用于治疗杜兴氏肌营养不良的化合物的制备的制作方法

专利名称：用于治疗杜兴氏肌营养不良的化合物的制备的制作方法
技术领域：
在此提供了用于治疗杜兴氏肌营养不良的化合物的制备方法。
背景技术：
杜兴氏肌营养不良(DMD)是一种常见的遗传性神经肌肉疾病，其与肌肉功能的渐 进性退化有关，该疾病在150年前由法国神经病学家Duchermede Boulogne首次描述，并以 他命名。DMD的特征为X连锁隐性障碍，其由抗肌萎缩蛋白基因中的突变引起，每3500男性 中便影响1人。该基因是人类基因组中最大的基因，具有260万个DNA碱基对并包含79个 外显子。大约60%的抗肌萎缩蛋白基因突变是导致下游移码错误的较大插入或删除，而大 约40%为点突变或较小的移码重排。绝大部分DMA患者缺乏抗肌萎缩蛋白。贝克型肌营养 不良由抗肌萎缩蛋白的数量减少或大小改变而引起的DMD中较为温和的形式。DMD较高的 发病率(每10000个精子或卵中1个)表明遗传筛选绝对无法消除该疾病，因此极度需要 有效的疗法。现有许多天然或工程改造的DMD动物模型，并为临床前研究提供了支持 (Allamand,V. & Campbell,K. P. Animal models for muscular dystrophy :valuable tools for the development of therapies. Hum. Mol. Genet. 9，2459—2467 (2000))。尽管小鼠、猫 和狗模型均具有DMD基因突变并显示了与人类中所见类似的生物化学肌营养不良，但它们 在表型上具有令人惊奇的较大变化。与人类似，犬(金毛猎犬肌营养不良症和德国短毛指 示犬)模型具有严重的表型；这些狗通常死于心力衰竭。狗提供了人类疾病的最佳表型模 拟，并被认为是临床前研究的高基准。不幸的是，饲养这类动物较为昂贵和困难，且仔畜之 间的临床时间进程可能不同。mdx小鼠由于其具有可得性、妊娠时间短、成熟晚以及成本相对较低而成为最广泛 使用的模型(Bulfield,G. , Siller, W. G. ,Wight, P. Α. & Moore, K. J. X chromosome-linked muscular dystrophy(mdx)in the mouse. Proc. NatlAcad. Sci. USA 81,1189-1192(1984))。由于20年前就发现了 DMD基因，在临床前动物研究中对DMD的治疗已经取得了不 同程度的成功，部分已经进入人体阶段。目前的治疗策略可大致分为三类第一，基因疗法； 第二，细胞疗法；最后，药物疗法。基于基因和细胞的疗法(特别是在疾病早期启动时)的 主要优点是能免除对对继发性缺陷/病理(例如，挛缩)单独纠正的需求。不幸的是，这些 方法面临着许多技术障碍。已报道了对病毒载体、成肌细胞和新合成的肌肉营养不良蛋白 的免疫应答，除了毒性外，还缺乏稳定表达，且传递困难。治疗肌营养不良的药物方法与基于基因和细胞的方法的不同之处在于并非被设
3计来传递缺失的基因和/或蛋白。一般而言，药物策略使用药物/分子以通过例如减少炎 症、增加钙体内平衡和增加肌肉祖细胞(progenitor)增殖和定向等手段来尝试改善表型。 该种策略的优点在于它们易于全身传递，并能防止与载体和基于细胞的疗法相关的免疫和 /或毒性问题。尽管用皮质类固醇和色甘酸钠减少炎症、用硝苯呋海因维持钙稳态以及用 氨哮素提高肌肉强度的考察均产生了较理想的结果，但这些潜在疗法均未显示能有效治疗 一种替代性的药物疗法是上调疗法。上调疗法的基础是提高替代基因的表达 以替换缺陷基因，并在免疫应答针对之前缺失的蛋白时特别有益。上调utrophin，一种 抗肌萎缩蛋白的常染色体同源物，已被提议作为DMD的潜在疗法(Perkins & Davies， Neuromuscul Disord, Sl :S78_S89 (2002), Khurana & Davies, Nat Rev Drug Discov 2 379-390 (2003))。当utrophin在转基因mdx小鼠中过量表达时，它定位在肌肉细胞的肌纤 维膜上，并恢复抗肌萎缩蛋白相关的蛋白络合物(DAPC)的组分，DAPC可防止营养不良的形 成并由此导致骨骼肌肉的功能改善。已经表明在狗中用腺病毒传递utrophin可防止发病。 在小鼠模型中，出生后utrophin表达立即上升是有效的，且当utrophin普遍表达时未观察 到毒性，这为将该疗法转用至人体提供了前景。将内源性utrophin的上调至充分的水平以 减少发病可通过微小的可扩散化合物的传递得以实现。发明详述已经发现式I的化合物在治疗杜兴氏肌营养不良中具有优异的性能。 因此，需要有效合成式(I)的化合物5_(乙基磺酰基)-2_(萘-2-基)苯并[d] 噁唑。在此提供了式⑴的化合物的制备方法， 其包括在酸催化剂的存在下使式(II)的化合物环化
本公开将参考附图进行详细描述

图1显示了萤光素酶报告体测定(鼠H2K细胞)。图2显示了剂量依赖型萤光素酶诱导。图3显示了用小鼠utrophin特异性抗体染色的TA肌肉切片的范例。图4显示了小鼠暴露至CPD-A(V2和V3)时相对对照表现出上升的utrophin表达 水平。对于所述反应的精确条件可进行较大范围的控制。所有该种控制均在本发明范围 内。在执行本发明时可对技术人员提供帮助的来源包括Vogel' sTextbook of Practical Organic Chemistry,第 5 版，B. S. Furniss 等，PearsonEducation Limited, 1988,其讨论 了常规实施步骤。此外，ComprehensiveHeterocyclic Chemistry，第一卷(AR Katritzky, Cff Rees 编)，Pergamon Press, Oxford, 1984 禾口 Comprehensive Heterocyclic Chemistry II :A Review oftheLiterature 1982-1995 The Structure, Reactions, Synthesis, and Uses ofHeterocyclic Compounds, Alan R. Katritzky (编者)，Charles W.Rees(编者)， Ε. F. V. Scriven(编者)，Pergamon Pr，June 1996中对合成方法进行了讨论。其它可对 技术人员提供帮助的一般来源包括 March' s Advanced OrganicChemistry =Reactions, Mechanisms, and Structure, Wiley-Interscience ；第 5 板(2001 年 1 月 15 日)。所述反应可在-10°C至+170°C的温度下进行。一般地，该反应可在所述溶剂在常 压下的回流温度下进行。已经发现所述试剂可在冷的时候混合，不需要在添加溶剂前事先 加热。通过该方式进行的制备不会对反应产生不利影响。这使得物理处理更为简单和安全。所述反应可以在不干扰该反应的任意合适的溶剂中进行。可以使用的溶剂包括质 子溶剂如乙酸、甲酸、1-和2-丙醇、1-和2- 丁醇、3-甲基-1- 丁醇、异丁醇、1-戊醇，和非 质子溶剂如甲苯、二甲苯(混合物)、二噁烷、4-甲基-2-戊酮、乙酸异丁酯、乙酸正丙酯和 乙酸丁酯。在一个实施方式中，该溶剂为多种二甲苯(混合物)。在一个实施方式中，作为环化副产物生成的水被去除。从反应中去除水的方法已为本领域技术人员公知。在一个实施方式中，该水通过 Dean-Stark装置去除。在该方法的实施方式中，当Dean-Stark装置被使用时，优选该溶剂 具有大于100°C的沸点。已经发现以该方式去除水有利于反应速率和产率。任意合适的酸催化剂均可被用于催化所述环化，且许多已为技术人员所知。合适 的催化剂包括，但不限于对甲苯磺酸和甲磺酸。在某些实施方式中，快速搅拌并非必需。中到大型高架搅拌便已足够，且不必要产 生漩涡。式(II)的化合物可以以任意方式合成。在一个实施方式中，式(II)的化合物通 过式(III)的氨基醇与式(IV)的酰基衍生物反应制备得到，
5 其中X代表离去基团。X代表任意合适的离去基团。技术人员清楚地了解可用的合适酰基衍生物的范围。 然而，在一个实施方式中，X代表卤素，其中卤素表示F、Cl、Br或I。在另一实施方式中，X 代表Cl。用于制备式(II)的化合物的合成可以在任意不干扰该反应的合适溶剂中进行。 可以使用的溶剂包括质子溶剂如乙酸、甲酸、I"和2-丙醇、1-和2- 丁醇、3-甲基-1- 丁醇、 异丁醇和1-戊醇，以及非质子溶剂如甲苯、多种二甲苯(混合物)、二噁烷、4-甲基-2-戊 酮、乙酸异丁酯、乙酸正丙酯和乙酸丁酯。在一个实施方式中，该溶剂为多种二甲苯(混合 物)。在一个实施方式中，本发明的式(II)的化合物在与环化步骤分开的步骤中合成 和纯化。在另一实施方式中，采用了一锅方法，其中式(II)的化合物被合成随后环化，不 需要对式(II)的化合物进行中间纯化或去除溶剂。在一个实施方式中，式(III)的氨基醇和式(IV)的酰基衍生物(其中X代表Cl) 在溶剂中反应，以获得式(II)的化合物， 该式(II)的化合物不经中间纯化或溶剂去除便用于本发明所提供的方法中。在所述氨基醇与所述酰基氯反应过程中，释放出HCl，其可用碱中和。在一个实施 方式中，该碱在外部采集器(external trap)中。外部采集器指该碱不在所述反应混合物 中，且所述HCl-碱加合物不在所述反应混合物中生成。外部采集器的使用简化了纯化，并 使得该碱催化的或是涉及的副反应风险最小化。在一个实施方式中，可将从所述反应混合 物排出的气体通过碱洗液(scrub)，如NaOH (溶液)来中和释放的HCl气体。技术人员熟知 其它可用于中和来自反应的酸性废气的其它洗液。
在某些实施方式中，所述胺与所述酰基氯的反应可非常迅速，且在该阶段不需要 长时间的加热。在大规模(例如大于一千克)反应时，气体释放较为迅速，必需小心控制温 度。例如，可使用夹套反应器-所述温度可被缓慢提升至合适的水平，然后在HCl释放开始 后维持在该温度。当HCl释放完成，不需要继续小心控制_可通过任意合适的方法(例如 GCMS或TLC)监测所述反应以观察完成状态。在另一实施方式中，X代表Cl，所述反应在回流的二甲苯(混合物)中进行，本发 明所提供的方法中所用的式(II)的化合物不经中间纯化或溶剂去除，且在环化步骤中甲 磺酸被用作酸催化剂。所述产物可通过常规技术分离。参见，例如Vogel ‘ s Textbook of PracticalOrganic Chemistry,第 5 版，B. S. Furniss 等人，Pearson Education Limited, 1988，其讨论了常规纯化技术。在一实施方式中，当所述溶剂为多种二甲苯(混合物)时，包含所述产物的溶液被 冷却至约90°C，然后过滤。在某些实施方式中，该过滤步骤中的溶液的温度影响产率和纯 度在过滤中该溶液的温度越高，产物的产率越大，该产物的纯度越低。过滤后，将所述二甲苯(混合物)溶液冷却，以使得所述产物结晶。该产物结晶所 需的时间取决于多种因素-例如该溶液的浓度以及所用的溶剂。然而，在一个实施方式中， 将该反应混合物放置数小时。通过过滤分离所述产物后，任选地将该产物通过合适的溶剂洗涤以进一步纯化。 合适的溶剂包括但不限于MTBE、丙酮和乙醇。在一个实施方式中，该溶剂为甲基叔丁基醚。 以该种方式洗涤可提高该产物的纯度，但可能会降低产率。此外，所述产物可根据需要进行重结晶。可以使用的重结晶溶剂包括混合溶剂，该 混合溶剂包含丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃和庚烷中的一种，和醇(例如乙醇)。重结晶也可仅 在丙酮中进行。式I的化合物在治疗DMD方面的潜在活性可通过以下预测性测定和筛选来证实。1.萤光素酶报告体测定(鼠H2K细胞)该筛选所用的细胞系为永生化的mdx小鼠H2K细胞系，该细胞系被稳定转染了质 粒，该质粒包含具有与萤光素酶报告基因连接的第一未翻译外显子的UtrophinA启动子的 约5kb片段(参见图1)。在低温和含干扰素培养基的条件下，将所述细胞保持为成肌细胞。将它们涂布到 96孔板上，并在化合物的存在下培养三天。然后通过细胞溶解和用平板光度计读取表达的 萤光素酶基因的光输出来测定萤光素酶的水平在该测定中化合物的药物剂量应答的范例显示于图2中。2. mdx 小鼠将从ADMET数据获得的数据以优先顺序排列，并将具有最佳体外萤光素酶活性和 合理ADMET数据的化合物优先在mdx概念验证研究中进行测试，其中该结果被用于鉴定与 仅施用运载体的对照动物相比能够提高抗肌萎缩蛋白缺陷肌肉中的utrophin水平的任意 化合物。在28天中向两只动物每天腹膜内注射施用10mg/kg化合物，并采用年龄匹配的对 照。采集肌肉样本，并进行切片(以识别utrophin的肌纤维膜染色的增加)和Western印
7迹(以识别Utrophin水平的总体增加)。图3显示了用小鼠utrophin的特异性抗体染色的TA肌肉切片的范例。与仅注射 运载体的mdx肌肉比较，显示肌纤维膜结合utrophin的量上升。来自上述处理小鼠的肌肉还被切除和处理以进行Western印迹并用特异性抗体 染色(参见图4)。还是使用施用了 CPD-A的肌肉，显示TA腿部肌肉和隔膜中都存在总体 utrophin水平明显上升。与对照相比，暴露至CPD-A(V2和V3)的小鼠显示utrophin表达 水平上升。来自第一个28天研究的阳性上调数据随后在另两只小鼠的28天研究中重现。已 经表明，总共三种不同的化合物在两次重复实验中显示出了在通过腹膜内施用28天时增 加mdx小鼠中的utrophin表达水平的能力。该数据证实了所述化合物当通过腹膜内递送 时引起mdx小鼠中的utrophin表达水平明显上升的能力，因此使我们有信心该种方法会缓 解所述疾病，因为目前为止所有公开的数据证实了 utrophin水平上升超过三倍对于抗肌 萎缩蛋白缺陷型肌肉具有明显的功能性效果。H2K/mdx/Utro A报告体细胞系的维持该H2K/mdX/Utro A报告体细胞系每周传代两次直至彡30%汇合。该细胞在10% CO2存在下于33°C下生长。为了去除成肌细胞以进行铺板，将它们与胰蛋白酶/EDTA —起孵育直至单层细胞 开始脱落。生长培养基DMEM Gibco 4196620% FCS1 % Pen/Strep谷氨酰胺IOml鸡胚提取物干扰素(I276905 Roche)，新鲜添加 10 μ l/50ml 培养基。96孔板萤光素酶测定将所述H2K/mdx/Utro A报告体细胞系在190 μ 1普通生长培养基中以大约5000 细胞/孔的密度涂布96孔板(Falcon 353296，白色不透明)。将平板在10% CO2存在下于 33°C下孵育24小时。通过向每个孔添加10 μ 1的稀释化合物至10 μ M的终浓度来施用化合物。然后将 所述平板继续孵育48小时。参照生产商的方案(Promega Steady-Glo萤光素酶测定系统(Ε2520))将细胞原 位裂解，然后使用平板光度计计数(Victor 1420) 10秒钟。化合物储存用于筛选的化合物作为含于100% DMSO的IOmM储液在_20°C下储存至使用。用化合物注射mdx小鼠选择来自繁殖族群(breeding colony)的mdx进行测试。每天用运载体或IOmg/ kg化合物通过腹膜内途径(i. p.)注射小鼠。对小鼠称重，并将化合物用5% DMS0、含于PBS 的 0. tween 稀释。
在所需的时间点通过颈脱法处死小鼠，并切除肌肉进行分析。肌肉分析免疫组学切除用于切片的组织，浸入OCT中(Bright Cryo-M-Bed)并在液氮冷却的异戊烷 上冷冻。在Bright恒冷切片机上进行未固定的8 μ M冷冻切片，并贮存在_80°C下。在染色准备过程中，将切片在含于PBS的5%胎牛血清中封闭30分钟。将一级抗 体稀释于封闭试剂中，并在湿润室中与切片孵育1. 5小时，然后在PBS中洗涤三次共5分 钟。次级抗体同样稀释于封闭试剂中，并在湿润室内暗处孵育1小时。最终在PBS中将切 片洗涤三次共5分钟，并通过液封固定盖玻片。使用Leica荧光显微镜分析玻片。结果生物活性可通过萤光素酶报告体测定在小鼠H2K细胞中评估，并分类如下+最高为对照的200%++介于对照的201 %至300 %之间+++介于对照的301 %至400 %之间++++在对照的401 %以上 本发明现在将通过以下的实施例进行描述，这些实施例的目的在于阐述本发明， 而非进行限制。
实施例使用以下物质 步骤将容器配备后掠式叶片搅拌器和向下泵送涡轮、五口法兰盖、密封和夹钳、搅拌 器压盖和高架式搅拌器、温度计插套、Dean-Stark采集器、滴液漏斗和冷凝器。然后打开通 往冷凝器的水。
然后混合氢氧化钠和0. 80L的水(同时在冰浴中冷却，直至所有的氢氧化钠溶 解_小心放热)。然后将所得的溶液转移至与所述容器适当连接的洗涤器中。然后将2-氨基-4-(乙基磺酰基)苯酚和2. OOL 二甲苯(混合物)转移至所述容 器，并将该试剂和溶剂在IOOrprn下搅拌。然后将2-萘甲酰氯溶解于2. OOL 二甲苯(混合物)并转移至所述容器。将搅拌 速率上升至150rpm。所述溶液的温度在不少于30分钟的时间内逐渐上升至100°C，然后在该水平下维 持10分钟。(注意在该过程中HCl气体通过所述气体洗涤器放出)。然后将搅拌速度增 加至315rpm，然后在30分钟内将温度逐渐提高至回流(155°C )，在该水平下维持90分钟。 (注意在该过程中HCl气体通过该气体洗涤器放出)。然后在30分钟内逐滴添加甲磺酸，并保持回流至Dean-Stark装置不再收集到水 (约15分钟)。然后移除热源，并断开Dean-Stark装置的管路接头。将所得的溶液冷却至90°C， 然后使用Whatman 1过滤纸进行过滤。然后将所得的溶液在环境温度下放置18小时，在这段时间后产物结晶，使用 Whatman 1过滤纸过滤分离该产物。随后用1 X 1. OL叔丁基甲基醚(TBME)洗涤该产物。然后将所述产物在65°C和IOmbar压强下的真空炉中干燥，直至达到恒重(至少1 小时的间隔连续称量质量所得的差异小于0. 5g)。所得的产物为沙状的米黄色粉末，产率为80%。所述产物通过在丙酮中溶解，冷却到-10°C至_15°C，并在冷却时过滤可以重结品°表征5-(乙基磺酰基)-2-(萘-2-基)苯并[d]噁唑LCMS RT = 6. 94min, MH+338. 1 ；1H NMR(DMSO) 8. 90 (1H, br) ,8. 34 (1H, d, J 1. 4Hz) ,8. 30 (1H, dd, J 8. 61. 7Hz)， 8. 24-8. 05 (4H, m)，7. 99 (1H, dd, J 8. 51. 8Hz)，7. 73-7. 64 (2H, m)，3. 41 (2H, q, J7. 3Hz)， 1. 15 (3H, t, J7. 3Hz)；MP = 160-161°C。
权利要求
式(I)化合物的制备方法，其包括在酸催化剂的存在下环化式(II)的化合物F2008800158003C00011.tif,F2008800158003C00012.tif
2 如权利要求1所述的方法，其中所述催化剂为甲磺酸或对甲苯磺酸。
3.如前述任一项权利要求所述的方法，其中该方法在加热回流的溶剂中进行。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述溶剂为二甲苯(混合物)。
5.如前述任一项权利要求所述的方法，其中作为所述环化的副产物生成的水被去除。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述水用Dean-Stark装置去除。
7.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述式(II)的化合物在溶剂中合成并随 后进行环化，不需要对式(II)的化合物进行中间纯化或去除溶剂。
8.如前述任一项权利要求所述的方法，其中所述式(II)的化合物通过式(III)的氨基 醇与式(IV)的酰基衍生物的反应制备得到，其中X代表离去基团。
9.如权利要求8所述的方法，其中X代表卤素。
10.如权利要求8所述的方法，其中X代表Cl。
全文摘要
本发明提供了可用于治疗杜兴氏肌营养不良的5-(乙基磺酰基)-2-(萘-2-基)苯并[d]噁唑的制备方法。
文档编号C07D263/57GK101896475SQ200880015800
公开日2010年11月24日 申请日期2008年8月14日 优先权日2007年8月15日
发明者亚历山大·查尔斯·韦茅斯-威尔逊, 奥利佛·达-摩尔, 斯蒂芬·保罗·雷恩, 格雷厄姆·迈克尔·维尼, 罗伯特·克拉克森, 雷纳特·范威尔 申请人:萨米特公开有限公司