专利名称:用于进行性肌营养不良症治疗中基因检测的核酸分离器的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体涉及进行性肌营养不良症(DMD)的治疗，更具体涉及进行性肌营养不良症干细胞治疗过程中的基因检测的核酸分离器。
背景技术：
进行性肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)又称进行性假肥大肌营养不良症，是男孩最常见的神经肌肉病。DMD是一种以骨骼肌进行性变性坏死为特征的X性染色体隐性遗传病，其主要病因是由位于Xp21的抗肌萎缩蛋白基因突变，使得其肌细胞膜上编码的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)缺乏所致，主要临床特征为收累骨骼肌肉的进行性无力和萎缩。患者通常在十多岁时发生重度残疾，在20-30岁的早期到中期发生致命的 心功能或呼吸功能衰竭。
目前临床使用的标准的治疗方法主要集中在维持患者的总体健康状态以及改善生活质量上。虽然有多个研究表明糖皮质激素(如强的松龙)可延缓肌肉强度的下降速度，但是其效应维持时间相对较短，一般为28-36个月，并且无法改变该疾病的临床进程，无法达到延长生命或明显改善该疾病临床进程的效果。公开号为CN101065487A的中国专利申请公开了一种利用新型转基因进行DMD的体内治疗的方法，具体包括一种游离的转基因、该转基因的载体以及将该转基因引入动物DNA以表达肌营养蛋白的方法。公开号为CN101939021A公开了一种用于治疗DMD的非免疫抑制性环孢素衍生物。公开号为CN101378739A的中国专利申请公开了一种释放一氧化氮的化合物用于延缓或逆转DMD。
干细胞是一种能分化为多种组织细胞的始祖细胞，有报道静脉注射正常造血干细胞可使mdx大鼠造血功能重建并部分恢复受累肌细胞Dys的表达。因而干细胞移植在近年来也成为DMD治疗研究的又一热点。大量的临床研究表明干细胞治疗是DMD最有效的具有突破性的治疗措施。DMD有家族隐形遗传基因缺失，其诊断、配型、植入与预后的判断整个疗程离不开基因检测。
在检测有无某一特定核酸或基因的存在时，可采用扩增靶核酸或基因，并检测其扩增产物的方法。作为将靶核酸或基因特异性扩增的方法，公知的PCR法、RT-PCR法、ICAN法、LAMP法、RCA法、引子延伸(primer extention)法等。其中最常用PCR法、RT-PCR法。这些方法是使用包含目标核酸的盐基序列的短的核酸作为引子，用体外(in vitro)进行DNA聚合酶或RNA聚合酶的铸模特异性核酸合成反应的方法。
本发明人意识到，上述检测过程存在冗长繁琐的缺陷，难以满足临床快速诊疗的需求，为此寻求更高效的检测方法。近年来有研究将固相载体或磁性材料或两者结合用于核酸或基因的分离。如公开号为CN1580067A的中国专利申请公开的一种磁性纳米粒子核酸分离器，具有由核壳型磁性纳米粒子构成的内核层，包覆内核层的3-巯基丙基三甲氧基硅烷中间层，以及包覆中间层的单链DNA外壳层。该核酸分离器可简单有效地分离目标DNA或RNA。公开号为CN101665785A的中国专利申请公开了一种采用磁珠从样品中提取并纯化核酸的方法。公开号为CN 1558951A的中国专利申请则公开了一种核酸提取设备，包括摇动器、离心式分离器等。公开号为CN 101481400A的中国专利申请公开了一种从包含核酸的病毒或细胞的样品中分离纯化核酸的方法及专用磁性分离器。
本发明人意识到，将固相载体或磁性材料或两者结合用于DMD干细胞治疗中基因的检测，达到高效快捷简便稳定分离核糖核酸的目的，将有效提高DMD干细胞治疗中临床基因检测的效率。
发明内容
本发明的基本目的针对DMD的干细胞治疗要求，开发适用于临床使用的高通量DMD磁性纳米核酸分离器。
本发明磁性纳米核酸分离器基于以下方案纳米磁性粒子上包被的多聚腺嘌呤核
苷酸与mRNA的多聚胸腺嘧啶核苷酸尾相互杂交，然后利用磁性分离上述纳米粒子，达到高效快捷简便稳定分离核糖核酸的目的。
采用本发明磁性纳米核酸分离器，可直接采用外周血、骨髓样本中提取基因组DNA，利用快速反应体系和磁性纳米技术进行靶基因或靶核酸的检测。
本发明磁性纳米核酸分离器，其中所述的磁性纳米粒子可参考公开号为CN1580067A的中国专利申请，该专利申请全文引入本发明作为参考。本发明用于DMD干细胞治疗中基因检测的磁性纳米核酸分离器，在磁性纳米粒子的制备上进行了创新。磁性纳米核酸分离器的关键技术是纳米粒子和多聚核苷酸的交连得率的提高，当交连得率> 90%时，可达到工艺设计标准。
将本发明产品制成快速试剂盒，所有试剂和分离架等用品都以现成的配制完成的方式包装在试剂盒中，并且满足PCR和STR等下游应用，以达到方便用户使用的目的。
具体实施方式
本发明用于DMD干细胞治疗中基因检测的磁性纳米核酸分离器，在磁性纳米粒子的制备上进行了创新，包括
(I)合成的核壳型磁性纳米粒子，粒子高度分散，粒径为30_80nm，适用于微量分离，具有超顺磁性和较大的磁化强度，能够保证样品的高效分离。
进一步的，所述核壳型磁性纳米粒子的粒径优选为50nm左右。
(2)通过化学修饰的方法，在磁性纳米粒子的表面修饰上所需要的官能团，使纳米粒子与具有高度特异性识别功能的生物分子连接构成磁性纳米粒子-生物分子复合物，从而简化了分离核酸时的操作步骤。
(3)自主设计的电磁和永磁磁性分离架都能够产生强大的磁场以保证目标核酸分离出来，且不影响其生物活性。分离得到的样品可以用于后续实验。
(4)设计采用96孔板平台检测技术，满足临床快速诊疗和高通量要求。
磁性纳米核酸分离器属生物高新技术产品，附加值高，不污染环境。
权利要求
1.一种用于进行性肌营养不良症治疗中基因检测的核酸分离器，其特征在于，包含合成的核壳型磁性纳米粒子，粒子高度分散，粒径为30-80nm。
2.如权利要求
I所述的一种用于进行性肌营养不良症治疗中基因检测的核酸分离器，其特征在于，所述核壳型磁性纳米粒子的粒径为50nm。
3.如权利要求
I所述的一种用于进行性肌营养不良症治疗中基因检测的核酸分离器，其特征在于，通过化学修饰的方法，在磁性纳米粒子的表面修饰上所需要的官能团。
4.如权利要求
I所述的一种用于进行性肌营养不良症治疗中基因检测的核酸分离器，其特征在于，可直接采用外周血、骨髓样本中提取基因组DNA，利用快速反应体系和磁性纳米技术进行靶基因或靶核酸的检测。
专利摘要
本发明提供一种用于进行性肌营养不良症治疗中基因检测的核酸分离器，其包含合成的核壳型磁性纳米粒子，所述纳米粒子高度分散，粒径为30-80nm。本发明核酸分离器通过化学修饰的方法，在磁性纳米粒子的表面修饰上所需要的官能团。本发明核酸分离器可直接采用外周血、骨髓样本中提取基因组DNA，利用快速反应体系和磁性纳米技术进行靶基因或靶核酸的检测。本发明适用于临床进行性肌营养不良症干细胞治疗过程中的基因或核酸的高通量分离。
文档编号C12M1/00GKCN102732414SQ201110085661
公开日2012年10月17日 申请日期2011年4月6日
发明者严整辉 申请人:上海奇康生物科技有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan