一种Gilbert综合征基因突变检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因检测试剂盒，具体涉及一种Gilbert综合征基因突变检测试剂 盒，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] Gilbert 综合征（Gilbert syndrome，GS)，由 Gilbert 和 Lereboullet 在 1901 年 首次报道，又称体质性肝功能不良性黄疸，是一种常见的遗传性非结合胆红素血症。该病患 者由于肝细胞摄取非结合胆红素 （unconjugated bilirubin, UCB)功能障碍及微粒体内葡 萄糖酸酸转移酶（uridine diphosphate glucuronosyl transferase，UGT)不足，导致血中 UCB增高而出现黄疸。患者主要表现为以间接胆红素升高为主的非溶血性间歇性黄疸，一些 患者可出现乏力、消化不良、肝区不适和脂肪不耐受。
[0003] 随着分子生物学技术的发展，人们对Gilbert综合征的研宄已非常深入。研宄发 现，胆红素在肝内的代谢主要是通过尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶IAl (UGTlAl)实现的， UGTlAl基因异常可导致肝脏微粒体的胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶表达下降，从而 引起胆红素代谢障碍。目前已在Gilbert综合征患者及其家系中发现3种类型的UGTlAl 基因异常，包括远端加强序列即苯巴比妥反应增强元件（PBREM) -3279位点突变，PBREM约 位于TATA上游，沈健等人在《胃肠病学》2007年12卷392-396页中的标题为《1例中国 Gilbert综合征家系UGTlAl基因遗传分析.》报道了我国首例PBREM区存在T-3279G突变， 此突变与基因转录活性下降导致的胆红素水平升高显著相关；启动子区域TA盒中TA碱 基序列插入突变，表现为二核苷酸（TA)插入到UGTlAl基因启动子上游约25~35个bp处的 TATA盒中，使正常野生型A (TA)6TAA突变为A (TA)7TAA;UGT1A1基因外显子区域的单碱 基突变，包括 G71R、G493R、P364L、P229Q、F83L、R367G 及 Y486D，以核苷酸 211 位点 G - A 点 突变（G71R)最为频繁，常见于亚洲人。
[0004] 现有技术中，Gilbert综合征的诊断可采用UGTlA多克隆抗体的肝组织免疫组织 化学检查，测定肝内UGT的活性程度，或通过分子生物学技术检测相关的UGTlA基因启动子 区TATAA序列的遗传学多态性。目前主要通过PCR测序技术来检测Gilbert综合征基因 突变，但是测序价格较贵，因此必须寻找一种应用简单、结果可靠、价格低廉的技术来开发 Gilbert综合征基因检测试剂盒。
[0005] DNA微阵列芯片是按照特定的排列方式固定有大量基因探针的硅片、玻片、塑料 片，能够高效地大规模获取相关生物信息。DNA微阵列芯片技术是新开发的一种DNA序列变 异检测工具，应用领域主要有基因突变及多态性分析、基因测序，疾病诊断和预测、药物筛 选等，为现代医学，医学诊断学的发展提供了强而有力的工具。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是将DNA微阵列芯片技术应用于Gi Ibert综合征基因突变检测，开 发一种新型的Gilbert综合征基因突变检测试剂盒。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明包含下述技术方案： 一种Gilbert综合征基因突变检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒由丙稀酰胺修饰的 PCR产物及其他成分固定于用丙烯基团修饰的玻片上而制成的DNA微阵列芯片，6种核苷酸 探针部分组成，其中，所述的丙烯酰胺修饰的PCR产物部分由4种引物PCR扩增获得，其中 引物序列分别为： SEQ ID NO. 1:5' -CAACTCATCCTTATTCTGAT -3' SEQ ID Ν0·2:5' -丙烯酰胺-CTCATGCCTCCTCTCTAACC-3' SEQ ID NO. 3:5' -CCGAGCTACCTTTGTGGACT-3' SEQ ID Ν0·4:5' -丙烯酰胺-CACGATGCCCGAGACTAACTAA -3' 所述6种核苷酸探针部分序列分别为， SEQ ID NO. 5:5' -TTCTGTTTGAAGA -3' SEQ ID NO. 6:5' -TTCTGTGTGAAGA -3' SEQ ID NO. 7:5' -GCCATATATATATATATAAG -3' SEQ ID NO. 8:5' -GCCATATATATATATATATAAG -3' SEQ ID N0.9:5' - AGAG TCGGAGCTT -3' SEQ ID NO. 10:5' -AGAGTCAGAGCTT - 3'。
[0008] 在本发明的一个较佳实施例中，所述的其他成分为30%丙烯酰胺、50%丙三醇和 10%过硫酸铵组成的混合溶液。
[0009] 在本发明的一个较佳实施例中，所述的检测试剂盒还包括阳性质控品，所述的阳 性质控品为UGTlAl增强元件PBREM基因片段，UGTlAl启动子区片段和外显子1基因片段。 [0010] 在本发明的一个较佳实施例中，采用PCR产物及其他成分固定于用丙烯基团修饰 的玻片上，制成的DNA微阵列芯片，用于与相应探针进行杂交反应。
[0011] 在本发明的一个较佳实施例中，所述的杂交反应中的杂交温度为30 - 40°C，杂交 时间为1 一 3h。
[0012] 在本发明的一个较佳实施例中，所述的检测试剂盒用于基因突变所致的Gilbert 综合征的疾病筛选和临床辅助诊断。
[0013] 本发明还另外提出了 一个新的技术方案，提出了一种的GiIbert综合征基因突变 检测试剂盒所用的DNA微阵列芯片的制备方法，包括如下步骤： (1)点样：将丙烯酰胺修饰的PCR产物和其他成分混合成预聚合物，然后将上述预聚合 物溶液和空白对照点样于丙烯基团修饰的玻片上，其中，所述的其他成分为30%丙烯酰胺、 50%丙三醇和10%过硫酸铵组成的混合溶液。所述空白对照为水和30%丙烯酰胺、50%丙三 醇以及10%过硫酸铵混合成的预聚合物。。
[0014] (2)固定：制备DNA微阵列芯片：点样完成后，将玻片置于潮湿的盛有TEMED的容 器中，在真空状态下当TEMED挥发到玻片表面时，丙烯基团之间会发生共聚合反应，得DNA 微阵列芯片， 其中，所述的丙烯酰胺修饰的PCR产物部分由4种引物PCR扩增获得， 其中引物序列分别为： SEQ ID NO. 1:5' -CAACTCATCCTTATTCTGAT -3' SEQ ID Ν0·2:5' -丙烯酰胺-CTCATGCCTCCTCTCTAACC-3' SEQ ID NO. 3:5' -CCGAGCTACCTTTGTGGACT-3' SEQ ID ΝΟ·4:5' -丙烯酰胺-CACGATGCCCGAGACTAACTAA -3'。
[0015] 在本发明的一个较佳实施例中，所述的聚合反应的反应时间为30 -60min，温度为 20 - 30°C，真空度 1000 Pa。
[0016] 本试剂盒采用DNA微阵列技术，可对Gilbert综合征基因突变位点进行检测，操 作简便快捷、价格低廉，可用于基因突变所致的Gilbert综合征