一种检测生物滤床对胞外微囊藻毒素降解潜能的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于吸附材料技术领域。更具体地，涉及一种树枝状高密度固态胺纤维材 料及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 微囊藻毒素（Microcystins，简称MCs)是一种肝毒素，在藻华水体中普片存在，短 期大量摄入会引起死亡，长期饮用也会引发肝癌等症状。目前，微囊藻毒素已发现超过80 多种构型，最常见也是影响最大的是MC-LR、MC-RR和MC-YR这三种，其中MC-LR是分布最 广，影响最大的一种微囊藻毒素。微囊藻毒素一般产生并存在于藻细胞体内，但在一定条件 下，藻细胞会破裂，胞内藻毒素（MC)会释放到水体中，成为溶解态的胞外毒素（EMC)，严重 威胁饮用水安全。
[0003] 目前，针对微囊藻毒素的去除方法已经有许多种，根据其去除原理可粗略分为物 理法、化学法、生物法3大类，比较常见如气浮、活性炭吸附、臭氧氧化、Fenton氧化等。物理 法大部分通过去除微囊藻细胞从而去除胞内藻毒素（IMC)，但对水体中的胞外毒素（EMC) 的去除效果并不理想，且容易使藻细胞破裂，增加水体中的胞外毒素。化学方法主要通过氧 化作用破坏MCs的结构，大部分对胞内、胞外毒素均有较好的处理效果，但化学药剂的大量 使用容易产生有毒有害副产物，带来二次污染，且处理成本极高，难以大规模应用。自然曝 气生物滤床是在传统滤床的基础上发展起来的，其占地面积小，运行成本低、处理快速、且 对胞外毒素和胞内毒素均与较高的去除效率，有着很好的应用前景。
[0004] 研宄指出，生物滤床基质中微生物的降解作用是生物滤床去除胞外微囊藻毒素的 主要途径。基质表面挂膜形成的生物膜降解菌群落对溶解态的胞外毒素的去除具有十分重 要的作用。然而，目前大部分滤床为不断添加富营养水体进行自然挂膜，而常规手段无法对 生物膜的形成状况及基质中的微囊藻毒素降解菌丰度进行检测评估，因而往往需要进行长 期挂膜，以尽量确保生物膜的形成稳定，生物滤床能达到较好的去除效果，不仅浪费大量的 人力和资源，而其对生物滤床的挂膜状况也无法准确评估。现有技术中，小规模装置大多通 过人工配置含微囊藻毒素进水或在微囊藻水华时检测装置对微囊藻毒素的去除率从而对 装置去除能力进行衡量。然而，人工配置大量微囊藻毒素进水操作麻烦，且成本昂贵，无法 大规模使用。而在水华期间进行检测去除率也无法达到提前准备的作用，对水质安全无法 保证。传统的COD检测法可以在一定程度上衡量装置生物膜的发育是否稳定，但无法专一 针对微囊藻毒素降解菌进行检测，评估结果准确度较差。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是克服现有检测生物滤床降解潜能技术的缺陷和不足， 提供一种简单、快速、准确、可靠、灵敏度高的检测生物滤床的降解潜能的方法。
[0006] 本发明的目的是提供一种检测生物滤床对胞外微囊藻毒素降解潜能的方法。
[0007] 本发明另一目的是提供上述检测生物滤床对胞外微囊藻毒素降解潜能的方法的 应用。
[0008] 本发明上述目的通过以下技术方案实现： 一种检测生物滤床对胞外微囊藻毒素降解潜能的方法，是通过实时荧光定量PCR方法 检测生物滤床基质中的微囊藻毒素降解菌的丰度，从而间接评估生物滤床对微囊藻毒素的 降解能力，步骤如下： 51. 采集生物滤床表层的基质； 52. 震荡过滤提取基质生物膜上的微生物； 53. 快速提取微生物的DNA ; 54. 通过实时荧光定量PCR检测微囊藻毒素降解菌基因 mlrA的拷贝数； 55. 通过mlrA及微囊藻毒素降解效率间的关系曲线评估生物滤床对微囊藻毒素的降 解能力。
[0009] 具体地，上述检测生物滤床对胞外微囊藻毒素降解潜能的方法包括如下步骤： 51. 生物滤床基质样品采集与处理：采集生物滤床表层I. 0~5. Ocm处的基质，加入到 TE缓冲液中，震荡清洗15~30min后，取出悬浊液，向剩余基质中再次添加 TE缓冲液，震荡 清洗15min，取出悬浊液； 52. 过滤：将Sl处理后得到的所有悬浊液依次用孔径I. 0 μπι的玻璃纤维微孔滤膜A (25mmX I. 0 μπι)和孔径0· 22 μπι的玻璃纤维微孔滤膜B (25mmX0. 22 μπι)进行过滤(过滤 所用滤膜均为玻璃纤维微孔滤膜直径为25mm，面积较小，方面后续步骤的操作，如较易塞进 含玻璃小珠的I. 5mL离心管中）； 53. 样品DNA提取：将含有样品的滤膜B轻轻塞进含有玻璃珠的离心管中，用液氮反复 冻融后，进行DNA提取(滤膜上的微生物细胞经过液氮冻融法和玻璃小珠法共同作用，细胞 破碎更充分）； 54. 实时荧光定量PCR反应：以提取的样品DNA为模板，用引物qmlrAf和qmlrAr进行 实时荧光定量PCR反应，所述引物qmlrAf和qmlrAr的序列分别如SEQ ID NO. 1~2所示； 55. 根据实时荧光定量PCR反应得到的拷贝数来判断生物滤床对胞外微囊藻毒素的降 解潜能。
[0010] 更具体地，上述检测生物滤床对胞外微囊藻毒素降解潜能的方法的步骤如下： 51. 生物滤床基质样品采集与处理 SI 1.采集生物滤床表层I. 0~5. Ocm处的基质10~30g，加入到已添加100~200mL TE缓冲液的玻璃瓶(如蓝盖玻璃血清瓶）中，28°C，280r/min震荡15~30min后，取出悬浊 液； S12.向Sll剩余基质中添加50~IOOmL TE buffer，震荡15min取出悬浊液； 该步骤Sl (微生物）基质样品采集与处理过程中，在恒温振荡器中清洗2次(第一次添 加100-200mL TE缓冲液，第二次添加50-100mL TE缓冲液)，能够保证充分提取微生物，避 免残留； 52. 过滤： 521. 将Sl处理后得到的所有悬浊液用孔径1.0 μπι的玻璃纤维微孔滤膜A (25mmX I. 0 μ m)进行过滤，滤膜A再经CldH2O冲洗3~5次并抽滤干净； 522. 收集S21的滤液，再次通过孔径0· 22 μπι的玻璃纤维微孔滤膜B(25mmX0. 22 μπι) 过滤；（过滤所用滤膜均为玻璃纤维微孔滤膜直径为25mm，面积较小，方面后续步骤的操 作，如较易塞进含玻璃珠的I. 5mL离心管中）； 53. 样品DNA提取：将含有样品的滤膜B轻轻塞进I. 5mL离心管中，并用液氮反复冻融 3~5次，回温后再将滤膜塞进含玻璃珠的2mL离心管中，添加提取缓冲液，高速涡旋5min， 进行DNA提取； 所述提取缓冲液为：〇. IM磷酸盐缓冲液，0.1 M Na2EDTA，0.1 M Tris-HC1，1.5M NaCl， 1%CTAB ； 54. 实时荧光定量PCR反应：以提取的样品DNA为模板，用引物qmlrAf和qmlrAr进行 实时荧光定量PCR反应，所述引物qmlrAf和qmlrAr的序列分别如SEQ ID NO. 1~2所示； 55. 根据实时荧光定量PCR反应得到的拷贝数来判断生物滤床对胞外微囊藻毒素的降 解潜能(实时荧光定量PCR反应得到的拷贝数可以换算成降解菌的细胞数，进而判断生物 滤床的降解潜能；拷贝数越多，降解菌的细胞数就越多，滤床的降解潜能就越高)。
[0011] 其中，优选地，步骤Sl所述采集是在基质表层设置4~10个采集点，采集点在基 质表层平面上均匀分布，各采集点采集的样品进行混合；所述基质为粒径I. 0~3. Ocm的火 山石、陶粒或沸石等孔隙率较大，易附着微生物的自然材料。
[0012] 更优选地，步骤Sl是在生物滤床表层I. 0~3. Ocm采集基质，采集量为10~20g。
[0013] 另外，优选地，步骤S1所述生物滤床为模块式自然曝气生物滤床(如附图1所示)， 垂直方向共分为5层，上面四层为基质填充层，填充基质为火山石、陶粒或沸石，最下面一 层为循环进水层；每层均设置采样口，方便基质采集，每层模块间为跌水曝气层；另外还设 置有流量控制器、出水口、每层底部圆筛出水口、装置底部布水管、顶部进水管； 所述模块式自然曝气生物滤床的基质为粒径I. 〇~3. Ocm的火山石、陶粒或沸石等自 然材料； 步骤Sl所述采集是通过预设采样口从每层基质填充层的表层采集基质，每层基质设 置采集点4~10个，采集点在基质表层平面上均匀分布，同一层各采集点采集的样品进行 混合。
[0014] 只采集各层表层基质是为了减少