专利名称：保加利亚乳杆菌，和含有该乳杆菌的食品组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有降低酸产生和(或)改善香味和味道产生性质的保加利亚乳杆菌。
本发明还涉及食品组合物，特别是含有本发明的保加利亚乳杆菌的淡味酸乳酪或淡味酸乳酪样制品。
两种乳酸菌嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的联合生长导致酸乳酪的生成。它们在牛乳中共同生长，使乳糖发酵成乳酸。乳糖在每升牛乳中含有大约40-50g。发酵完全时，通常在40℃需3-5小时，pH值由中性降低到大约4.2。在4-12℃存放数天，pH进一步降低到4.0以下。与此酸性增加之同时，出现苦味，产品的感官感受性质也大大降低了。
在发酵过程中可产生有代表性的酸乳酪香味的就是保加利亚乳杆菌。因此，丧失或降低了代谢活性的保加利亚乳杆菌细胞时，产生的酸乳酪就丧失了典型酸乳酪的香味成分，以致这样的酸乳酪(或酸乳酪样制品)可能是非常平平，即淡而无味。这个问题在生产淡味的或特淡味的酸乳酪时尤其突出，这是由于保加利亚乳杆菌受限制的生长速度导致失去了许多香味。
近年来愿意吃淡味的香味和有味道的酸乳酪的消费者数目似乎在增加。因此，酸乳酪制造商非常希望在牛乳发酵过程中有控制酸产生的方法，并且可避免在存放过程中pH降低的后酸变作用。迄今已提出数种方法或曲引菌种的改进以控制酸乳酪的变酸或后变酸作用。方法大多是降低曲引培养液的活性细胞数或用巴氏消毒法将终产品中的活细胞除去。还有一种方法是用低酸性的菌株。
美国专利US-A-4734361(Murao等)叙述了这样一种保加利亚乳杆菌(OLL1074)，已在日本保藏，编号为FERM BP1041。
该变种于较低温度下生成乳酸的趋势较低。
用这个变种可以产生的发酵牛乳或乳酸饮料在较低温度下降低了后酸变作用。
美国专利US-5071763(Somkuti等)叙述了嗜热链球菌突变株，它具有防御性的乳糖转运系统，并有gluS，lacS-，sucS+和βgal+表型，它们用在乳糖水解有重要作用的过程中是有效的。这类菌株的热稳定性以及产生β-半乳糖苷酶使乳糖水解作用先于巴氏消毒和在巴氏消毒过程中发生。这些微生物为食品工业提供了制造降低乳糖的奶酪制品的改进方法。
在保加利亚乳杆菌中乳糖被乳糖透性酶吸取，由β-半乳糖苷酶裂解成两部分葡萄糖和半乳糖。葡萄糖进一步代谢成丙酮酸，后者主要被D-乳酸脱氢酶(D-LDH)转化成乳酸。
然而，一些丙酮酸被脱羧成乙醛，它是酸乳酪的重要香味成分，或者进入其它代谢途径，生成香味或香味前体成分。
Thomas等(J.of Bacteriology，1974年5月，P.329-333)和Smart等(Applies and Environmental Microbiology，1987年3月，P.533-541)叙述了乳酸链球菌经降低LDH活性，使同乳酸发酵转变成异乳酸发酵。
Payton等(FEMS Microbiology letters，261985，P.333-336)叙述了嗜热脂肪芽孢杆菌的LDH负型突变株可增加乙醇的产生量(葡萄糖酵解后)，而它们丧失了产生乳酸的能力。
在J.of Bacteriology(144卷，No.1，1980，Baltimore，US，217-221页)的论文中提示，当保加利亚乳杆菌NLS-4菌株于有限的葡萄糖中厌氧连续培养时，介质的pH由酸性变成碱性，引起该正常的同发酵细菌以异发酵方式分解代谢葡萄糖，该发酵作用的改变伴有在碱性条件下乳酸脱氢酶(LDH)生物合成的降低。
然而酸乳酪是一种酸性介质，该论文未曾提示在酸性条件下可能降低乳酸脱氢酶的生物合成。
本发明的目的是提供一种具有能产生改善香味和味道的保加利亚乳杆菌。
本发明的另一目的是提供一种也具有可降低酸变和后酸变作用的保加利亚乳杆菌。
本发明的另一目的是获得一种食品组合物，优选为含有该保加利亚乳杆菌的淡味酸乳酪或淡味酸乳酪样制品，这种杆菌具有增加香味和味道产生的性质，和(或)降低的酸变和后酸变作用，优选于较低或较高温度时的酸变作用。
本发明涉及具有比野生型菌株Lfi5有较低的乳酸脱氢酶(LDH)活性的保加利亚乳杆菌(Lfi5菌株存放于巴斯德研究所，名为CNCM I-800，Docteur ROux大街28号，75024巴黎Cedex15，法国)。
有利的是，该乳酸脱氢酶活性比野生型菌株的乳酸脱氢酶活性低50%，优选低10%。
有利的是，该乳酸脱氢酶的活性在每10ml培养液中的酶活性低于250单位，优选低于150单位。
乳酸脱氢酶活性是通过在由8mM丙酮酸钠、0.15mM NADH、50mM tris-氯化物(pH7.5)构成的1ml反应混合物中NADH变成NAD+时于340nm吸光度的降低值测定的。1单位的酶活性的定义是于25℃每分钟氧化1μmol NADH的酶量。
本发明的保加利亚乳杆菌的另一特征是它比野生型菌株Lfi5的β-半乳糖苷酶(β-gal)活性更高。
有利的是，该β-半乳糖苷酶的活性比野生型菌株Lfi5的酶活性高200%，优选高500%。
有利的是，该β-半乳糖苷酶的活性为每10ml培养液中高于300单位的酶活性，优选高于500单位。
β-半乳糖苷酶活性按Miller J.H的方法测定(分子遗传学实验，冷泉港实验室，纽约，1972)。
将50μl无细胞萃取液加到由0.1M磷酸钠(pH7.0)，10mM KCl、1mM MgSO4、50mM 2-巯基乙醇构成的1ml Z缓冲液中，于28℃平衡后，加入预温热的200μl ONPG，于28℃温育20分钟，加入0.5ml1M Na2CO3使反应停止。
测定OD420吸光度。1单位的酶活性的定义是于28℃下每分钟可水解1μmol ONPG的酶量。
本发明的保加利亚乳杆菌优选的特征是，LDH活性与β-半乳糖苷酶活性之比低于0.8，最好低于0.3。
本发明分离出的保加利亚乳杆菌突变体显示有这样的反应能力的途径将丙酮酸转变成香味的途径多于乳酸的生成作用。
优选的是，本发明的保加利亚乳杆菌选自如下的保加利亚乳杆菌菌株CNCMI-1348，I-1349，I-1350。
这些菌株具有如下的特征-来源从买到的Nestle菌库中的保加利亚乳杆菌菌株中分离的突变体-形态学无鞭毛的直杆菌，无孢子形成，革兰氏阳性微生物，过氧化氢酶呈阴性，任选地厌氧菌
-糖酵解乳酸由以下物质产生-D-葡萄糖-D-果糖-D-甘露糖-乳糖-其它-降低了乳酸脱氢酶(LDH)活性，-网纹状性质(侧枝多糖的生成)。
具有降低了LDH活性的保加利亚乳杆菌突变体会增加产生有香味和味道的化合物。通过比较其LDH与β-半乳糖苷酶活性比(LDH/β-gal比)来分析被分离出的突变株，表明这些突变株不仅LDH活性低(高产出香味化合物，低产出乳酸)，而且事实上将更多的碳源转向芳香味化合物的产出的途径上(β-半乳糖苷酶活性)。
本发明还涉及含有该保加利亚乳杆菌的食品组合物。
有利的是，该食品组合物是酸乳酪或酸乳酪样制品，优选淡味的酸乳酪或淡味的酸乳酪样制品，制品中含有本发明的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。
本发明的酸乳酪或酸乳酪样制品的特征是，增加了香味和味道的产出，降低了酸变和后酸变。
图1表示生长行为(●为保加利亚乳杆菌Lfi5的OD600，▽为Lfi5的LDH/蛋白质×100，▼为LDH/β-gal)。
图2表示Lfi5突变株的LDH降低的情况(○为Lfi5，●为KTL50，▽为KTL6，▼为KTL8，□为KTL52，■为KTH1)。
图3表示介质中LDH对KTL50的影响(○为KTL50无LDH存在时;●为KTL50有LDH存在时)。
A.保加利亚乳杆菌致突变作用的优化介质和细菌保加利亚乳杆菌生长于10ml乳杆菌MRS肉汤中(0.5%酵母萃取液，1%肉萃取液，1%蛋白胨，0.1%吐温80，0.2%柠檬酸铵，0.5%醋酸钠，0.2%K2HPO4，0.01%MgSO4，0.005%MnSO4)于42℃温育。MRS琼脂平板于1升中含MRS和15g琼脂。MRSX-Gal琼脂平面板含有X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)浓度为25μg/ml。
保加利亚乳杆菌Lfi5菌株的致突变作用是按照Silhavy的方法用紫外线致突变或用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)致突变(T.J.Silhavy，M.L.Berman和W.Enquist(1984)，用基因融合实验冷泉港实验室)。
用MNNG致突变的突变频率比用紫外线致突变的突变频率要高7倍。
B.乳酸脱氢酶的低活性突变体的筛选培养过夜的致突变的细胞稀释后接种在MRS琼脂平板上，于42℃温育过夜。收获单个菌落于250μl MRS肉汤中，于微滴板(FALCON3072)上42℃生长过夜。将每种细胞50μl悬浮液点吸在膜滤器(杜邦公司GeneScreen)上。滤膜放在用溶细胞液、1mg/ml溶菌酶和50μg/ml变溶菌素的水溶液饱和的3M Whatman过滤器上，37℃温育30分钟，然后将过滤器放在氯仿蒸汽中30分钟，空气中挥干，于-80℃冷冻30分钟。用50mM Tris-氯化物缓冲液(pH8.0)洗涤，以除去细胞碎片。洗过的过滤器浸泡于染色液、134mM D-乳酸钠、2mM氯化碘硝基四唑盐，1.4mM NAD+、0.5mM硫酸单甲酯N-甲基非那宗盐、50mM Tris-氯化物缓冲液pH8.0中1-4分钟。为了停止反应，用0.1N HCl洗涤过滤器。在平板上各个菌落的红染色强度相应于乳酸脱氢酶活性。将显示弱信号的细胞转移到10ml新鲜的MRS肉汤中42℃温育过夜。离心收获细胞，并悬浮在含有15%甘油的1ml MRS肉汤中。此细胞悬浮液存放于-80℃中。
制备无细胞萃取液10ml预温热的新鲜的含有2%乳糖的MRS肉汤中接种2%的过夜的培养液，于42℃温育7小时，离心收获细胞，用50mM Tris-氯化物(pH8.0)、100mM NaCl、2mM EDTA、1mM PMSF、1mM DTT缓冲液洗涤2次，再悬浮于此缓冲液1ml中。向其中加入100μl 10mg/ml溶菌酶溶液和50μl 1mg/ml变溶菌素溶液，于37℃温育10分钟。于12000rpm离心30分钟以除去细胞碎片。乳酸脱氢酶测定
乳酸脱氢酶的活性是通过NADP于50mM Tris-氯化物(pH7.5)中转变成NAD+于340nm吸光度的降低值测定的。1单位的酶活性定义为25℃每分钟氧化1μmol NADH的酶量。
β-半乳糖苷酶测定用Miller的方法测定β-半乳糖苷酶活性(分子遗传学实验，冷泉港实验室，纽约，1972)。50μl无细胞萃取液加到1ml Z缓冲液(0.1M磷酸钠(pH7.0)，10mM KCl、1mM MgSO4、50mM 2-巯基乙醇)中，于28℃平衡后加入预温热的200μl ONPG，28℃温育20分钟。加入0.5ml 1M Na2CO3以停止反应。测定OD420吸光度。1单位的酶活性定义为28℃每分钟水解1μmol ONPG所需的酶量。
蛋白质测定用Bradford染料给合试验测定总蛋白质浓度(M.M.Bradford，Anal.Biochem.1976，72248-254)，使用Bio-Rad试剂盒测定。
保加利亚乳杆菌Lfi5和YL30致突变法如前(表1)所述。收取MNNG致突变的Lfi5细胞菌落3388个、紫外致突变的Lfi5细胞菌落616个、MNNG致突变的YL30细胞菌落1078个，进行测定。用膜测定法第1次筛选鉴定出152个菌落为LDH突变体。图1是该结果的一个实例。
在此筛选中鉴定的候选菌株用于测定LDH活性。每个候选菌株于含有2%乳糖的MRS介质中生长，在早期静止对数期收获细菌，这时活性最高。将细胞与变溶菌素和溶菌酶温育以使之溶解。其它方法也进行测定，总结于表2中。玻璃珠方法按Abbondi所述进行(M.E.Abbondi，S.Pandian，G.Trepanier，R.E.Simard和B.H.Lee，J.Food Sci，1991，56948-953)。
LDH活性是用每无细胞萃取液中总细胞蛋白质中总LDH单位的比活性来确定的。随着细胞的生长LDH的比活性连续增高(图2)。由于β-半乳糖苷酶也是酵解途径的一个重要酶，LDH与β-半乳糖苷酶活性比应是恒定的。事实上，该比值在由中间对数期到早期静止期几乎是恒定的。通过评价该比值，总LDH对β-半乳糖苷酶活性之比，来鉴别突变株。结果列于表3。
突变株分类成6组。第1组有较低的总LDH活性，在平均值以下-20%，但β-gal活性保持正常水平。低LDH/β-半乳糖苷酶比值只是由于低LDH突变造成的。第2组也是有较低的LDH活性，但其β-gal活性比野生型的平均值高。
第1、2、3和4组都是低LDH突变株，具有低LDH/β-半乳糖苷酶比值和较低的总LDH活性。13个Lfi5突变株和10个YL30突变株属于这些组内。这两株的突变频率分别是3.8×10-3和8.3×10-3。
KTL50、78、81、KTY41、18和46的LDH/β-半乳糖苷酶比值(1100-1200)比野生型菌株的比值低。而且，其总β-gal活性是不变的。
第5组的突变株显示正常的酶活性，然而其β-gal活性增高了。
对第1组的KTL50和KTH1株、第2组的KTL6、第3组的KTL52和第5组的KTL8检查了生长行为和后酸变作用。
C.低LDH活性突变株的特征鉴定低LDH活性突变株的酸变作用生长曲线突变株接种于含有2%乳糖的预温热的MRS 17ml的pyrex培养管(16×150mm)中，浓度为2%，于42℃温育。每隔30分钟测定OD550的光密度。
pH曲线突变株以2%浓度接种于含2%乳糖的预温热的MRS肉汤中，42℃温育，每隔30分钟测定pH。
在混合培养的酸乳酪测定中低LDH活性的突变株的后酸变作用。
起始培养的接种物菌由嗜热链球菌标准市售菌株1.5%Sfi16和1.5%Sfi21，以及0.8%保加利亚乳杆菌候选株所组成。酸乳酪是用150ml巴氏消毒牛乳、3%再制脱脂牛乳，1.5%乳脂制备的，用上述混合培养液接种，于40℃培养直到pH值达4.6左右。然后冷却到4℃过夜，存放于4℃或12℃下26天。在温育后的第7天、第14天和第26天检查pH值、感官的感觉和细胞数。
结果列于表4。酸乳酪于4℃保存26天后才呈现微弱的后酸变作用。突变株和野生型菌株保持其pH值在4.3以上。在野生型菌株和低LDH突变株之间的pH值有很小的差异(大约0.1)。于12℃存放的培养物则有后酸变作用，野生型菌株Lfi5在26天后酸变，pH达到4.0，而低LDH突变株KTL50和KTH1的pH值仍保持在4.2。
保加利亚乳杆菌KTL1，18和42菌株根据布达佩斯条约，提交于Collection N ationale de Cultures de Microorganismes(CNCM)，(巴斯德研究所，Docteur Roux街28号，75024巴黎Cedex15，法国)，编号为CNCM No.I-1348，CNCM I-1349和CNCM I-1340。
本发明用如下实施例加以说明。
实施例1500ml含9%再制粉状脱脂牛乳中加入0.1%酵母萃取物，于121℃高压釜中灭菌15分钟，加入10%(体积)含有大约5×106微生物/cm3的保加利亚乳杆菌CNCM I-1348(KTL1)菌株的活性培养液。
于40℃温育此混合物4小时，得到含有大约2.5×108微生物/cm3的发酵物。
用同样的方法由市售的嗜热链球菌菌株活性培养液得到含有大约5×108浓度的嗜热链球菌/cm3的发酵物。
向含有1.5%脂肪的标准批号的牛乳中加入3%脱脂奶粉，于90℃巴氏消毒30分钟，向其中加入1%体积的保加利亚乳杆菌菌株CNCM I-1348(KTL-1)和3%(体积)的市售的嗜热链球菌菌株。
微弱搅拌后，放入发酵缸内40℃温育4小时20分钟，直到pH4.62。
得到的酸乳酪是质地良好，味道含人感到满意的产品。菌数为大约1×109嗜热链球菌/cm3和大约1×108保加利亚乳杆菌/cm3。
实施例Ⅱ如同实施例1，制备保加利亚乳杆菌CNCM I-1349(KTL18)发酵物，温育8小时后，含有大约3×188个微生物/cm3。
向标准的牛乳(如实施例1所述)中加入1%保加利亚乳杆菌CNCM I-1349(KTL18)发酵物和3%嗜热链球菌发酵物，得到的酸乳酪pH为4.61。
于40℃温育4小时40分钟，得到大约8×106嗜热链球菌/cm3和大约1×107保加利亚乳杆菌/cm3。
这种质地非常松软的酸乳酪有令人满意的新鲜牛奶味。
实施例Ⅲ按照本发明的上述实施例方法，得到保加利亚乳杆菌CNCM I-1350(KTL42)菌株。
5小时后，得到的发酵物中含有大约5×108个微生物/cm3。
按照实施例1的方法，温育3小时45分钟后得到的酸乳酪pH为4.62。其中含有大约1×109嗜热链球菌/cm3和大约2×108保加利亚乳杆菌/cm3。
除有很漂亮的质地外，还有非常典型的酸乳酪味道。
这些产品于4℃和12℃进行保存试验和味道试验，分别在1，7，14和26贮存日检查pH和味道。
结果列于表5。
对比试验根据实施例1所述的方法，用三个突变株CNCM I-1348、CNCM I-1349和CNCM I-1350(KTL1，18，42)的原始菌株得到的酸奶酪作为对照品。
温育3小时45分钟后，酸乳酪的pH为4.54，含有大约1×109个嗜热链球菌/cm3和大约2×108个保加利亚乳杆菌/cm3。
1 PH达到4.6的温育时间然后取出酸乳酪，存于4或12℃2 26日后酸乳酪培养物的每1ml中含保加利亚乳杆菌的细胞数
上述实施例表明，CNCM I-1348，CNCM I-1349和CNCM I-1350(KTL1，18，42)突变株降低了LDH活性，可以产生非常令人感兴趣的质地和味道以及后酸变作用。此外，在非常高pH条件下可得到非常不同的味道。
权利要求
1.保加利亚乳杆菌，其特征是乳酸脱氢酶活性比野生型保加利亚乳杆菌菌株的乳酸脱氢酶活性低50%，优选低10%。
2.权利要求1所述的保加利亚乳杆菌，其特征是每10ml培养液中乳酸脱氢酶活性低于250酶活性单位，优选低于150酶活性单位。
3.权利要求1或2所述的保加利亚乳杆菌，其特征是β-半乳糖苷酶活性比野生型保加利亚乳杆菌菌株的β-半乳糖苷酶活性高200%，优选高500%。
4.权利要求3的保加利亚乳杆菌，其特征是每10ml培养液中β-半乳糖苷酶活性高于300单位，优选高于500酶活性单位。
5.权利要求3或4的保加利亚乳杆菌，其特征是，LDH活性与β-半乳糖苷酶活性之比低于0.8，优选低于0.3。
6.权利要求1-5中任何一项的保加利亚乳杆菌，其特征是，选自如下的保加利亚乳杆菌菌株CNCM I-1348，CNCM I-1349和CNCM I-1350。
7.包括有按照权利要求1-6中任何一项的保加利亚乳杆菌的食品组合物。
8.权利要求7的食品组合物，其特征是一种酸乳酪，优选为淡味酸乳酪，或优选为淡味的酸乳酪样制品。
全文摘要
本发明涉及保加利亚乳杆菌，它与野生型保加利亚乳杆菌相比，乳酸脱氢酶活性要低50％，优选低10％。本发明还涉及含有该保加利亚乳杆菌的食品组合物。
文档编号C12R1/225GK1108302SQ9411500
公开日1995年9月13日 申请日期1994年8月5日 优先权日1993年8月6日
发明者J·E·格曼德, H·霍丁格, O·米格罗特, B·莫里特, K·茨达 申请人:雀巢制品有限公司