专利名称：：从黄精中提取增强免疫功能作用的黄精低聚糖的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药领域，特别是一种从黄精中提取增强免疫功能作用的黄精低聚糖。二、
背景技术：
黄精的医用价值是众所周知，其功能在于补肾益精、滋阴润燥，主要用于阴虚肺燥，干咳少痰，肺肾阴虚的劳嗽久咳，脾胃虚弱，肾虚精亏等。黄精中含有皂苷、烟酸、糖类、醌类、氨基酸及微量元素等多种成分。随着科学技术的发展及对中药综合研究的深入，中医药有了新的开发前景，一些药物的新用途被发现，尤其是为了增加疗效、降低毒副作用，原生药中的成分被分别提取出来，用于制备治疗某种疾病的药物，产生了药物的新用法，为中医学发展提供了新的生机，如何研制开发新的有效药物成分，开拓新的应用领域己是人们所关心的问题。黄精的药用价值是被公认的，目前关于黄精有效成分的应用主要是其中的多糖、皂苷等成分，但从黄精中提取低聚糖部分并用于增强免疫功能的作用未见相关的报道。三、
发明内容基于上述情况，针对黄精的药用价值，本发明的目的就在于提供一种从黄精中提取增强免疫功能作用的黄精低聚糖，其解决的技术方案是，取黄精炮制品，粉碎后加质量浓度为50—95%乙醇超声或回流提取两次，过滤，滤液减压浓縮至无醇味，蒸馏水定容至相当于lg/ml体积，水溶液上大孔吸附树脂，水洗，收集水洗液，浓縮至稠膏状，得棕褐色低聚糖浸膏，收率为9.0%13.6%，经HPLC检识，该浸膏主要含有果糖、葡萄糖、蔗糖、棉籽糖等小分子糖，该浸膏干燥后得粉末状黄精低聚糖，黄精低聚糖可有效用于制备增强免疫功能的药物和保健食品，开辟了黄精新的应用前景，造福于人类，具有巨大的社会和经济效益。四具体实施方式以下结合具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。本发明在具体实施时，取黄精炮制品，粉碎后加质量浓度为50—95%的乙醇，超声30min-60min或用质量浓度为50_95%的乙醇回流lh-2h两次，第一次加黄精炮制品体积重量的IO倍量的质量浓度为50—95%的乙醇、第二次加黄精炮制品体积重量的7倍量的质量浓度为50—95%的乙醇(体积重量是指固体用g、液体用ml计，如黄精炮制品100g，乙醇则用100ml，加黄精炮制品体积重量的7倍量的质量浓度为50—95%的乙醇，即100g黄精炮制品加700ml的质量浓度为50—95%的乙醇，以下同)，过滤，合并两次滤液(主要含低聚糖、氨基酸、黄酮等成分)，滤液减压浓縮至无醇味，蒸馏水定容至相当于lg/ml体积，得低聚糖、氨基酸、苷类等大极性成分的水溶液，水溶液上大孔吸附树脂以除去苷类等成分，用大孔吸附树脂3倍体积的水洗，收集水洗液，浓縮，得棕褐色黄精低聚糖浸膏，经HPLC检识，该浸膏中主要含有果糖、葡萄糖、蔗糖、棉籽糖等多种小分子糖，该浸膏干燥后得粉末状黄精低聚糖。所说的黄精炮制品是，取黄精，用水洗净，晾干，取净黄精，将黄精用黄酒浸泡，每100g黄精加黄酒30g，闷润12-18小时，至黄酒完全浸入黄精体内，炖透或蒸透，稍晾，切片，干燥即得黄精炮制品。所说的大孔吸附树脂为市售Dun型大孔吸附树脂，用乙醇加热回流洗脱，洗至洗脱液蒸干后无残留物，再湿法装柱，然后用蒸馏水一1.5mol/L盐酸一2mol/L氢氧化钠一1.5mol/L盐酸一蒸馏水洗脱，即得所需的大孔吸附树脂(常规处理方法，是公知技术)。黄精低聚糖具有增强免疫的作用，已经为动物实验充分证明，具体实验情况如下一.试验材料1.试验动物1822g昆明种小鼠，雌雄各半。由郑州大学医学院动物实验中心提供。2.实验药物黄精低聚糖，黄酒(濮阳亚光制药厂，酒精度》12%)，瑞士染液，香菇多糖(湖北迪晨药业有限公司)，环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司)，枸橼酸钠，硫酸铜，次甲基蓝，氢氧化钠，酒石酸钾钠，亚铁氰化钾，盐酸等。二.试验方法l.黄精低聚糖对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响取小鼠50只，体重1822g，雌雄各半，随机均匀分为5组。分别灌服大、中、小剂量的黄精低聚糖水溶液(45mg/ml，30mg/ml，15mg/ml，0.2ml/10g)、香菇多糖混悬液(0.lg/ml，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药12天。于12天早上各组小鼠均腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml，于第12天灌胃给药后2h，给鸡红细胞后4h，脱颈椎处死小鼠。腹腔注入汉氏液2.5ml，轻揉小鼠腹部，然后剪开小鼠腹部皮肤，在腹膜上剪一小孔，用吸管吸取腹腔液2ml置于试管中，混匀，吸取少许腹腔液滴于载玻片上，液点大小约为1.5cmX2cm。将载玻片放在辅有湿纱布的糖瓷盘中，37°C孵育30min，生理盐水冲去附着的细胞，瑞氏染液染色，自来水冲洗晾干，显微镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况，并计算吞噬百分率和吞噬指数。吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数吞噬百分率％=吞噬指数=ioo个巨噬细胞(吞及未吞的)被吞噬的鸡红细胞总数x100%2IOO个巨噬细胞表l腹腔巨噬细胞吞噬功能结果(；±S)组别动物数(只)剂量(g/kg)吞噬百分率(%)吞噬指数空白对照组1061.4±9.50.69±0.08香菇多糖片组100.178.2±6.0"0.98士0.10"大剂量低聚糖组100.987.9±6.2**2.37±0.11**中剂量低聚糖组100.683.7士4.9"1.19±0.14**小剂量低聚糖组100.378.4±5.4**1.06±0.07****表示与空白组比P<0.01从表l可以看出，与空白对照组比，大、中、小剂量低聚糖组能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬百分率(P〈0.01)，可显著提高腹腔巨噬细胞的吞噬指数(P〈0.01)。以大剂量黄精低聚糖组作用为强。2.黄精低聚糖对正常小鼠溶血素形成的影响取小鼠50只，体重1822g，雌雄各半，随机均匀分为5组。分别灌服大、中、小剂量的黄精低聚糖水溶液(45mg/ml，30mg/ml，15mg/ml，0.2ml/10g)、香菇多糖混悬液(0.lg/ml，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药12天。于给药第5天各组小鼠均腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫，于最后l次给药后2h，小鼠眼眶取血，离心，分离血清。用生理盐水1:100稀释后，取lml稀释液与5%鸡红细胞混悬液0.5ml、109&补体0.5ml(豚鼠血清，用鸡红细胞预先饱和6h)混匀，37°C孵育30min，冰水中终止反应。另设不加补体的空白管作对照，吸取各管上清液于UV-2000型分光光度计540mn处比色，测定各组溶血素形成情况。3.黄精低聚糖对正常小鼠溶血空斑形成的影响取小鼠50只，体重1822g，雌雄各半，随机均匀分为5组。分别灌服大、中、小剂量的黄精低聚糖水溶液(45mg/ml，30mg/ml，15mg/ml，0.2ml/10g)、香菇多糖混悬液(0.lg/ml，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药12天。于给药第5天各组小鼠均腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫，于最后1次给药后2h，脱颈椎处死小鼠，解剖小鼠，取出脾脏，将两个小鼠脾脏放在一起，用匀浆器匀浆，并调整脾细胞混悬液中脾细胞数为5X106个/ml。取脾细胞混悬液1.Oml，与0.2%鸡红细胞混悬液0.5ml和1:10的豚鼠血清0.5ml混匀。另设不加补体的空白管，37°C孵育lh，离心，取上清液于UV-2000型分光光度计413nm处比色，测各组溶血空斑形成情况。表2溶血素、溶血空斑形成结果(〗土s)组别动物数剂量溶血素形成例数溶血空斑形成(只)(g/kg)(OD)(OD)空白对照组100.051±0.01250.198±0扁香菇多糖片组100.10.053±0細50.235±0.011**大剂量低聚糖组100.90.102±0.008**50.270±0.010"中剂量低聚糖组100.60.073±0.007**50.235±0扁**小剂量低聚糖组100.30.053±0.00850.215±0.006**林表示与空白组比P〈0.01从表2可以看出，与空白对照组比，大、中剂量组溶血素和溶血空斑OD值均显著升高(P〈O.OU，小剂量组和香菇多糖组溶血空斑OD值显著升高(P〈0.01)。说明大、中剂量组均可显著促进小鼠溶血素和溶血空斑的形成，以大剂量黄精低聚糖组作用为最优。4.黄精低聚糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响取小鼠40只，体重1822g，雌雄各半，随机均匀分为4组。分别灌服大剂量的黄精低聚糖水溶液(45mg/ml，0.2ml/10g)、香菇多糖混悬液(0.lg/ml，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药15天。于给药第ll天大剂量组、阳性对照组、模型组腹腔注射环磷酰胺40mg/kg/d，连续给药5天。于15天早上各组小鼠均腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水混悬液0.5ml，于第15天灌胃给药后2h，给鸡红细胞后4h，脱颈椎处死小鼠。腹腔注入汉氏液2.5ml，轻揉小鼠腹部，然后剪开小鼠腹部皮肤，在腹膜上剪一小孔，用吸管吸取腹腔液2ml置于试管中，混匀，吸取少许腹腔液滴于载玻片上，液点大小约为1.5cmX2cm。将载玻片放在辅有湿纱布的糖瓷盘中，37"C孵育30min，生理盐水冲去附着的细胞，瑞氏染液染色，自来水冲洗晾干，显微镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬情况，并计算吞噬百分率和吞噬指数。表3腹腔巨噬细胞吞噬功能结果(；士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>**表示与模型组比P〈0.01从表3可以看出，与空白组相比，模型组小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率显著降低(P〈0.01)，说明造模成功。与模型组相比，大剂量低聚糖组和香菇多糖片组可显著提高小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬指数和吞噬百分率(P〈0.01)。5.黄精低聚糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠溶血素形成的影响取小鼠40只，体重1822g，雌雄各半，随机均匀分为4组。分别灌服大剂量的黄精低聚糖水溶液(45mg/ml，0.2ml/10g)、香菇多糖混悬液(0.lg/ml，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药15天。于给药第ll天大剂量组、阳性对照组、模型组腹腔注射环磷酰胺40mg/kg/d，连续给药5天。于给药第5天各组小鼠均腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫，于最后l次给药后2h，小鼠眼眶取血，离心，分离血清。用生理盐水1:IOO稀释后，取lml稀释液与5免鸡红细胞混悬液0.5ml、1(m补体0.5ml(豚鼠血清，用鸡红细胞预先饱和6h)混匀，37。C孵育30min，冰水中终止反应。另设不加补体的空白管作对照，吸取各管上清液于UV-2000型分光光度计540nm处比色，测定各组溶血素形成情况。6.黄精低聚糖对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠溶血空斑形成的影响取小鼠40只，体重1822g，雌雄各半，随机均匀分为4组。分别灌服大剂量的黄精低聚糖水溶液(45g/m1，0.2ml/10g)、香菇多糖混悬液(0.lg/ml，0.2ml/10g)及同体积的生理盐水(0.2ml/10g)。每天给药1次，连续给药15天。于给药第11天大剂量组、阳性对照组、模型组腹腔注射环磷酰胺40mg/kg/d，连续给药5天。于给药第5天各组小鼠均腹腔注射5%鸡红细胞生理盐水混悬液0.2ml/只，进行免疫，于最后1次给药后2h，脱颈椎处死小鼠，解剖小鼠，取出脾脏，将两个小鼠脾脏放在一起，用匀浆器匀浆，并调整脾细胞混悬液中脾细胞数为5X106个/ml。取脾细胞混悬液1.0ml，与0.2%鸡红细胞混悬液0.5ml和1:10的豚鼠血清0.5ml混匀。另设不加补体的空白管，37X:孵育lh，离心，取上清液于UV-2000型分光光度计413nm处比色，测各组溶血空斑形成情况。表4溶血素、溶血空斑形成缚果(；±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>从上表可看出，与空白对照组比，模型组溶血素和溶血空斑OD值均显著降低(P〈0.05)，说明造免疫抑制模型成功。与模型组比，大剂量低聚糖组可显著促进小鼠溶血素和溶血空斑的形成，香菇多糖组可显著促进小鼠溶血空斑的形成，其OD值显著升高(P〈0.01)。本发明黄精低聚糖物质经动物实验，具有很好的增强免疫的作用，可用于多种原因导致的免疫力低下，如营养不全、生活无序、过度疲劳、肿瘤病人放化疗等。完全具备免疫增强药和保健食品的实际推广价值，开拓了黄精应用的新前景，是对中药学的创造性贡献，具有巨大的社会和经济效益。权利要求1、一种从黄精中提取的黄精低聚糖，其特征在于，由黄精炮制品粉碎后，加质量浓度为50-95％的乙醇，超声30min-60min或用质量浓度为50-95％的乙醇回流1h-2h两次，第一次加黄精炮制品体积重量的10倍量的乙醇、第二次加黄精炮制品体积重量的7倍量的乙醇，过滤，合并两次滤液，滤液减压浓缩至无醇味，蒸馏水定容至相当于1g/ml体积，得低聚糖、氨基酸、苷类极性成分的水溶液，水溶液上大孔吸附树脂以除去苷类成分，用大孔吸附树脂3倍体积的水洗，收集水洗液，浓缩，得棕褐色黄精低聚糖浸膏，经HPLC检识，该浸膏中主要含有果糖、葡萄糖、蔗糖、棉籽糖小分子糖，该浸膏干燥后得粉末状黄精低聚糖。2、根据权利要求1所述的从黄精中提取的黄精低聚糖，其特征在于，所说的黄精炮制品是，取黄精，用水洗净，晾干，取净黄精，将黄精用黄酒浸泡，每100g黄精加黄酒30g，闷润12-18小时，至黄酒完全浸入黄精体内，炖透或蒸透，稍晾，切片，干燥即得黄精炮制品。3、权利要求1所述的黄精低聚糖在于制备增强免疫功能药物和保健食品的应用。全文摘要本发明涉及一种从黄精中提取增强免疫功能作用的黄精低聚糖，其解决的技术方案是，取黄精炮制品，粉碎后加质量浓度为50-95％乙醇超声或回流提取两次，过滤，滤液减压浓缩至无醇味，蒸馏水定容至相当于1g/ml体积，水溶液上大孔吸附树脂，水洗，收集水洗液，浓缩至稠膏状，得棕褐色低聚糖浸膏，收率为9.0％～13.6％，经HPLC检识，该浸膏主要含有果糖、葡萄糖、蔗糖、棉籽糖等小分子糖，该浸膏干燥后得粉末状黄精低聚糖，黄精低聚糖可有效用于制备增强免疫功能的药物和保健食品，开辟了黄精新的应用前景，造福于人类，具有巨大的社会和经济效益。文档编号A61P37/04GK101293070SQ20081005014公开日2008年10月29日申请日期2008年6月25日优先权日2008年6月25日发明者冯云霞,冯卫生,云杨,爽王,肖功胜申请人:河南中医学院