专利名称：罗伊氏乳杆菌及其复合活菌制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及属于微生态制剂技术领域，具体地说是涉及一种罗伊氏乳杆菌及其复 合活菌制剂。
背景技术：
复合活菌制剂做为微生态制剂的一种，已被广泛应用于畜牧业养殖。其主要由两 种或两种以上的不同益生菌菌属组成。目前，通常应用的菌种主要是乳酸杆菌、双歧杆菌、 粪链球菌、芽孢杆菌及酵母菌等。将具有不同生物功能的益生菌组合，研制的复合活菌制剂 通过生物拮抗作用、生物夺氧用及及增强免疫等作用以维持胃肠道内环境平衡，且益生菌 可在动物机体内生长代谢，产生的各种消化酶能明显加强机体对饲料中各种营养成分的消 化吸收，提高饲料的利用。目前，应用于猪的复合活菌制剂生产菌株中，大部分为非猪源益生菌，由于动物肠 道菌群的生成是长期进化的结果，一种适于某类动物的微生态制剂不一定适于另一类动 物，从而导致应用效果受到较大影响。罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)是健康仔猪胃肠道的常在菌，国外研究 报道表明，罗伊氏乳杆菌对胃酸及胆汁具有较强的耐受能力，能够保持活力直达胃肠道，并 且还能分泌特殊的抗菌物质Reuterin，有效抑制轮状病毒及其他肠道病原微生物的生长， 从而来预防和治疗腹泻。该菌已被国内外学者广泛地应用于饲用微生态制剂，具有很好的 市场前景。双歧杆菌是人和动物肠道内最主要的生理性细菌之一，与其它生理性细菌成员构 成了微生物群落，并与宿主构成一个微生态系统。双歧杆菌进入肠道后迅速在肠粘膜定植， 并与肠粘膜上皮细胞结合形成微生物膜，阻止致病菌的定植与入侵；同时，产生大量的乳酸 与乙酸，改善肠内环境，维持正常的肠蠕动，促使致病菌排出体外；直接抑制或拮抗痢疾杆 菌、伤寒杆菌、绿脓杆菌、致病性大肠杆菌、葡萄球菌等致病菌的生长。双歧杆菌可清除致 病菌所释放的有毒有害代谢产物，减少内毒素来源，抑制致病菌群生长，降低血中内毒素水 平，调整微生态平衡，防治内毒素血症。双歧杆菌也能合成多种维生素(如维生素Bi、B2、 B6、B12、烟酸、叶酸等)和生物酶；使肠道酸化，有利于铁、钙及维生素D的吸收，防止缺铁性 贫血及维生素D缺乏症的发生；能补充多种氨基酸和微量元素。能激活机体吞噬细胞的吞 噬能力，增强机体的抗病免疫功能。由于双歧杆菌具有维持微生态平衡、生物拮抗、免疫调 节、营养等多方面的益生性能，目前已被广泛应用于微生物饲料添加剂、医疗、保健、食品等 领域，在国内外受到了研究者和消费者的青睐。另外，经国内外学者研究发现，芽孢杆菌属中的纳豆芽孢杆菌，由于其可产生芽 孢，因而有耐酸、耐碱、耐高温及耐挤压等特点，在制粒过程及胃酸环境中均能保持高度的 稳定性，是各种益生菌当中，对环境耐受力较好且可以直达小肠的菌种之一。此外，纳豆芽 孢杆菌还能够生成多种蛋白酶、糖化酶、脂肪酶、淀粉酶，降解植物性饲料中某些复杂的碳 水化合物，从而提高饲料的转化率，调节肠道菌群，增强动物的细胞免疫效应。
发明内容
本发明的目的是提供一种罗伊氏乳杆菌以及由其制备的复合活菌制剂。本发明另一个目的是提供所述罗伊氏乳杆菌及其复合菌剂的应用。本发明的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)L-HD5分离自猪肠道，该菌株已 于2010年7月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 4050。本发明还提供含有罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)L-HD5的菌剂。所述菌剂还包括双歧杆菌和纳豆芽孢杆菌。优选地，所述菌剂按重量份计含有罗伊氏乳杆菌L-HD5 1-10份双歧杆菌1-10份纳豆芽孢杆菌1-10份。更优选地，所述菌剂按重量份计含有罗伊氏乳杆菌L-HD5 1份双歧杆菌1份纳豆芽孢杆菌1份。本发明还提供含有罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)L-HD5或上述菌剂的 饲料添加剂。本发明进一步提供制备上述菌剂的方法，包括下述步骤将罗伊氏乳杆菌L-HD5、 双歧杆菌和纳豆芽孢杆菌分别进行下述操作进行液体深层发酵培养，离心处理后收集菌 泥，再通过真空冷冻干燥技术制备并收集菌粉，最后将三种菌粉复配。其中，所述罗伊氏乳杆菌L-HD5和双歧杆菌的发酵培养条件为温度37°C， pH6. 0 6. 5，静止培养，装液量60%，接种量3%，培养时间16 24h，活菌数大于IO8CFU/
mLo所述纳豆芽孢杆菌的发酵培养条件为温度37°C，pH6. 0，搅拌转速ISOrpm，装液 量20 %，接种量3 %，培养时间24 36h，活菌数大于108CFU/mL，芽孢形成率达到50 %以上。本发明还提供罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)L-HD5或上述菌剂在饲料 添加剂中的应用。本发明的复合活菌制剂作为饲料添加剂，经饲养后可显著提高断奶仔猪头均日增 重及饲料效率，降低仔猪腹泻率，提高经济效益。具有推广应用前景，并且为寻求抗生素替 代品提供了 一定的理论与实践基础。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1 罗伊氏乳杆菌活菌制剂的制备菌种活化将罗伊氏乳杆菌冻干菌种(Lactobacillus reuteri L-HD5)划线接种于MRS固体 培养基(北京陆桥技术有限责任公司生产，批号为CM188)表面，37°C厌氧培养16 24h，直至固体培养基表面长出菌落，镜检观察菌体形态及纯度。种子液的制备挑取MRS固体培养基表面菌落，接种于装有5mL种子培养基的试管中，37°C厌氧培 养16 24h，待活菌数达108CFU/mL，按2% (约1 X 106CFU/mL)接种量接种于装有150mL种 子培养基的250mL锥形瓶中，37°C厌氧培养16 24h，待活菌数达108CFU/mL，作为种子液种子培养基组成如下蛋白胨10g，牛肉膏15g，酵母粉5g，葡萄糖15g，柠檬酸二 铵 2g，乙酸钠 5g，吐温 801mL, K2HP042g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，MnSO4 · 4H20 0. 2g，蒸馏水加至 1000mL。液体深层发酵培养选用5L立式发酵罐进行液体发酵培养。其中，罗伊氏乳杆菌种子液的接种量 为3%，装液量为60%，37°C厌氧培养20h后，测定每毫升菌液中的活菌数，待活菌数达 109CFU/mL,放罐结束发酵培养。发酵培养基组成如下大豆蛋白胨50g，葡萄糖10g，酵母粉17g，低聚糖3g，蒸馏水 加至 lOOOmL，pH 6. 0 6. 5。冻干菌粉制备通过发酵液的离心、浓缩、加入冻干保护剂、真空冷冻干燥及菌粉活菌数检验等生 产程序，最终制备出粉状活菌制剂。其中，冻干保护剂的组成如下蔗糖15g，甘油3g，山梨醇15g，脱脂奶粉15g，蒸馏 水加至250mL;菌泥(离心浓缩后的菌体)与冻干保护剂的添加比例为1 125(g/mL)，冻 干保护率达到70%以上。成品检测取制备完的粉状活菌制剂lg，按国标GB/T 4789. 35-2003方法测定每克菌粉中的 活菌数，且菌粉中的活菌数大于109CFU/g。实施例2 双歧杆菌活菌制剂的制备菌种活化将双歧杆菌冻干菌种(婴儿双歧杆菌，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，编号CGMCC No. 1. 2202)划线接种于MRS固体培养基表面，37°C厌氧培养16 24h，直至固体培养基表面长出菌落，镜检观察菌体形态及纯度。种子液的制备挑取MRS固体培养基表面菌落，接种于装有5mL种子培养基的试管中，37°C厌氧培 养16 24h，待活菌数达108CFU/mL，按2% (约1 X 106CFU/mL)接种量接种于装有150mL种 子培养基的250mL锥形瓶中，37°C厌氧培养16h 24h，待活菌数达108CFU/mL，作为种子液种子培养基组成如下蛋白胨10g，牛肉膏15g，酵母粉5g，葡萄糖15g，柠檬酸二 铵 2g，乙酸钠 5g，吐温 801mL, K2HP042g，MgSO4 · 7H20 0. 5g，MnSO4 · 4H20 0. 2g，蒸馏水加至 1000mL。液体深层发酵培养将双歧杆菌种子液按3%的接种量，装液量60%，接种于5L发酵罐中，pH6. 5，37°C
5厌氧培养24h后，测定每毫升菌液中的活菌数，待活菌数达109CFU/mL，放罐结束发酵培养。发酵培养基组成如下大豆蛋白胨50g，葡萄糖10g，酵母粉17g，低聚糖3g，蒸馏水 力口至 IOOOmL, ρΗ6· 5。冻干菌粉制备通过发酵液的离心、浓缩、加入冻干保护剂、真空冷冻干燥及菌粉活菌数检验等生 产程序，最终制备出粉状活菌制剂。成品检测取制备完的粉状活菌制剂lg，按国标GB/T 4789. 35-2003方法测定每克菌粉中的 活菌数，测得菌粉中的活菌数大于109CFU/g。实施例3 纳豆芽孢杆菌活菌制剂的制备菌种活化将纳豆芽孢杆菌冻干菌种(购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，编号CGMCC No. 1. 1086)划线接种于营养琼脂培养基(北京奥博星生物技术有限责任 公司生产，批号为20060808)表面，37°C好氧培养12 24h，直至培养基表面长出菌落，镜 检观察菌体形态及纯度。种子液的制备挑取营养琼脂培养基表面菌落，接种于装有5mL营养肉汤培养基 (北京陆桥技术有限责任公司生产，批号为CM106)的试管中，37°C培养12 24h，待活菌 数达108CFU/mL，按2% (约lX106CFU/mL)接种量接种于装有150mL营养肉汤液体培养基 的250mL锥形瓶中，37°C培养12 24h，待活菌数达108CFU/mL以上，作为种子液备用。液体深层发酵培养将纳豆芽孢杆菌种子液按3%的接种量接种于装有发酵培养基的5L发酵罐中， PH6. 0，搅拌转速180rpm，装液量20%，37°C好氧培养24 36h后，测定每毫升菌液中的活 菌数，待活菌数达108CFU/mL以上，芽孢形成率达到80 %以上，放罐结束发酵培养(消泡剂 为植物油，添加量1%，单位:g/ml)。发酵培养基组成如下蛋白胨10g，牛肉粉3.0g，NaCl 5.0g，葡萄糖l.Og，蒸馏水 加至 1L, ρΗ6· 0。冻干菌粉制备通过发酵液的离心、浓缩、加入冻干保护剂、真空冷冻干燥及菌粉活菌数检验等生 产程序，最终制备出粉状活菌制剂。成品检测取制备完的粉状活菌制剂lg，按国标NY-T 1461-2007方法测定每克菌粉中的活 菌数，测得菌粉中的活菌数大于109CFU/g。实施例4 复合活菌制剂的制备将三种已制备完成的粉状活菌制剂按质量比1 1 1的比例复配，可得到复合 活菌制剂45g，经检测复配后得到的活菌制剂成品活菌总数大于101(lCFU/g。效果本发明的复合菌剂采用冷冻干燥保护技术制备，大幅度保证产品高活菌数 的保存期，一年内产品总活菌数不低于107CFU/g。实验例1 罗伊氏乳杆菌L-HD5冻干粉制剂的应用实验随机选择35日龄健康断奶仔猪36头，母系父系均为长白猪；将36头仔猪随机分为两组，试验组一为罗伊氏乳杆菌L-HD5冻干粉制剂组，饲喂仔猪日粮(不含抗生素)+罗 伊氏乳杆菌L-HD5冻干粉制剂组(添加量为基础日粮的)；试验组二为对照组，饲喂基 础日粮，试验时间为30d，仔猪的免疫按猪场常规免疫程序进行。最终实验数据如下试验组一每头仔猪平均日增重为0. 415Kg，对照组为0. 360Kg,试验组较对照组提
高日增重7. 1%。试验组一每头仔猪平均日耗料量为0. 668Kg，对照组为0. 700Kg，试验组较对照组 降低日耗料量2.3%。试验组一腹泻率为12.5%，对照组为32.2%，试验组较对照组降低腹泻率 19. 7%。动物饲喂实验表明，对断奶仔猪饲喂猪源罗伊氏乳杆菌L-HD5冻干粉制剂可提高 断奶仔猪日增重，降低日耗料量和腹泻发病率。实验例2随机选择35日龄健康断奶仔猪54头，母系父系均为长白猪；将54头仔猪随机分 为三组，试验组一为罗伊氏乳杆菌L-HD5冻干粉制剂组，饲喂仔猪日粮(不含抗生素)+罗 伊氏乳杆菌L-HD5冻干粉制剂组(添加量为基础日粮的)；试验组二为复合活菌制剂 组，饲喂仔猪日粮(不含抗生素)+实施例4所制得的复合活菌制剂(添加量为基础日粮的 1% )；试验组三为对照组，饲喂基础日粮，试验时间为30d，仔猪的免疫按猪场常规免疫程 序进行。最终试验数据如下试验组一每头仔猪平均日增重为0. 415Kg，试验组二每头仔猪平均日增重为 0. 563Kg，对照组为0. 360Kg，试验组一较对照组提高日增重7. 1 %，试验组二较对照组提高 日增重22%。试验组一每头仔猪平均日耗料量为0. 668Kg，试验组二每头仔猪平均日耗料量为 0. 690Kg,对照组为0. 700Kg,试验组一较对照组降低日耗料量2. 3%，试验组二较对照组降 低日耗料量0.7%。试验组一腹泻率为12.5%，试验组二腹泻率为9.6%，对照组为32.2%，试验组较 对照组降低腹泻率19. 7%，试验组二较对照组降低腹泻率22. 6%。应用实验表明，对断奶仔猪饲喂复合活菌制剂可显著提高断奶仔猪日增重，降低 日耗料量和腹泻发病率。复合活菌制剂较单一罗伊氏乳杆菌制剂益生效用显著。这可能是由于复合活菌制 剂中的三种益生菌具有协同增效作用。首先，纳豆芽孢杆菌属于好氧菌，进入肠道后在生长繁殖过程中消耗环境内的氧 气，可以抑制好氧致病菌的生长，但有助于罗伊氏乳杆菌和双歧杆菌等厌氧菌的繁殖；其 次，罗伊氏乳杆菌和双歧杆菌的生长又增加了肠道内的酸度，更加强了对致病菌生长的抑 制。所以复合活菌制剂较单一菌制剂表现出了更显著的益生效用。
权利要求
罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)L HD5，其保藏编号为CGMCC No.4050。
2.含有权利要求1所述菌株的菌剂。
3.如权利要求2所述的菌剂，其还包括双歧杆菌、纳豆芽孢杆菌和冻干保护剂，其中所 述冻干保护剂的组分为蔗糖10g-15g，甘油3g-5g，山梨醇10g-15g，脱脂奶粉10g_15g，蒸 馏水加至250mL ；每克由罗伊氏乳杆菌L-HD5、双歧杆菌和纳豆芽孢杆菌组成的菌泥中添加 125ml冻干保护剂。
4.如权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂按重量份计含有罗伊氏乳杆菌L-HD5 1-10份双歧杆菌1-10份纳豆芽孢杆菌1-10份。
5.如权利要求4所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂按重量份计含有罗伊氏乳杆菌L-HD5 1份双歧杆菌1份纳豆芽孢杆菌1份。
6.含有权利要求1所述菌株或权利要求2 5任一项所述菌剂的饲料添加剂。
7.制备权利要求4 6任一项所述菌剂的方法，包括下述步骤将罗伊氏乳杆菌 L-HD5、双歧杆菌和纳豆芽孢杆菌分别进行下述操作进行液体深层发酵培养，离心处理后 收集菌泥，再通过真空冷冻干燥技术制备并收集菌粉，最后将三种菌粉复配。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述罗伊氏乳杆菌L-HD5和双歧杆菌的发 酵培养条件为温度37°C，pH6. 0 6. 5，静止培养，装液量60 %，接种量3 %，培养时间16 24h，活菌数大于108CFU/mL。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述纳豆芽孢杆菌的发酵培养条件为温 度37°C，pH6. 0，搅拌转速180rpm，装液量20%，接种量3%，培养时间24 36h，活菌数大 于108CFU/mL，芽孢形成率达到50%以上。
10.权利要求1所述菌株或权利要求2 5任一项所述菌剂在饲料添加剂中的应用。
全文摘要
本发明提供一种罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)L-HD5及其复合活菌制剂，其保藏编号为CGMCC No.4050。本发明的活菌制剂作为饲料添加剂，经饲养后可显著提高断奶仔猪头均日增重及饲料效率，降低仔猪腹泻率，提高经济效益。具有推广应用前景，并且为寻求抗生素替代品提供了一定的理论与实践基础。
文档编号C12R1/225GK101974463SQ20101051742
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月19日 优先权日2010年10月19日
发明者刘宇, 孙秀军, 崔玉东, 张军, 朱战波, 杨焕民, 贾永全 申请人:黑龙江八一农垦大学