专利名称：一株具有延缓后酸化作用保加利亚乳杆菌菌株及其应用的制作方法
一株具有延缓后酸化作用保加利亚乳杆菌菌株及其应用
技术领域：
本发明涉及一株利用硫酸新霉素诱变、筛选得到的具有延缓后酸化作用的保加利亚乳杆菌菌株，以及该菌株的筛选方法及其在发酵工业中的应用，属于生物发酵技术领域。
背景技术：
乳酸菌在发酵乳糖过程中能产生多种代谢产物，这些乳酸菌及其生产的代谢产物不仅具有平衡肠道菌群、降低胆固醇、抗肿瘤、免疫以及延缓衰老等生理功能，还赋予产品良好的口感和风味。我国使用的酸奶发酵剂主要有嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌。一般认为，保加利亚乳杆菌在低PH环境下能继续发酵乳糖，是引起酸奶后酸化现象的主要菌株。目前，控制酸奶后酸化的方法主要有:调整酸奶发酵剂保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的比例；在发酵乳中添加nisin等细菌素控制保加利亚乳杆菌的生长和代谢能力；改变细胞膜的通透性，抑制保加利亚乳杆菌的代谢等。其中，降低保加利亚乳杆菌的生长和能量代谢是控制后酸化现象的有效方法。H+-ATPase酶是控制乳酸菌能量代谢的一个关键酶。H+-ATPase位于乳酸菌细胞膜上，既能催化ATP的合成与水解也能调节跨膜的质子梯度，其活性随pH的降低而增强，其数量也随着pH值的下降而增多。当外界环境中pH降低时，H+-ATPase能通过水解ATP释放出自由能，推动细胞内的质子泵出胞外，形成膜PH梯度差，从而使细胞内pH维持在中性附近，使细胞内酶的活力不受影响。很多乳酸菌含有H+-ATPase,如短乳杆菌、乳酸乳球菌、乳酸链球菌和嗜热链球菌等。 硫酸新霉素(neomycin)是一种能抑制细菌生长的抗生素,利用硫酸新霉素能筛选出具有低H+-ATPase活力的菌株。其原理在于硫酸新霉素进入细胞是一个耗能的过程，需要H+-ATPase的协助，因此只有低H+-ATPase活力的菌株才能在含有硫酸新霉素的筛选培养基上生长。目前，已有一些关于利用硫酸新霉素筛选具有低H+-ATPase活力菌株的报道，包括乳酸乳球菌、瑞士乳杆菌、酒类酒球菌等，这些诱变菌株对低PH环境敏感，具有改变的细胞膜通透性以及降低生长和能量代谢能力。本发明针对“酸奶后酸化”这一乳品加工业的关键技术问题，以从我国青海的传统发酵乳制品中分离筛选出来的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06为出发菌株，利用硫酸新霉素诱变、筛选出一株具有弱H+-ATPase活性的菌株，并进一步研究了其在脱脂乳培养基中的产酸能力，可从根本上解决产品后酸化问题。
发明内容为了解决保加利亚乳杆菌在酸奶储存期间引起的后酸化现象，本发明使用硫酸新霉素诱变、筛选出一株H+-ATPase缺陷型保加利亚乳杆菌，该菌株在脱脂乳培养基中具有弱的产酸能力，作为弱后酸化酸奶发酵剂使用。本发明所述的具有弱H+-ATPase活性的保加利亚乳杆菌菌株是利用硫酸新霉素诱变德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06 (L.delbrueckii subsp.bulgaricus ND06)后筛选获得的，其中原始的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06 (Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ND06)该菌株已于2013年I月15日保存在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCCN0.7133，筛选获得的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种的分类命名为 Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ND06-2,德氏乳杆菌保加利亚亚种 NDO6-2 (Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ND06-2)已于 2Ol3 年 I 月15日保存于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCCN0.7134。本发明还涉及所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在制备发酵乳、发酵食品中的应用，所述菌株在42°C培养72h后，发酵乳pH值从6.44降至4，发酵乳PH值的下降幅度明显低于出发菌株pH值的下降幅度，具有弱后酸化作用。所述菌株在42°C发酵后，在室温25°C储藏21d期间，pH值的变化范围在4.57 4.07的范围内。所述菌株在42 °C发酵后，在室温储藏21d期间，pH值下降了 0.5pH单位。本发明还涉及所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株菌作为酸奶发酵剂的用途。另一方面，本发明还涉及包含权利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株菌的发酵乳、发酵食品，所述发酵食品可以是酸奶。本发明提供了一种控制酸奶后酸化的方法，该方法是利用硫酸新霉素诱变出具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种。本发明通过改变野生菌株的H+-ATPase活性来改变菌种生理特性，降低菌株的生长、代谢和产酸能力，同时避免了基因工程改良菌种带来的外缘DNA问题，具有一定的安全性，能缓解酸奶的后酸化现象，提高产品的稳定性。根据本发明的实施方案，利用硫酸新霉素诱变具有弱H+-ATPase活性的保加利亚乳杆菌的方法是向MRS培养基中添加硫酸新霉素，硫酸新霉素在MRS培养基中的添加浓度为50-500 μ g/mL。硫酸新霉素的浓度对于控制酸奶后酸化起着非常重要作用，当MRS培养基中硫酸新霉素的浓度过低时，对控制平板上的耐硫酸新霉素菌落的数量不明显，当硫酸新霉素浓度过高时，会抑制耐硫酸新霉素菌落的生长。利用硫酸新霉素筛选出的具有弱H+-ATPas e活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2，其在MRS培养基中培养18h后，H+-ATPase活性为0.44 μ mol/mg.min，和出发菌株相比H+-ATPase活力降低了 44%，具有弱的H+-ATPase活性。利用硫酸新霉素筛选出的具有弱H+-ATPas e活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2作为发酵剂使用时，421:培养0、4、8、12、16、20、24、36、48和72h后，发酵乳的pH值高于出发菌株ND06发酵乳的pH值。利用硫酸新霉素筛选出的具有弱H+-ATPas e活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2作为发酵剂使用时，42°C培养0、4、8、12、16、20、24、36、48和72h后，发酵乳的乳酸、乳糖和和半乳糖的代谢能力均低于出发菌株ND06。利用硫酸新霉素筛选出的具有弱H+-ATPase活性的保加利亚乳杆菌作为发酵剂使用时，42°C发酵后，在室温(25°C)储藏期间，发酵乳的pH值高于出发菌株ND06发酵乳的pH值。利用硫酸新霉 素筛选出的具有弱H+-ATPase活性的保加利亚乳杆菌作为发酵剂使用时，42°C发酵后，在室温(25°C)储藏期间，发酵乳的乳酸含量明显低于出发菌株发酵乳的乳酸含量。一种具有弱H+-ATPase活力的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2的制备方法:①菌种活化将_70°C保存的ND06菌株接种于脱脂乳培养基中，37°C培养24h后，在MRS培养基中传代2 3次。②硫酸新霉素溶液的配制硫酸新霉素溶液配制浓度为0.1 g/mL,经0.22 μ m膜过滤灭菌后，_20°C储存。③硫酸新霉素诱变将活化后的ND06菌株接种于MRS培养基中，37°C培养8h，使用PBS缓冲液(pH7.2)稀释后，取100 μ L涂布于含有硫酸新霉素的MRS平板上，其中，硫酸新霉素的浓度为50、100、150、200、250、300、350、400、450 和 500 μ g/mL。37°C培养 72h 后，选取菌落数在 30 300之间的平板，挑选单个菌落接种于MRS液体培养基，继续培养24h，检测OD66tl和pH值，挑选OD660〈l和pH > 4.8的菌株。④硫酸新霉素诱变菌株的纯化将挑选出的诱变菌株接种于MRS液体培养基中，37°C培养24h，适当稀释后，涂布于MRS平板上，继续培养48h，挑选单个菌落，-80°C保存。⑤ND06-2菌株的低温冷冻真空保存
将步骤④筛选出的具有弱H+-ATPase活性的ND06-2菌株接种到MRS培养基中培养18h后，离心收集菌体，用PBS缓冲液洗2遍后，加入冻干保护剂低温冻干保存。另一方面，本发明提供了一种酸奶的制备方法，该方法的具体操作步骤如下:①均质:以牛奶为主要原料，将牛奶升温至60°C，20MPa条件下均质；②杀菌:95°C条件下灭菌IOmin;③接种，发酵:杀菌后的原料降温至42°C，发酵剂的接种量为1.0X107cfU/mL，发酵时间为4 5h，待发酵乳的pH值降至4.5时，终止发酵，将发酵乳降温灌装，然后在常温储藏。综上所述，本发明利用含有硫酸新霉素的MRS培养基筛选得到的可以作为弱后酸化发酵剂使用的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2,分类命名为Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricusND06-2,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心保藏登记号为CGMCCN0.7134。该菌株的H+-ATPase活力只有出发菌株的44%，在脱脂乳培养基中乳酸、乳糖和半乳糖的代谢能力明显低于出发菌株，可以作为弱后酸化的酸奶发酵剂使用。在我国的许多地区，酸奶在运输、存储和销售过程中的冷链系统并不完备，因此在市场终端常出现后酸化等质量问题。使用具有弱tf-ATPase活性的保加利亚乳杆菌作为酸奶发酵剂，可以使酸奶的后酸化程度弱化，延长产品的货架期。
图1磷标准曲线。参考实施例2图2蛋白标准曲线。参考实施例2图3ND06及其诱变菌株ND06-2的H+-ATPase活性。参考实施例2
图4ND06及其诱变菌株ND06-2在42 °C条件下发酵乳中半乳糖含量的变化。参考实施例5图5ND06及其诱变菌株ND06-2在42°C条件下发酵乳中乳酸含量变化。参考实施例5图6ND06及其诱变菌株ND06-2在42°C条件下发酵乳中乳糖含量变化。参考实施例5图7ND06及其诱变菌株ND06-2在室温(25°C )储藏期间乳酸含量的变化。参考实施例具体实施方式
:下面结合附图和实施例对 本发明作进一步描述。实施例1:一种具有弱H+-ATPase活力的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2的筛选方法所述具有弱H+-ATPase活力的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2菌株是利用硫酸新霉素诱变保加利亚乳杆菌ND06 (L.delbrueckiisubsp.bulgaricusND06)后筛选获得的，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCN0.7134，筛选获得该菌株的方法如下:1.菌种活化将_70°C保存的保加利亚ND06菌株接种于脱脂乳培养基中，37°C培养24h后，在MRS培养基中传代2 3次。2.硫酸新霉素溶液的配制硫酸新霉素溶液配制浓度为0.1 g/mL,经0.22 μ m膜过滤灭菌后，_20°C储存。3.硫酸新霉素诱变将活化后的ND06菌株接种于MRS培养基中，37°C培养8h，使用PBS缓冲液(pH7.2)稀释后，取100 μ L涂布于含有硫酸新霉素的MRS平板上，其中，硫酸新霉素的浓度为50、100、150、200、250、300、350、400、450 和 500 μ g/mL。37°C培养 72h 后，选取菌落数在 30 300之间的平板，挑选单个菌落接种于MRS液体培养基，继续培养24h，检测OD66tl和pH值，挑选OD660〈l和pH > 4.8的菌株。4.硫酸新霉素诱变菌株的纯化将挑选出的诱变菌株接种于MRS液体培养基中，37°C培养24h，适当稀释后，涂布于MRS平板上，继续培养48h，挑选单个菌落，-80°C保存。5.ND06-2菌株的低温冷冻真空保存将步骤4筛选出的具有弱H+-ATPase活性的ND06-2菌株接种到MRS培养基中培养18h后，离心收集菌体，用PBS缓冲液洗2遍后，加入冻干保护剂在低温冻干保存，所述的冻干保护剂的配方为:脱脂乳10%，谷氨酸钠0.1%，无菌水90%。实施例2:具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2的H+-ATPase活性检测测定本申请说明书实施例1所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2的H+-ATPase活性，具体检测方法及检测结果如下:
1.建立磷含量标准曲线参考Ongol等报道的方法建立了磷含量标准曲线。使用KH2PO4分别配制成PO43-浓度为 0mol/mL、0.2mol/mL、0.4mol/mL、0.6mol/mL、0.8mol/mL、L Omol/mL、L 2 μ mol/mL 的标准溶液系列。从上述标准溶液中分别量取350 μ L溶液，加入815 μ L染料，混合后在18°C培养15min，测定OD66tl值，建立磷含量标准曲线(图1)。其中，染料由5N硫酸、25g/L钥酸铵、10g/L甲氨基苯酚硫酸盐、30g/L亚硫酸钠以及蒸馏水(I:1:1:1:4)混合而成。2.H+-ATPase 酶粗提将出发菌株ND06及其诱变菌株接种于MRS液体培养基中，37°C培养18h，离心收集菌体(3500 X g, IOmin, 4°C )，加入 250 μ L 浓度为 75mMTris_HCl 缓冲液(IOmMMgSO4, pH7.0),混匀后加入25 μ L甲苯，37°C水浴5min。细胞的冻融是在_80°C的乙醇和37°C水浴锅中进行的，冻融循环反复进行2次后，12，000 Xg离心lOmin，弃去上清液，加入上述含有MgSOJATris-HCl缓冲液200 μ L后，震荡混匀，用液氮迅速冻结，_80°C保存。3.H+-ATPase 活性测定从上述细胞粗提取物中取出25 μ L，添加到ImL浓度为50mMTris-maleate缓冲液(IOmMMgSO4, pH6.0)中。该混合液在37°C水浴锅中水浴5min后，添加50 μ LATP (TaKaRa,
0.1Μ)，在水浴锅中继续反应15min，然后加入600 μ L的0.1NHCl终止反应，反应物置冰上迅速冷却后，离心(5000 X g，IOmin, 4°C )，收集上清液。吸取350 μ L上清液中加入815 μ L染料中，18°C反应15min后,测定反应物的OD66c!值,根据磷含量标准曲线计算反应物中无机磷酸盐的含量。采用Bradford方法测定蛋白质的含量。吸取270 μ LTris-maleate缓冲液与酶粗提物的混合液，加入15 μ L10%SDS和15 μ LlONNaOH,煮沸lOmin，在冰上迅速冷却后，测定反应溶液中蛋白质的含 量。H+-ATPase的活性用μ mol/mg.η η来表示,其中每个活力单位定义为ImgH+-ATPase的粗提取物在Imin内分解ATP形成I μ mo I的无机磷酸盐。4.H+-ATPase活性的测定结果在pH6的条件下测定的ND06及其诱变菌株ND06-2的H+-ATPase酶活，结果如图3(ρ〈0.05)所示。ND06及其诱变菌株ND06-2的H+-ATPase活力分别为0.99和0.44 μ mol/mg.π η，诱变菌株ND06-2的H+-ATPase活力和出发菌株相比降低了 44%，和出发菌株相比，诱变菌株ND06-2具有明显较弱的H+-ATPase活性。实施例3-6说明实施例1所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06-2菌株在乳品加工业中的应用，尤其是其在脱脂乳培养基中的弱后酸化作用。实施例3:ND06及其诱变菌株ND06-2在42°C培养时发酵乳pH值的变化将ND06 及其诱变菌株 ND06-2 在 42°C培养 0、4、8、12、16、20、24、36、48 和 72h 后，对比发酵乳PH值的变化。具体步骤如下:1.主要操作步骤:将ND06和诱变菌株ND06-2以1.0 X 107cfu/mL分别接种于12%的脱脂乳培养基中，42°C培养0、4、8、12、16、20、24、36、48和72h后发酵后，检测发酵乳pH值的变化。2.发酵乳pH值的测定ND06及其诱变菌株ND06-2在42°C培养0_72h时发酵乳pH值的变化如表I所示。ND06-2及其出发菌株ND06在42°C发酵16h时，pH值均降到4.5左右，在发酵20、24、36、48和72h时，ND06-2发酵乳的pH值分别为4.4、4.13、4.1、4.08和4，和出发菌株ND06发酵乳的PH值相比，分别高出0.1,0.12,0.3,0.43和0.49，诱变菌株发酵乳pH值的下降幅度明显低于出发菌株发酵乳PH值的下降幅度，可见诱变菌株ND06-2在发酵乳中的产酸能力要低于出发菌株。表1ND06及其诱变菌株ND06-2在42 V培养0_72h时发酵乳的pH值
权利要求
1.一种具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种，其特征在于所述具有弱H+-ATPase活性的保加利亚乳杆菌菌株是利用硫酸新霉素诱变德氏乳杆菌保加利亚亚种 ND06 (LactobaciIlusdelbrueckiisubsp.bulgaricusND06)后筛选获得的，德氏乳杆菌保加利亚亚种ND06，于2013年01月15日保藏在北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCN0.7133。
2.一种具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，其特征在于所述具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的分类命名为(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricusND06_2),该菌株已于 2013 年 01 月 15 日保存于北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCN0.7134。
3.权利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在制备发酵乳、发酵食品中的应用。
4.权利要求3所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在制备发酵乳、发酵食品中的应用，其特征在于:所述菌株在42 V培养72h后，发酵乳pH值从6.44降至4，发酵乳pH值的下降幅度明显低于出发菌株pH值的下降幅度，具有弱后酸化作用。
5.权利要求3所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在制备发酵乳、发酵食品中的应用，其特征在于:所述菌株在42°C发酵后，在室温25°C储藏21d期间，pH值的变化范围在4.57 4.07的范围内。
6.权利要求3所述的具有弱H +-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在制备发酵乳、发酵食品中的应用，其特征在于:所述菌株在42 °C发酵后，在室温储藏21d期间，pH值下降了 0.5pH单位。
7.权利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株菌作为酸奶发酵剂的用途。
8.包含权利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株菌的发酵乳、发酵食品。
9.权利要求6所述的包含权利要求1所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株菌的发酵乳、发酵食品，其特征在于所述发酵食品是酸奶。
10.利用权利要求2所述的具有弱H+-ATPase活性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株ND006-2制备酸奶的方法，该方法的具体操作步骤如下: ①均质:以牛奶为主要原料,将牛奶升温至60°C，20MPa条件下均质； ②杀菌:95°C条件下灭菌IOmin; ③接种，发酵:杀菌后的原料降温至42°C，发酵剂的接种量为1.0X107cfU/mL，发酵时间为4 5h，待发酵乳的pH值降至4.5时，终止发酵。
全文摘要
本发明涉及一株具有弱H+-ATPase活性的保加利亚乳杆菌及其筛选方法和应用，所述的保加利亚乳杆菌分类命名为Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ND06-2，保藏登记号为CGMCC No.7134，可以作为弱后酸化发酵剂使用。本发明利用含有硫酸新霉的MRS平板筛选，得到一株具有弱H+-ATPase活性的菌株，该菌株在脱脂乳中乳酸、乳糖和半乳糖的代谢能力明显低于出发菌株，可以作为弱后酸化的酸奶发酵剂在工业生产中使用。
文档编号C12N1/20GK103215199SQ20131007932
公开日2013年7月24日 申请日期2013年3月13日 优先权日2013年3月13日
发明者张和平, 丹彤 申请人:内蒙古农业大学