用于检测scz相关基因多态性的引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种预测精神分裂症易感性的试剂，具体涉及基 于PCR-RFLP方法的用于检测与精神分裂症易感性相关的人VRK2基因单核苷酸多态性的引 物以及含有该引物的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 精神分裂症（SCZ)是一种病因不明、复发率高且常见的重型精神障碍，多发病于 青壮年时期。常缓慢起病，以感知觉、思维过程、情感活动、行为等多方面的障碍以及伴随精 神活动的不协调为特点，一般不会伴有智力和意识障碍。容易复发是本病的特征之一，且每 一次复发会进一步损害患者的预后，多次发病后病情会不断恶化，但有部分病人也可以保 持痊愈或基本痊愈状态，部分病人严重退化，丧失工作能力和生活能力。精神分裂症作为最 常见、最严重的精神疾病，具有发病率低但相对患病率高的特征。精神分裂症全球终身患病 率在3. 8%。?8. 4%。，美国研宄结果表明其终身患病率为13%。。2011年世界卫生组织（WHO) 精神卫生报告结果显示：精神疾病负担约占全球疾病的总负担为8%。，已成为全球公共性 卫生的重大问题。
[0003] 精神分裂症被称为最复杂的人类疾病，一些学者通过家系、双生子和寄养子的研 宄发现：遗传是精神分裂症的发病重要因素，遗传度高达70%?85%。随着当前数据处 理信息化程度的提高和分子生物学技术的进步，疾病的分子遗传学研宄已步入一个全新的 阶段。一些应用基因组扫描方法研宄的结果发现19号染色体、21号染色体和Y染色体以 夕卜，余下染色体上都有可能存在精神分裂症致病基因。其中报道较多阳性区域号染色 体（q21_22、p21. 2-31. 2 和 q32_42)、2 号染色体（pl3-14)、4 号染色体（pl6)、5 号染色体 (q22_35)、6号染色体（ql3_26和p24-22)、7号染色体（q22)、8号染色体（p22-21)、10号染 色体（pll-15)、13 号染色体（ql4_33)、15 号染色体（ql3_15)、18 号染色体（pll_ql2)、22 号染色体（qll-13)和X染色体。除了精神分裂症发病假说中相关的候选基因以外，其它研 宄发现的与精神分裂症发病或者症状相关的基因，如L型钙离子通道a IC亚基（CACNA1C) 基因和G蛋白β亚基1样蛋白（GNBlL)基因等。
[0004] 迄今，随后基因组的计划不断向前发展，精神疾病分子遗传学的研宄也紧跟快速 发展，而且不断有研宄报道新的候选基因，从目前的研宄来看，SCZ的易感基因很多，但是关 于位于7号染色体的VRK2基因 rs3732136位点多态性与SCZ的关系未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供用于检测SCZ相关基因多态性的引物及试剂盒。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0007] 通过提取人基因组DNA，测定受试者的VRK2基因（NC_000002. 12) 3 ' UTR区 rs3732136位点的基因型，发现该位点的单核苷酸多态性与受试者对精神分裂症的易感性 密切相关：VRK2基因型为T/T纯合子时，受试者的易感性最高；VRK2基因型为T/C杂合子 时，受试者的易感性较高；VRK2基因型为C/C纯合子时，受试者的易感性最低。
[0008] 根据以上发现，本发明提供了一种分离核酸，具有SEQ. ID. NO. 1所示的碱基序列， 在第178位为C，该核酸序列为VRK2基因3' UTR区部分序列。本发明提供一对引物，具有 SEQ. ID. NO. 2和SEQ. ID. NO. 3所示的碱基序列，长度为分别为18bp和22bp，而且可以特异 性地扩增出含有SEQ. ID. NO. 1所示序列中第178位SNP的扩增产物，所述的引物分别为：
[0009] 正义引物 Fl :CTCTGAAGATGATACCAA (如 SEQ. ID. NO. 2 所示）；
[0010] 反义引物 Rl :TATGACACTATTCTATGACACT (如 SEQ. ID. NO. 3 所示）。
[0011] 本发明提供了一种检测SCZ易感性的诊断试剂盒，其中包含有引物对Fl和Rl以 及用于PCR扩增检测的试剂盒的其他试剂、缓冲液等。检测扩增产物与SEQ. ID. NO. 1序列 第178位相互对比是否存在变异时，所需的化学试剂还包括限制性内切酶等。本发明试剂 盒中的全部组分、含量、来源如下：
[0012] 所述诊断试剂盒（试剂盒的保存温度为-20°c)供10人份检测应用，其组分、含量 和来源包括：
[0013] 125 μ L 2XPCR MasterMix(RUNDE)；
[0014] 10 μ mol/ μ L Fl (SEQ. ID. NO. 2)和 10 μ mol/ μ L Rl (SEQ. ID. NO. 3)各 10 μ L ;
[0015] 1.5mL 纯水；
[0016] 20 μ L 10X限制性内切酶反应缓冲液（Fermentas);
[0017] 5 μ L(10U/μ L)限制性内切酶 Csp6I (Fermentas)。
[0018] 试剂盒的使用方法如下：
[0019] 1)通过PCR扩增VRK2基因的3' UTR部分片段
[0020] 制备混合液：PCR管中加入提取自受测人的基因组DNA溶液50ng/ μ L 1 μ L、 12.5yL 2XPCR MasterMix、lyL Fl、lyL R1，接着，加入纯水，使总体积为 25yL。
[0021] PCR扩增的反应过程为：95°C 5分钟，进入循环程序：95°C 0. 5分钟，52°C 0. 5分钟， 72 °C 0. 5分钟，进行35个循环，最后72 °C 10分钟。
[0022] 反应完成后，将5 μ L反应产物在2 %的琼脂糖凝胶上电泳检测，如扩增了 207bp的 片段，获得了单一条带，即为扩增成功。
[0023] 2)通过用限制性内切酶处理PCR反应产物测定VRK2基因的多态性
[0024] 向10 μ L上述扩增成功的PCR反应产物中加入2 μ L 10X限制性内切酶反应缓冲 液、0. 5 μ L限制性内切酶Csp6I，纯水补足至20 μ L，并在37°C水浴中消化过夜。之后，在 2. 5 %的琼脂糖凝胶上电泳。
[0025] 3)多态性分型
[0026] 用限制性内切酶Csp6I处理后，在第178位碱基是C等位基因时，出现175bp和 32bp(由于条带太小，检测不到）的条带。如为T等位基因时，仅