专利名称:γ-氨基丁酸的高效制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种Y-氨基丁酸的高效制备工艺。包括以希氏乳杆菌 (Lactobacillus hilgardii)的细胞转化谷氨酸钠生产Y -氨基丁酸，属于生物技术领域：
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背景技术：
γ -氨基丁酸(简称GABA)是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经传达物质，约50%的中枢神经突触部位以GABA为递质。在人体大脑皮质、海马、丘脑、基底神经节和小脑中起重要作用，并对机体的多种功能具有调节作用。当人体内GABA缺乏时，会产生焦虑、不安、疲倦、忧虑等情绪，一般长久处于高压力族群如身处竞争环境中的人群、运动员、上班族等，都很容易缺乏GABA需要及时补充以便舒缓情绪。此外它还具有许多重要的生理功能，如降血压、利尿、促进脑部血流、营养神经细胞、 健肝利肾等，尤其对更年期的失眠、压抑和自身失调有很好的作用，可用于药物和功能食品的开发。
GABA自2009年被国家批准为新资源食品后，以其独特的功能性和广泛的适用范围，成为国内外食品、保健及医药生产厂商在开发新产品、增加产品附加值、强化产品功能性等方面，一个重要的研究课题和发展思路，拥有广阔的市场前景。
Y -氨基丁酸的制备主要有化学合成法和生物合成法。化学合成法多见于专利文献的报道，成本较高，得率较低，并且在生产工艺中使用危险溶剂，甚至是有毒溶剂。因此化学合成法制备的GABA不能用于食品，也不能认为是一种天然的食品添加剂。生物合成法 GABA是应用纯粹的微生物(公认安全菌一乳酸菌)技术，通过筛选优良高产的安全菌种，发酵生产GABA制剂，可以认为是天然食品添加剂。而且据报告显示，生物合成法GABA虽然纯度不高，但生物体对GABA的吸收性却比纯度高的化学合成法GABA高很多。
浙江大学梅乐和等在2005年9月观日公开的专利技术“产Y-氨基丁酸的短乳杆菌及其用途”(专利申请号200510049188. X ；公开号CN1673351 )，该发明公开了一种产 Y-氨基丁酸的短乳杆菌及其用途，其保藏编号为CGMCCN0. 1306，该发明采用生物法合成 Y-氨基丁酸是利用乳酸菌体内含有高活性的谷氨酸脱羧酶，此酶以L-谷氨酸钠(L-MSG) 为底物，将L-谷氨酸钠(L-MSG) α -脱羧，产生Y -氨基丁酸和C02。
南昌大学李海星和曹郁生分别于2008年和2010年公布了三项专利
1、2008年12月31日公开的专利技术“利用短乳杆菌制备Y-氨基丁酸的方法”(专利申请号200810106949. 4 ；公开号CNlO 1333M8)，该发明公布了一种利用短乳杆菌制备 Y-氨基丁酸的方法，其工艺方法步骤为1.利用MRS液体培养基将短乳杆菌活化后，以 5%的接种量接种于MRSG发酵培养基，34°C培养40-60h，4°C离心收集菌体；2.利用无菌生理盐水洗涤2次后悬于含IO-IOOmM谷氨酸钠、pH 5. 2的醋酸缓冲液中，34°C反应1 8h， 离心后即为含Y-氨基丁酸的溶液。
2、2008年12月31日公开的专利技术“一种高产Y _氨基丁酸的短乳杆菌”(专利申请号200810106950. 7 ；公开号CN101333508)，该发明公布了一种高产Y-氨基丁酸的短乳杆菌，其特征和工艺方法步骤为经鉴定为Lactobacillus brevis (短乳杆菌)，国家菌种保藏号Lactobacillus brevis CCTCCM 208054。将保藏于MRS琼脂斜面的短乳杆菌， 转接于MRS液体培养基，经活化后，以2-5%的接种量接种于MRSG液体培养基，于25_30°C 培养60-90h，发酵液中的Y -氨基丁酸达到50-145mM。
3、2010年8月25日公开的专利技术“一种高效生产Y _氨基丁酸的发酵方法” (专利申请号201010045843. 5 ；公开号CN101812487A)，该发明公布了一种高效生产γ-氨基丁酸的发酵方法，其特征是方法步骤为将短乳杆菌活化后，以10%的接种量接种于发酵培养基，32°C培养36-84h ；并于12h和24h分别补入1. 5mol和0. 7mol的L-谷氨酸钠； 整个发酵过程用ION的硫酸控制pH5. 0即可。
韩山师范学院杨胜远等在2009年10月14日公开的专利技术“乳酸乳球菌细胞转化法生产Y -氨基丁酸的方法”(专利申请号200910114016. 4 ；公开号CN101555501 )， 该发明公布了一种细胞转化法生产Y-氨基丁酸的方法，它是以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的细胞作用于外源添加的谷氨酸或谷氨酸钠，生产高含量的Y-氨基丁酸，或将乳酸乳球菌细胞采用海藻酸钠进行固定化，通过固定化细胞技术转化谷氨酸或谷氨酸钠生产 Y-氨基丁酸。该法的乳酸乳球菌细胞可在高浓度谷氨酸或谷氨酸钠底物中进行转化反应，
Y-氨基丁酸浓度高，无需高温高压反应条件和有毒有害原料，专一性高，副产物少，转化液的成分简单。
目前，国内外有一些机构和个人在开展利用微生物(主要是乳酸菌系列)合成生产
Y-氨基丁酸的技术研究，但实验研究的成品得率一直较低，使其产业化生产的成本相对高昂，，而我们本技术项目的研究获得了优选的配方和创新工艺，通过选择优良菌株，改善生产配方和生产工艺可使Y -氨基丁酸的产量显著提高，成本降低20-30%，具有十分重要的
眉、ο
发明内容
从2007年开始我们在研究Y-氨基丁酸的生物合成，取得了较好的进展。我们利用希氏乳杆菌(LactcAacillus hilgardii)经过优化改良的MRS培养基分级扩大培养后， 离心浓缩菌液，再与谷氨酸钠的悬浊液混合，加入0. 2-0. 5ff/V%的土温80，0. 15-0. 30mol/L 的缓冲液，调整PH为4. 0-5. 5，30-50°C下搅拌混合反应2_4天，再根据反应混合液中谷氨酸钠颗粒的转化程度，分批添加谷氨酸钠，控制PH值和反应温度，并动态添加消泡剂消除泡沫，继续反应2-4天，即停止反应，采用电渗析脱盐法进行纯化，离心分离菌体，即可获得 Y-氨基丁酸溶液，含量达到10-25%，再纯化即得Y-氨基丁酸产品，白色粉末状，纯度98% 以上，利用糊精制备20%含量的成品，可直接用于食品保健的原料。
培养基配方优化如下
优化后的MRS培养基组成为(g/L)玉米浆35. 30、马铃薯22. 40、乳糖10. 80、黄豆粉 14. 50、牛肉膏8g、硫酸锰0. 5、乙酸钠2g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸钠2g，硫酸镁0. 6，谷氨酸钠 60g。
具体工艺如下1、将希氏乳杆菌(LactcAaciIlushilgardii)经过优化MRS培养基培养，获得种子菌
液；
2、以玉米为主原料配制改良优化的MRS培养基发酵液，加入种子菌液扩大培养，离心获得浓缩菌液；
3、配制谷氨酸钠液，将浓缩菌液与之混合，形成悬浊液混合，加入0.2-0. 5ff/V%的土温 80，0. 15-0. 30mol/L的缓冲液，调整pH为4. 0-5. 5，30_50°C下搅拌混合反应2-4天；
4、根据反应混合液中谷氨酸钠颗粒的转化程度，分批添加谷氨酸钠，控制pH值和反应温度，并动态添加消泡剂消除泡沫，继续反应2-4天；
5、采用电渗析脱盐法进行纯化，并离心分离菌体，获得Y-氨基丁酸溶液，含量达到 10-25%
6、添加糊精进行喷雾干燥，获得Y-氨基丁酸含量约20%白色粉末状新资源食品原料添加剂。
工艺成果鉴定
以该工艺制备的Y-氨基丁酸溶液经过氨基酸自动分析仪采用2619#树脂(阳离子交换柱为2. 6 X 150mm)，53°C分析鉴定。
具体实施方式
实施例1:
希氏乳杆菌(LactcAacillus hilgardii)经过优化改良的MRS培养基分级扩大培养后，离心浓缩菌液，再与谷氨酸钠的悬浊液混合，加入0. 25ff/V%的土温80，0. 25mol/L的缓冲液，调整PH为4. 5，35°C下搅拌混合反应4天，再根据反应混合液中谷氨酸钠颗粒的转化程度，分批添加谷氨酸钠，控制PH值和反应温度，并动态添加消泡剂消除泡沫，继续反应3 天，即停止反应，采用电渗析脱盐法进行纯化，离心分离菌体，即可获得Y -氨基丁酸溶液， 含量达到17. 4%，再纯化即得Y-氨基丁酸产品，白色粉末状，纯度98. 11%。
培养基配方优化如下
优化后的MRS培养基组成为(g/L)玉米浆33. 00、马铃薯22. 00、乳糖17. 00、黄豆粉 15. 50、牛肉膏10g、硫酸锰0. 55、乙酸钠2g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸钠2g，硫酸镁0. 6，谷氨酸钠55g。
实施例2:
希氏乳杆菌(LactcAacillus hilgardii)经过优化改良的MRS培养基分级扩大培养后，离心浓缩菌液，再与谷氨酸钠的悬浊液混合，加入0. 4ff/V%的土温80，0. 20mol/L的缓冲液，调整pH为4. 0，37°C下搅拌混合反应3. 5天，再根据反应混合液中谷氨酸钠颗粒的转化程度，分批添加谷氨酸钠，控制PH值和反应温度，并动态添加消泡剂消除泡沫，继续反应3 天，即停止反应，采用电渗析脱盐法进行纯化，离心分离菌体，即可获得Y -氨基丁酸溶液， 含量达到到22. 5%，再纯化即得Y-氨基丁酸产品，白色粉末状，纯度99. 1%。
培养基配方优化如下
优化后的MRS培养基组成为(g/L)玉米浆38. 00、马铃薯18. 50、乳糖8. 80、黄豆粉12. 50、牛肉膏12g、硫酸锰0. 5、乙酸钠2g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸钠2g，硫酸镁0. 6，谷氨酸钠 60g。
实施例3:
希氏乳杆菌(LactcAacillus hilgardii)经过优化改良的MRS培养基分级扩大培养后，离心浓缩菌液，再与谷氨酸钠的悬浊液混合，加入0. 5ff/V%的土温80，0. 20mol/L的缓冲液，调整PH为5. 1，39°C下搅拌混合反应2. 5天，再根据反应混合液中谷氨酸钠颗粒的转化程度，分批添加谷氨酸钠，控制PH值和反应温度，并动态添加消泡剂消除泡沫，继续反应4 天，即停止反应，采用电渗析脱盐法进行纯化，离心分离菌体，即可获得Y -氨基丁酸溶液， 含量达到23. 7%，再纯化即得Y -氨基丁酸产品，白色粉末状，纯度98. 3%。
培养基配方优化如下
优化后的MRS培养基组成为(g/L)玉米浆35. 00、马铃薯20. 00、乳糖12. 80、黄豆粉 16. 50、牛肉膏9g、硫酸锰0. 5、乙酸钠2g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸钠2g，硫酸镁0. 6，谷氨酸钠 62g。
权利要求
1.Y-氨基丁酸的高效制备工艺，其特征在于以希氏乳杆菌(LactcAacillus hilgardii)的细胞转化谷氨酸钠生产Y-氨基丁酸。
2.根据权利要求
1所述的Y-氨基丁酸的高效制备工艺，其特征为希氏乳杆菌经过改良优化的MRS培养基分级扩大培养后，离心浓缩菌液，再与谷氨酸钠的悬浊液混合，加入 0. 2-0. 5ff/V% 的土温 80，0. 15-0. 30mol/L 的缓冲液，调整 pH 为 4. 0-5. 5，30-50°C下搅拌混合反应2-4天，再根据反应混合液中谷氨酸钠颗粒的转化程度，分批添加谷氨酸钠，控制pH 值和反应温度，并动态添加消泡剂消除泡沫，继续反应2-4天，即停止反应，采用电渗析脱盐法进行纯化，离心分离菌体，即可获得Y-氨基丁酸溶液，含量达到10-25%，再纯化即得 Y-氨基丁酸产品，白色粉末状，纯度98%以上，利用糊精制备20%含量的成品，可直接用于食品保健的原料。
3.培养基配方优化如下优化后的MRS培养基组成为(g/L):玉米浆35.30、马铃薯 22. 40、乳糖10. 80、黄豆粉14. 50、牛肉膏8g、硫酸锰0. 5、乙酸钠2g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸钠2g，硫酸镁0. 6，谷氨酸钠60g。
专利摘要
本发明公开了一种γ-氨基丁酸的高效制备工艺。利用希氏乳杆菌(Lactobacillushilgardii)经过改良优化的MRS培养基分级扩大培养后，离心浓缩菌液，再与谷氨酸钠的悬浊液混合，采用细胞转化法，即可获得γ-氨基丁酸溶液，含量达到10-25%，再纯化即得γ-氨基丁酸产品，白色粉末状，纯度98%以上，利用糊精制备20%含量的成品，可直接用于食品保健的原料。通过调整工艺条件，优化改良发酵培养基，使γ-氨基丁酸的制备成本降低20-30%，生产周期缩短30%。
文档编号C12R1/225GKCN102199636SQ201110092472
公开日2011年9月28日 申请日期2011年4月13日
发明者王健 申请人:王健导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan