专利名称：一种保加利亚乳杆菌冻干保护剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于保加利亚乳杆菌保存技术领域，涉及一种保加利亚乳杆菌冻干保护剂及其制备方法。
背景技术：
保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)是正常人体肠道中极为重要的生理菌群之一，具有维持人体微生态平衡、促进消化、防癌抗癌、增强免疫力、抗衰老等作用，与机体健康息息相关。目前保加利亚乳杆菌菌粉的制备主要采用真空冷冻干燥技术，但保加利亚乳杆菌如果直接进行冷冻干燥，不可避免地会造成部分细胞的死亡或损伤，对生产十分不利。有报 道称如果将其培养液直接进行冷冻干燥，其存活率仅10%_30%左右。而影响菌体冷冻干燥的存活率的因素是多方面的。包括菌株、细胞大小及形状、生长阶段及生长速率、初始菌悬液浓度、培养基组成、PH值、保护剂、预冻条件、降温速率、冻干条件、细胞含水量、细胞膜成份及复水条件等，其中保护剂的影响最为突出。一种效果好的保护剂要求在冷冻干燥过程中可以提供保护作用，它可以改变样品冷冻干燥时的物理、化学环境，减轻或防止冷冻干燥过程对菌体的损害，尽可能保持菌体原有的各种生理生化特性和生物活性。关于保加利亚乳杆菌保护剂的报道有很多，主要集中于医学和生物学领域。蒲丽丽等研究了多种保护剂对保加利亚乳杆菌的保护作用，发现海藻糖的保护效果最好，它能显著抑制冰晶生成的形态不稳定性。在发酵液中添加保护剂能够抑制冷冻干燥过程中共晶现象的发生，提高菌体的抗冷冻能力。侯敏娜等以正交实验方法对保加利亚乳杆菌保护剂进行研究。结果表明，10%蔗糖、5%乳糖、3%甘油和0.4%谷氨酸钠为最佳配方组合。张泽生等采用响应面分析法筛选并优化了保加利亚乳杆菌冻干保护剂，发现在众多物质中脱脂乳、海藻糖、菊粉、麦芽糊精对菌种保护作用突出。田丰伟等研究了冻干保护剂组成对保加利亚乳杆菌18冷冻干燥存活率和活力的影响。实验表明，3%复原脱脂乳、3%乳糖、3%甘油组成的冻干保护剂，使冻干存活率达到68.9%，具有较快的产酸能力。东北农业大学的张英华等通过单因素比较和正交试验设计，确定适合保加利亚乳杆菌的最佳冻干保护剂配方脱脂乳粉8%、海藻糖1%、甘油2%、谷氨酸钠I. 5%。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种保加利亚乳杆菌冻干保护剂及其制备方法，用于制备高活性菌粉，在制备菌粉的过程中加入冻干保护剂，可提高菌体的抗冷冻能力，从而提高菌粉的冻干存活率。本发明是通过以下技术方案来实现一种保加利亚乳杆菌冻干保护剂，以质量份数计，包括以下组分乳糖20 30份、脱脂乳粉20 30份、抗坏血酸钠3 5份、聚乙二醇40000. 2 0. 6份、聚乙烯吡咯烷酮0. 2 0. 8份、牛血清白蛋白0. 5 2. 0份和蒸馏水100份。进一步的，以质量份数计，包括以下组分乳糖20 26份、脱脂乳粉24 30份、抗坏血酸钠4. 4 5份、聚乙二醇40000. 2 0. 4份、聚乙烯吡咯烷酮0. 3 0. 6份、牛血清白蛋白0. 5 I. 0份和蒸馏水100
份。 一种保加利亚乳杆菌冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤I)以质量份数计，在蒸馏水中添加20 30份的乳糖和20 30份的脱脂乳粉，力口热溶解后用调节pH为6. 9 7. 1，灭菌，冷却至室温；2)以质量份数计，将0. 2 0. 8份的聚乙烯吡咯烷酮溶解于蒸馏水中，灭菌，冷却
至室温;3)以质量份数计，将3 5份的抗坏血酸钠、0. 2 0. 6份的聚乙二醇4000、和0. 5 2. 0份的牛血清白蛋白溶解于无菌生理盐水中，然后用滤膜过滤除菌；4)将步骤1)、2)、3)所制备的溶液混合，并调整水的总质量份数为100份，得到保加利亚乳杆菌冻干保护剂。所述的保加利亚乳杆菌冻干保护剂的制备方法，包括以下步骤I)以质量份数计，在蒸馏水中添加20 26份的乳糖和24 30份的脱脂乳粉，力口热溶解后用调节pH为6. 9 7. 1，灭菌，冷却至室温；2)以质量份数计，将0. 3 0. 6份的聚乙烯吡咯烷酮溶解于蒸馏水中，灭菌，冷却
至室温;3)以质量份数计，将4. 4 5份的抗坏血酸钠、0. 2 0. 4份的聚乙二醇4000、和0. 5 I. 0份的牛血清白蛋白溶解于无菌生理盐水中，然后用滤膜过滤除菌；4)将步骤1)、2)、3)所制备的溶液混合，并调整水的总质量份数为100份，得到保加利亚乳杆菌冻干保护剂。所述的步骤I)、步骤2)的灭菌是在100 115°C灭菌10 15min。所述将保加利亚乳杆菌冻干保护剂与保加利亚乳杆菌泥等体积混合均匀，于_40°C预冻3 12h，然后-50 _56°C冷冻干燥18 24h，得到保加利亚乳杆菌菌粉。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果本发明提供的保加利亚乳杆菌冻干保护剂，在制备菌粉的过程中加入冻干保护齐U，可提高菌体的抗冷冻能力，从而提高菌粉的冻干存活率，且保藏期较长，存活率不易降低。本发明提供的保加利亚乳杆菌冻干保护剂，在制备菌粉的过程中加入冻干保护剂后，所制备的保加利亚乳杆菌菌粉中冻干存活率达到53. 5 58. 567%，菌粉活菌数为0. 916X1011 I. 066X 10ncfu/g。本发明提供的保加利亚乳杆菌冻干保护剂，其主要原料为乳糖和脱脂乳粉，原料易得、成本低。采用该复合保护剂制成的保加利亚乳杆菌冻干发酵剂，可以作为生产保加利亚乳杆菌发酵乳制品的直投式发酵剂使用。
具体实施例方式本发明提供一种保加利亚乳杆菌冻干保护剂及其制备方法，用于制备高活性菌粉，在制备菌粉的过程中加入冻干保护剂，可提高菌体的抗冷冻能力，从而提高菌粉的冻干存活率。下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。实施例I保加利亚乳杆菌冻干保护剂的组成为乳糖22g、脱脂乳粉26g、抗坏血酸钠4. 6g、聚乙二醇40000. 3g、聚乙烯吡咯烷酮PVP 0. 4g、牛血清白蛋白BSA 0. 7g、蒸馏水100ml。其制备方法
I)按量将乳糖和脱脂乳粉加热溶解后混合均匀，并用NaOH溶液调节pH 6. 9，然后经110°C灭菌15min，冷却至室温；2)按量称取聚乙烯吡咯烷酮PVP，溶解于蒸馏水中，再115°C灭菌30min，冷却至室温;3)按量分别称取抗坏血酸钠、聚乙二醇4000、牛血清白蛋白BSA溶解于0. 85-0. 9%无菌生理盐水中，用0. 22 y m滤膜过滤除菌；4)将步骤1)、2)两湿热灭菌的溶液按量混合，并在无菌条件下加入抗坏血酸钠、聚乙二醇4000、牛血清白蛋白BSA的过滤除菌水溶液，混匀即得保加利亚乳杆菌冻干保护剂。将保加利亚乳杆菌接种于MRS肉汤培养基中，活化三次，镜检无杂菌且形态无异常后，将其按4% (v/v)的接种量接入含MRS培养基中培养18h后，9000r/min离心15min，获得保加利亚乳杆菌菌泥，等体积加入保加利亚乳杆菌冻干保护剂，在低温冰箱中于_40°C预冻4h，然后放入冻干机进行冷冻干燥18h，即得保加利亚乳杆菌菌粉，冻干存活率为
53.500%，菌粉活菌数为 0. 916X10ncfu/g。实施例2保加利亚乳杆菌冻干保护剂的组成为乳糖23g、脱脂乳粉24g、抗坏血酸钠4. 7g、聚乙二醇40000. 3g、聚乙烯吡咯烷酮PVP 0. 3g、牛血清白蛋白BSA 0. 6g、蒸馏水100ml。其制备方法I)按量将乳糖和脱脂乳粉加热溶解后混合均匀，并用NaOH溶液调节pH 7. 0，然后经110°C灭菌15min，冷却至室温；2)按量称取聚乙烯吡咯烷酮PVP，溶解于蒸馏水中，再115°C灭菌30min，冷却至室温;3)按量分别称取抗坏血酸钠、聚乙二醇4000、牛血清白蛋白BSA溶解于0. 85-0. 9%无菌生理盐水中，用0. 22 y m滤膜过滤除菌；4)将步骤1)、2)两湿热灭菌的溶液按量混合，并在无菌条件下加入抗坏血酸钠、聚乙二醇4000、牛血清白蛋白BSA的过滤除菌水溶液，混匀即得保加利亚乳杆菌冻干保护剂。将保加利亚乳杆菌接种于MRS肉汤培养基中，活化三次，镜检无杂菌且形态无异常后，将其按4% (v/v)的接种量接入含MRS培养基中培养18h后，9000r/min离心15min，即得保加利亚乳杆菌菌泥，再等体积加入上述复合冻干保护剂，在低温冰箱中于_40°C预冻5h，然后放入冻干机进行冷冻干燥20h，即得保加利亚乳杆菌菌粉，冻干存活率达到
54.350%，菌粉活菌数为 0. 946X 10ncfu/g。实施例3保加利亚乳杆菌冻干保护剂的组成为乳糖26g、脱脂乳粉24g、抗坏血酸钠4. Sg、聚乙二醇40000. 2g、聚乙烯吡咯烷酮PVP 0. 5g、牛血清白蛋白BSA 0. 8g、蒸馏水100ml。其制备方法I)按量将乳糖和脱脂乳粉加热溶解后混合均匀，并用NaOH溶液调节pH 7. I，然后经110°C灭菌15min，冷却至室温；2)按量称取聚乙烯吡咯烷酮PVP，溶解于蒸馏水中，再115°C灭菌30min，冷却至室温;3)按量分别称取抗坏血酸钠、聚乙二醇4000、牛血清白蛋白BSA溶解于0. 85-0. 9%无菌生理盐水中，用0. 22 y m滤膜过滤除菌；4)将步骤1)、2)两湿热灭菌的溶液按量混合，并在无菌条件下加入抗坏血酸钠、聚 乙二醇4000、牛血清白蛋白BSA的过滤除菌水溶液，混匀即得保加利亚乳杆菌冻干保护剂。将保加利亚乳杆菌接种于MRS肉汤培养基中，活化三次，镜检无杂菌且形态无异常后，将其按4% (v/v)的接种量接入含MRS培养基中培养18h后，9000r/min离心15min，即得保加利亚乳杆菌菌泥，再等体积加入上述复合冻干保护剂，在低温冰箱中于_40°C预冻5h，然后放入冻干机进行冷冻干燥20h，即得保加利亚乳杆菌菌粉，冻干存活率达到
57.475%，菌粉活菌数为 0. 984X 10ncfu/g。实施例4保加利亚乳杆菌冻干保护剂的组成为乳糖24g、脱脂乳粉28g、抗坏血酸钠4. Sg、聚乙二醇40000. 4g、聚乙烯吡咯烷酮PVP 0. 5g、牛血清白蛋白BSA 0. 5g、蒸馏水100ml。其制备方法I)按量将乳糖和脱脂乳粉加热溶解后混合均匀，并用NaOH溶液调节pH 6. 9，然后经110°C灭菌15min，冷却至室温；2)按量称取聚乙烯吡咯烷酮PVP，溶解于蒸馏水中，再115°C灭菌30min，冷却至室温;3)按量分别称取抗坏血酸钠、聚乙二醇4000、牛血清白蛋白BSA溶解于0. 85-0. 9%无菌生理盐水中，用0. 22 y m滤膜过滤除菌；4)将步骤1)、2)两湿热灭菌的溶液按量混合，并在无菌条件下加入抗坏血酸钠、聚乙二醇4000、牛血清白蛋白BSA的过滤除菌水溶液，混匀即得保加利亚乳杆菌冻干保护剂。将保加利亚乳杆菌接种于MRS肉汤培养基中，活化三次，镜检无杂菌且形态无异常后，将其按4% (v/v)的接种量接入含MRS培养基中培养18h后，9000r/min离心15min，即得保加利亚乳杆菌菌泥，再等体积加入上述复合冻干保护剂，在低温冰箱中于_40°C预冻6h，然后放入冻干机进行冷冻干燥20h，即得保加利亚乳杆菌菌粉，冻干存活率达到
58.567%，菌粉活菌数为 I. 066X 10ncfu/g。
权利要求
1.一种保加利亚乳杆菌冻干保护剂，其特征在于，以质量份数计，包括以下组分 乳糖20 30份、脱脂乳粉20 30份、抗坏血酸钠3 5份、聚乙二醇40000. 2 0. 6份、聚乙烯吡咯烷酮0. 2 0. 8份、牛血清白蛋白0. 5 2. 0份和蒸馏水100份。
2.如权利要求I所述的保加利亚乳杆菌冻干保护剂，其特征在于，以质量份数计，包括以下组分 乳糖20 26份、脱脂乳粉24 30份、抗坏血酸钠4. 4 5份、聚乙二醇40000. 2 0.4份、聚乙烯吡咯烷酮0. 3 0. 6份、牛血清白蛋白0. 5 I. 0份和蒸馏水100份。
3.一种保加利亚乳杆菌冻干保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)以质量份数计，在蒸馏水中添加20 30份的乳糖和20 30份的脱脂乳粉，加热溶解后用调节pH为6. 9 7. I，灭菌，冷却至室温； 2)以质量份数计，将0.2 0. 8份的聚乙烯吡咯烷酮溶解于蒸馏水中，灭菌，冷却至室温； 3)以质量份数计，将3 5份的抗坏血酸钠、0.2 0. 6份的聚乙二醇4000、和0. 5 2.0份的牛血清白蛋白溶解于无菌生理盐水中，然后用滤膜过滤除菌； 4)将步骤1)、2)、3)所制备的溶液混合，并调整水的总质量份数为100份，得到保加利亚乳杆菌冻干保护剂。
4.如权利要求3所述的保加利亚乳杆菌冻干保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 1)以质量份数计，在蒸馏水中添加20 26份的乳糖和24 30份的脱脂乳粉，加热溶解后用调节pH为6. 9 7. 1，灭菌，冷却至室温； 2)以质量份数计，将0.3 0. 6份的聚乙烯吡咯烷酮溶解于蒸馏水中，灭菌，冷却至室温； 3)以质量份数计，将4.4 5份的抗坏血酸钠、0. 2 0. 4份的聚乙二醇4000、和0. 5 1.0份的牛血清白蛋白溶解于无菌生理盐水中，然后用滤膜过滤除菌； 4)将步骤1)、2)、3)所制备的溶液混合，并调整水的总质量份数为100份，得到保加利亚乳杆菌冻干保护剂。
5.如权利要求3所述的保加利亚乳杆菌冻干保护剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤I)、步骤2)的灭菌是在100 115°C灭菌10 15min。
6.如权利要求3所述的保加利亚乳杆菌冻干保护剂的制备方法，其特征在于，将保加利亚乳杆菌冻干保护剂与保加利亚乳杆菌泥等体积混合均匀，于-40°C预冻3 12h，然后-50 -56°C冷冻干燥18 24h，得到保加利亚乳杆菌菌粉。
全文摘要
本发明公开了一种保加利亚乳杆菌冻干保护剂及其制备方法，以质量份数计，包括以下组分乳糖20～30份、脱脂乳粉20～30份、抗坏血酸钠3～5份、聚乙二醇40000.2～0.6份、聚乙烯吡咯烷酮0.2～0.8份、牛血清白蛋白0.5～2.0份和蒸馏水100份。在制备菌粉的过程中加入冻干保护剂，可提高菌体的抗冷冻能力，从而提高菌粉的冻干存活率，且保藏期较长，存活率不易降低。
文档编号C12R1/225GK102952755SQ20121047065
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者陈合, 李串娜, 舒国伟, 王勇 申请人:陕西科技大学