以提高人体内干扰素的产生并增强免疫功能。实际上，已建议双螺旋RNA、吡喃共聚物、阴离子高聚物和多种多糖(见日本专利公开No.Hei.3-9882)作为免疫功能增强剂。
但是，因为这些熟知的免疫功能增强剂不是人体中自然存在的，所以这些增强剂有毒性，当用来治疗感染或肿瘤时，在人体中可产生副作用。
本发明的一个目的是提供一种免疫功能增强剂，它可增加干扰素的产生并增强人体免疫功能。使用免疫功能增强剂可治疗或预防感染和肿瘤。
在这一点上，本发明人已发现了一种包括短乳杆菌凝结亚种(Lactobacillus brevis subsp.coagulans)CCTCC M94025菌粉的免疫功能增强剂。
短乳杆菌凝结亚种菌粉可用例如以下步骤产生首先，作为乳杆菌(Lactobacillus)来源的起始菌种在25-35℃、100rpm速度搅拌下在下述培养基A、B或C中培养18-40小时。
然后，浓缩或离心培养液，再冷冻干燥为短乳杆菌凝结亚种菌粉。
培养基A①酵母膏 0.5%②葡萄糖 1.5%③磷酸二氢钾 0.5%④磷酸氢钠 2.0%⑤氯化钠 0.425%⑥氢氧化钠 0.0375%⑦脱脂黄豆提取物 8.75%⑧碳酸钙沉淀 0.1%培养基B蛋白胨(polypeptone) 0.5-1.0%酵母膏 0.5-1.0%葡萄糖 0.5-1.0%pH 6.5-7.0培养基C酵母膏 0.55%葡萄糖 1.10%蛋白胨 1.25%
磷酸二氢钠 0.025%磷酸氢钠 0.025%硫酸镁 0.01%硫酸锰 0.0005%pH 6.5-7.0制备培养基A时，组分①-⑦加热下溶解在水中。然后，溶液中加入组分⑧后，调节溶液pH为6.8-7.0，再在121℃高压蒸气灭菌15分钟。另外，脱脂黄豆提取物用下述步骤制备脱脂后，将黄豆浸在稀盐酸(约0.25N)中，加入胃蛋白酶，然后混合物在不时搅拌下在37℃保持40-48小时消化。消化后，加入氢氧化钠中和此溶液。然后离心此溶液，取出上清液作为脱脂黄豆提取物。
起始菌种最好从食物如乳杆菌(Tsukemono)发酵的蔬菜中得到。每种培养基A、B和C 50l产生100-500g细菌粉末，其中每g含20-500亿个细菌(2×109-5×1010/g)。
菌粉最好以粉末、片剂、胶囊或粒化粉末的形式口服给药。
制备片剂时，菌粉可与L-谷氨酸钠(10%)或与作为分散介质的脱脂奶粉(10%)和L-谷氨酸钠的混合物、及作为赋形剂的干马铃薯淀粉混合。
下面详细描述本发明的优选实施方案。
起始菌种得自乳杆菌发酵的日本芸苔属Suigukina变种(Bras-sica J a ponica Var.Suigukina)。起始菌种在25°-35℃下、在100rpm搅拌下，在培养基A中培养细菌30小时。然后约10000rpm离心培养液，并冷冻干燥成为细菌粉末，称其为短乳杆菌PK。
用这种方法得到的细菌粉末具有下列乳杆菌特征的特性(1)-(6)，基于它具有示于下表1的酵解特征，此细菌粉末还被鉴定为短乳杆菌凝结亚种。
(1)它为革兰氏阳性杆菌。
(2)它分解培养基中的碳酸钙。
(3)它用培养基中的葡萄糖产生乳酸。
(4)还原硝酸盐的能力为阴性。
(5)液化明胶的能力为阴性。
(6)消化酪蛋白的能力为阴性。
然后，将干马铃薯粉加到上述方法得到的菌粉中，并调节菌粉使其每g含108-109个细菌。再加入无水乳糖作为赋形剂。由此制备250mg的片剂。
每天年龄在25-65岁的4名健康男性和6名健康女性口服6个片剂，计4周。给药前及给药后2周和4周采外周血液于含肝素试管中。测定IFN-α和IFN-γ的产量、自然杀伤细胞(NK)活性和2-5A(2′，5′寡腺苷酸)合成活性，测定结果示于表2和表3。
IFN-α和-γ利用FL-细胞(来自人羊膜)和Sindobis病毒用50%CPE(细胞致病作用)的生物检测方法进行测定。
用于测定IFN-α的方法的一个例子描述如下肝素化外周血液用全血方法处理以产生IFN。然后离心管中收集2ml全血。加入HVJ(Sendai病毒)，其最终浓度为500HA/ml。37℃培养20小时，然后3，000rpm离心。收集上清液以测量IFN-α的产量。
下面描述用于测定IFN-γ的方法的一个例子肝素化外周血液在Eagle′s MEM中稀释4倍，加入PHA-P(购自Sigma)使终浓度为25μg/ml。37℃培养48小时后，3，000rpm离心，收集上清液作为IFN-γ样品。
在测定NK细胞活性时，用Ficoll-Paque方法从外周血中分离出外周单核细胞，这样得到了效应细胞。用Cr51标记的K562细胞作为靶细胞与效应细胞以E/T(效/靶)比为20∶1进行混合。用常规方法测定细胞毒性。
无刺激血浆中2-5A合成酶活性太低，检测不出，用HVJ(Sendai病毒)刺激血浆20小时后测其2-5A合成酶活性，以评价IFN-α的产生能力。用放射免疫测定试剂盒(Eiken Chemical Co.Tokyo生产)测定2′，5′-寡腺苷酸(2-5A)合成酶活性。
从表2和表3所示结果可清楚看出，上述方法制备的菌粉提高了IFN-α的产量、NK细胞活性和2-5A合成酶活性。
另外，菌粉在给药后，血液测试表明在任何个体中与标准值没有大的差异。
权利要求
1.组合物，其含有短乳杆菌凝结亚种(Lactobacillus brevis subsp.coagulans)CCTCC M94025菌粉。
2.权利要求1的组合物，其中所述短乳杆菌凝结亚种菌粉每克含有2×109-5×1010个细菌。
3.权利要求1或2的组合物，其形成粉剂、片剂、胶囊或粒化粉剂。
4.权利要求1或2的组合物，其中短乳杆菌凝结亚种得自乳杆菌发酵的日本芸苔属Suigukina变种。
5.权利要求3的组合物，其中短乳杆菌凝结亚种得自乳杆菌发酵的日本芸苔属Suigukina变种。
6.增强病人免疫力的方法，其包括给需要这种治疗的病人服用增强免疫力有效量的权利要求1的组合物。
7.增加人体内IFN-α的产量的方法，其包括给人服用增加IFN-α产量有效量的权利要求1的组合物。
8.提高人体自然杀伤细胞活性的方法，其包括给人服用提高自然杀伤细胞活性有效量的权利要求1的组合物。
9.提高人体内2-5A合成酶活性的方法，其包括给人服用提高2-5A合成酶活性有效量的权利要求1的组合物。
全文摘要
含有短乳杆菌凝结亚种的组合物用于增强病人的免疫功能，特别是关于增加干扰素的产生、2-5A合成酶活性和自然杀伤细胞活性。
文档编号A61K35/66GK1112959SQ9410630
公开日1995年12月6日 申请日期1994年5月30日 优先权日1994年5月30日
发明者岸田纲太郎 申请人:财团法人京都巴斯德研究所, 信和药品株式会社, 日本药品工业株式会社