待测样品中提取模板DNA，然后利用步骤a得到的引物和特异探针进行荧光 定量PCR扩增反应；
[0022] c.根据熔解曲线法根据溶解曲线判读Ct值，然后根据Ct值判断待测样品中TERT 基因突变情况，若溶解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内，并且Ct〈45,表明扩增区段 发生突变。
[0023] 本发明的检测原理如图1所示。
[0024] 优选的，所述LNA锁核酸修饰的特异探针的核苷酸序列为CCT+CCCG+GGT+C+CCCG 或CC+CC+CTC+CG+GGCCC，其中" + "后的C或G表示锁核酸修饰碱基。
[0025] 优选的，所述检测TERT基因突变的引物如SEQ ID NO. 1与SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 2 与 SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 3 与 SEQ ID NO. 5 或 SEQ ID NO. 4 与 SEQ ID NO. 5 所示。
[0026] 更优选的，所述荧光定量PCR扩增反应的条件如下：95°C预变性5min ;95°C变性 108,60°〇退火158,72°〇延伸258,50个循环；95°〇变性111^11，40°〇退火11^11，65-95°〇解链， 每秒钟升温0. 02°C，每摄氏度收集25次荧光信号，最后40°C保存。
[0027] 本发明的有益效果在于：（1)特异性强：加入能与野生型特异性结合的LNA锁核酸 修饰的特异探针；（2)灵敏度高，检测灵敏度达到0. 01%; (3)检测过程为闭管反应，减少污 染的可能性；(4)操作简单快速，整个PCR反应过程只有90分钟；而直接测序法则需要2天 的时间，且为开管操作，大大增加污染的可能性；（5)结果判读明确客观，只需根据扩增数 据和熔解曲线即可完成对样本基因类型的判读；(6)安全性好，整个体系不包含有毒有害 物质，无需PCR产物的开管，对试验人员以及环境都无危害。
【附图说明】
[0028] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0029] 图1本发明的检测原理图。
【具体实施方式】
[0030] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本项目由"江苏省科技成果转化专项资 金资助"和"国家高技术研宄发展计划（863计划）资助"，项目编号2014AA020803。
[0031] 本发明中所使用的仪器如下：Lightcycler 480、nanodrop 1000、高速离心机、水 浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、烘箱、灭菌锅。
[0032] 本发明中所使用的试剂：DNA聚合酶（罗氏公司）UOXPCR Buffer (罗氏公司）、 MgCl2 (罗氏公司）、dNTP (TaKaRa)、纯化水。
[0033] 本发明中所使用探针：所有探针纯度应达到电泳级（PAGE)或HPLC级，不含杂带。 提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱，证明使用 PAGE或者HPLC纯化后应有明显单峰PAGE或者HPLC纯化图谱，浓度为IOng/ μ 1备用。
[0034] 实施例1
[0035] 本发明中涉及的质控品由TERT基因启动子C228T、C228A、CC242-243TT、C250T对 应的阳性质粒及阴性基因组DNA组成，阴性基因组DNA为未突变的人血基因组DNA，其浓度 为IO 3拷贝数；阳性质粒为含突变位点的突变序列，由苏州金唯智生物技术公司合成并连到 pUC57-Amp载体中，经过DNA提取、纯化后稀释成浓度为IO3拷贝数，得阳性质粒。上述突变 位点信息来源于NCBI-0MIM数据库，具体的突变序列如下：
[0036] C228T ：
【主权项】
1. 检测TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有针对TERT基因 启动子突变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针。
2. 根据权利要求1所述检测TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于：所述锁核酸 修饰的特异探针的核苷酸序列为CCT+CCCG+GGT+C+CCCG或CC+CC+CTC+CG+GGCCC，其中" + " 后的C或G表示锁核酸修饰碱基。
3. 根据权利要求1所述检测TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂 盒中还包含检测TERT基因突变的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1与SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 2 与 SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 3 与 SEQ ID NO. 5 或 SEQ ID NO. 4 与 SEQ ID NO. 5 所示。
4. 根据权利要求1所述检测TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒 中还包括PCR缓冲液、dNTPs、Eva Green和二氯化镁。
5. 根据权利要求4所述检测TERT基因启动子突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂 盒中各组分的终浓度如下：1XPCR buffer、2. 5mM MgCl2、dNTP 250 yM、引物250nM、探针 500nM、I XEVE GREEN、DNA 聚合酶 IU 和 DNA 模板 2-20ng。
6. 权利要求1~5任一项所述检测TERT基因启动子突变的试剂盒在非疾病诊断中检 测TERT基因启动子突变的方法，其特征在于，包括如下步骤： a. 设计检测TERT基因启动子突变的引物和针对TERT基因启动子突变位点的LNA锁核 酸修饰的特异探针； b. 从待测样品中提取模板DNA，然后利用步骤a得到的引物和特异探针进行荧光定量 PCR扩增反应； c. 根据熔解曲线法根据溶解曲线判读Ct值，然后根据Ct值判断待测样品中TERT基因 突变情况，若溶解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内，并且Ct〈45,表明扩增区段发生 突变。
7. 根据权利要求6所述检测TERT基因启动子突变的方法，其特征在于：所述LNA锁 核酸修饰的特异探针的核苷酸序列为CCT+CCCG+GGT+C+CCCG或CC+CC+CTC+CG+GGCCC，其中 " + "后的C或G表示锁核酸修饰碱基。
8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述检测TERT基因突变的引物如SEQ ID NO. 1 与 SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 2 与 SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 3 与 SEQ ID NO. 5 或 SEQ ID NO. 4 与 SEQ ID NO. 5 所示。
9. 根据权利要求6所述检测TERT基因启动子突变的方法，其特征在于：所述荧光定量 PCR扩增反应的条件如下：95°C预变性5min ;95°C变性10s，60°C退火15s，72°C延伸25s，50 个循环；95 °C变性Imin，40 °C退火Imin，65-95 °C解链，每秒钟升温0. 02 °C，每摄氏度收集25 次荧光信号，解链中每秒采集荧光20次，最后40°C保存。
【专利摘要】本发明公开了检测TERT基因突变的试剂盒及其检测方法，试剂盒含有针对TERT基因突变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针，该特异探针能够与野生型DNA结合，能检出含0.01％TERT基因突变DNA的样本、最低检出限为2-5拷贝，本发明的检测方法对TERT基因突变检测具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性等优点，特别适合从血浆，尿液，唾液等含有突变含量低的体液中检测基因突变，适合对膀胱癌进行早期筛查和诊断，为个体化用药提供指导。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104805206
【申请号】CN201510212987
【发明人】王弢, 李宗飞, 孙爱娟, 李 杰, 张丽
【申请人】苏州工业园区为真生物医药科技有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月29日