检测tert基因启动子突变的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及检测TERT基因启动子突变的试剂盒，还涉及 利用该试剂盒在非疾病诊断中检测TERT基因启动子突变的方法。
【背景技术】
[0002] 端粒酶是一种核糖核蛋白酶，在绝大多数真核生物中，对染色体末端的复制起到 至关重要的作用。端粒酶由一种由催化蛋白和RNA模板组成，可合成染色体末端的DNA，从 而使得端粒不会因细胞分裂而有所损耗，使得细胞分裂克隆的次数增加。端粒酶在正常体 细胞中的无活性或低活性，而在生殖细胞，干细胞及癌细胞中活跃。端粒酶逆转录（TERT) 是端粒酶的催化部分，位于5号染色体短臂，调控端粒酶活性。在人类肿瘤研宄中发现TERT 活跃，使得TERT成为与异常的细胞增值相关的疾病（例如癌症）的预防，治疗的靶点。
[0003] Huang et al. (2013)在70名黑素瘤患者中发现有50名患者（71% )有TERT 启动子突变C228T与C250T。这两个点突变对ETS转录因子产生共有结合基序，提高 了 TERT启动子转录活性并高达2-4倍。研宄发现，点突变C228T与C250T的突变频率 在膀胱癌患者中也非常高，其在染色体的上的位置分别为Chr5: 1，295, 228 (GRCh37)， Chr5: 1，295, 250 (GRCh37)。研宄发现，位于染色体 Chr5: 1，295, 228 (GRCh37)位点上的 C228A与 Chr5:l, 295, 242-l，295,243(GRCh37)位点上的 CC242-243TT 突变也在膀胱癌患者 中检出。因此，检测尿液中TERT基因启动子的突变对于指导膀胱癌等癌症患者临床用药， 具有重要的参考价值。
[0004] 目前检测基因突变的方法主要有以下几种：
[0005] (I)DNA芯片技术（DNAchip) :DNA芯片技术是90年代后发展的一项DNA分析新技 术，它集合了集成电路计算机、激光共聚焦扫描、荧光标记探针和DNA合成等先进技术。在 基因突变检测方面，DNA芯片基本原理为将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1块集成 电路板上，彼此之间重叠1个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧光标记的正常DNA和 突变DNA发别与2块DNA芯片杂交，由于至少存在1个碱基的差异，正常和突变的DNA将会 得到不同的杂交图谱，经过共聚集显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧光信号，即可确 定是否存在突变，该方法快速简单、片动化程度高，具有很大的发展潜力，将在基因突变检 测中心发挥非常重要的作用。
[0006] (2) PCR-SSCP法：PCR-SSCP法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA 分子依其大街基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶 上的移动速度改变。其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构 依赖于其碱基组成，即使一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出刺同的迀移率。由 于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。用PCR-SSCP法检测小于200bp的 PCR产物时，突变检出率可达70% -95%，片段大于400bp时，检出率仅为50 %左右，该法可 能会存在1 %的假阳性率。
[0007] (3)异源双链分析法（HA) HA法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型DNA 双链。由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起，在非变 性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双DNA不同的迀移率。该法与SSCP相似，所不同的 是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA，也只适合于小片段的分析。但HA对一 些不能用SSCP检出的突变有互补作用，两者结合使用，可使突变检出率提高到近100 %。
[0008] (4)探针扩增阻滞突变法（amplification refractory mutation system，ARMS)。 利用PCR探针的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计针对突变 位点的特异性PCR扩增探针，在严格的条件下，只有在探针3'碱基与模板配对时PCR扩增 反应才能正常进行，从而检测出突变。通过设计两个5'端探针，一个与正常DNA互补，一个 与突变DNA互补，对于纯和性突变，分别加入两种探针及3'端探针进行两个平行的PCR，结 合有与突变DNA完全互补的探针才可以延伸并得到PCR扩增产物。
[0009] (5)等位基因特异性寡核苷酸分析法（allele-specific oligonucleotide, AS0) ASO为一种以杂交为基础对已知突变的检测技术。以PCR和ASO相结合，设计一段20bp左 右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR拉增 的样品DNA杂交。可以用各种突变类型的寡核苷酸探针，同时以野生型探针为对照，如出现 阳性杂交带，则表运河样品中存在与该ASO探针相应的点突变，ASO需严格控制杂交条件和 设置标准对照避免假阳性和假阴性。
[0010] (6)连接酶链反应（ligase chain reaction, LCR):与其他核酸扩增技术比较，其 最大特点为可准确区分基因序列中单个基因突变。LCR是以DNA连接酶将某一 DNA链的 5' -磷酸与另一相邻链3' -羟基连接为基础，应用两对互补的引物，双链DNA经加热变性后， 两对引物分别与模板复性，若完全互补，则在连接酶的作用下，使相邻两引物的5' -磷酸与 3' -羟基形成磷酸二酯二酯键而连接，前一次的连接产物又作为下一次循环反应的模板，如 果配对的碱基存在突变则不能连接和扩增。LCR产物检测最初是通过这32p标记上游引物 3'未端，经变性凝胶电泳分离后放射自显影加以鉴定，其检测敏感性达到200个靶分子。也 可设计1个横跨两引物的检测探针，用它与LCR产物进行杂交检测。由于LCR的快速、特蛋 和敏感的特性，以及能检测单个碱基突变的能力，因此被应用于肿瘤基因突变的分子诊断， 并与PCR结合用以提高其敏感性。
[0011] 因此，急需一种提高检测TERT基因的灵敏度的方法和相应的检测试剂盒，为膀胱 癌患者的诊断和治疗提供指导。
【发明内容】
[0012] 有鉴于此，本发明的目的在于提供检测TERE基因启动子突变的试剂盒，该试剂盒 特异性强且灵敏度高；本发明的目的之二在于提供检测TERT基因启动子突变，该方法检测 周期短。
[0013] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0014] 1、检测TERT基因启动子突变的试剂盒，所述试剂盒含有针对TERT基因启动子突 变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针。
[0015] 优选的，所述锁核酸修饰的特异探针的核苷酸序列为CCT+CCCG+GGT+C+CCCG或 CC+CC+CTC+CG+GGCCC，其中" + "后的C或G表示锁核酸修饰碱基。
[0016] 优选的，所述试剂盒中还包含检测TERT基因突变的引物，所述引物的核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 1 与 SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 2 与 SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 3 与 SEQ ID NO. 5 或 SEQ ID NO. 4 与 SEQ ID NO. 5 所示。
[0017] 更优选的，所述试剂盒中还包括PCR缓冲液、dNTPs、Eva Green和二氯化镁。
[0018] 更优选的，所述试剂盒中各组分的终浓度如下：1XPCR buffer、2. 5mM MgCl2、dNTP 250 μ M、引物 250nM、探针 500nM、I X EVE GREEN、DNA 聚合酶 IU 和 DNA 模板 2-20ng。
[0019] 2、所述检测TERT基因启动子突变的试剂盒在非疾病诊断中检测TERT基因启动子 突变的方法，包括如下步骤：
[0020] a.设计检测TERT基因启动子突变的引物和针对TERT基因启动子突变位点的LNA 锁核酸修饰的特异探针；
[0021] b.从