对基质表面所生物膜的破坏，避免频繁采样影响 装置去除效果，基质采集后马上放入TE缓冲液（TE buffer)中避免影响生物膜活性，导致 DNA的定量检测不准确。滤床分为多层模块，并同时对每层滤床模块均进行随机采样，既能 确保检测结果的重现性和准确性，又能避免垂直发掘基质对装置基质生物膜结构的破坏。
[0015] 优选地，步骤S3所述DNA提取的方法如下： 531. 将含有样品的滤膜B轻轻塞进I. 5mL离心管中，并用液氮反复冻融3~5次，回 温后再将滤膜塞进含玻璃珠的2mL离心管中，添加500 μ L提取缓冲液和5 μ L的10 mg/mL 蛋白酶K，混匀后3000~3500rpm涡旋5min，1000 g离心30s ; 532. 取上清，加入50 μ L溶菌酶，轻轻混匀，水浴5min，再加入250 μ L 20% SDS，65 °C水 浴lOmin，期间上下颠倒数次混勾，1000 g离心30s ; 533. 收集上清，加1000 μ L异丙醇于室温沉淀； 534. 重新悬浮沉淀，分多次转移到含收集管的离心纯化柱上，1000 g离心30s，去废液； 535. 向离心纯化柱中加入70%乙醇清洗两次，倒去废液； 536. 加100 μ L TE缓冲液洗脱DNA，-20°C保存备用； 所述提取缓冲液为：〇. IM磷酸盐缓冲液，0.1 M Na2EDTA，0.1 M Tris-HC1，1.5M NaCl， l%CTAB〇
[0016] 步骤S3所述玻璃珠的直径为0.1 ~0. 5mm，使用之前需要酸洗过夜，所述酸洗使用 盐酸的纯水溶液，盐酸与纯水的体积比为1 :15。酸洗的目的是使玻璃珠表面形成小孔，在 震荡的时候更好的破碎细胞。
[0017] 优选地，步骤S4所述实时荧光定量PCR反应的反应体系为：共25 μ L，样品DNA 2. 0 μ L，正反引物各 I. 0 μ L，Tapman 探针 0· 5 μ L，CldH2O 8. 0 μ L。
[0018] 所述实时荧光定量PCR反应的反应程序：95°C 180s，40个循环，每个循环包括 95〇C 5s,62〇C 25s〇
[0019] 另外，在实际应用中，还可以在利用上述方法检测生物滤床对胞外微囊藻毒素降 解潜能的同时，再利用上述方法的原理设计模拟实验，利用浓度不一的基质微生物提取液 和不同浓度的微囊藻毒素，检测微囊藻毒素降解菌mlrA和微囊藻毒素 MC-LR的浓度变化， 检测mlrA拷贝数与微囊藻毒素降解效率之间相关性，方便后续评估工作；模拟实验中，所 用细菌为生物滤床基质上提取出来的混合菌落。
[0020] 本发明提供的上述方法在检测生物滤床对胞外微囊藻毒素降解潜能方面的应用 也在本发明的保护范围之内。
[0021] 优选地，所述生物滤床为上述模块式自然曝气生物滤床(如附图1所示)，滤床的基 质为粒径I. 0~3. Ocm的火山石、陶粒或沸石等孔隙率较大，易附着微生物的自然材料。
[0022] 本发明为了寻求一种更简单准确的检测生物滤床对胞外微囊藻毒素降解潜能的 方法，做了大量的研宄和探索。微生物对微囊藻毒素的降解是受基因调控的，大部分微囊藻 毒素降解菌均能检测出mlr基因（mlrA-D)。其中，mlrA基因是微囊藻毒素降解菌降解作用 的关键基因。因此，我们首次创造性的考虑利用实时荧光定量PCR方法快速检测出基质中 微囊藻毒素降解菌基因 mlr的拷贝数，从而知道基质中微囊藻毒素降解菌的丰度，更为准 确地了解装置的降解潜能。
[0023] 但是在实验探索的过程中我们发现，生物滤床采用的基质通常为火山石、沸石或 陶粒等天然材料，这类材料粒径较大，吸附能力较强、孔隙率高，对样品DNA的采集和充分 提取会造成很大的困难。常规基质的DNA提取方法，如超声波提取法，效果并不十分理想， 液氮研磨法、SDS细胞裂解法等对此类基质提取在操作上存在一定的复杂性，且通过离心提 取上清液会对样品DNA造成一定的损失，在应用与实时荧光定量PCR时会造成较大的误差。 因而，寻求一种更为简单有效的滤床基质样品采集处理及DNA提取方法，使微囊藻毒素降 解菌检测更为准确是十分必要的。
[0024] 首先在样品采集的过程中，传统基质提取DNA的操作大部分是采用震荡后离心， 本发明的DNA提取采用的是震荡后过滤，并且严格控制震荡时间和转速，这样能够保证DNA 的损耗最低。但是，同时火山石基质震荡过程中比较容易碎裂，导致过滤时杂质较多，因而， 不仅需要选择合适孔径的滤膜，还需要孔径不同的两张滤膜依次过滤或叠在一起同时过 滤，且需要反复冲洗多次，才既能保证DNA得率受到最低的影响，又能保证所得DNA的纯度， 以满足后续实验的要求。本方法中，悬浊液均通过孔径1. 0 μ m和0. 22 μ m的玻璃纤维微孔 滤膜A (25mmX I. 0 μ m)两次过滤，且第一次滤膜上杂质经CldH2O润洗后继续抽滤，能确保除 火山石等基质因机械轻度一般，强烈震荡过程中碎裂产生的大量大颗粒杂质在通过1. 0 μ m 孔径滤膜A过滤后被有效去除，避免基质碎肩对后续步骤的影响。此外，降解菌直径约为 0. 3-0. 8 μ m，多次清洗过滤能使其尽可能全部通过1.0 μ m滤膜A，并在第二过滤后被截留 在0. 2 μ m孔径的微孔滤膜B上。
[0025] 另外，对于滤膜需要考虑的因素不仅仅是孔径，对于滤膜的大小与直径同样需要 合理的选择。本发明选用直径25mm的滤膜(面积较小)，这样一方面既可以过滤较多的样品， 同时又能保证滤膜能够塞进DNA提取所用的离心管中；而且由于体积较小，提取得到的DNA 浓度更高，最终提取效率更好。而常用的50_的滤膜太大，即使剪碎塞进离心管也太满，涡 旋效果不好，严重影响DNA的纯度和得率。在细胞破碎的时候，为了获得更高的DNA得率， 本发明还采用了液氮冻融和玻璃珠破碎并用的方法，加上合适的细胞裂解液，细胞破碎更 充分，效果更好，保证了 DNA得率。
[0026] 本发明提供的检测生物滤床对胞外微囊藻毒素降解潜能的方法适用于各种生物 滤床的降解潜能的检测，尤其适用于模块式自然曝气生物滤床(如附图1所示)，滤床的基质 为粒径I. 0~3. Ocm的火山石、陶粒或沸石等孔隙率较大，易附着微生物的自然材料。
[0027] 本发明具有以下有益效果： (1)方法的操作简单、快速，从样品采集到检测出结果全过程只需2. 5-3. 5h。
[0028] (2)方法直接针对微囊藻毒素降解菌基因进行检测，针对性强，灵敏度高，准确性、 可靠性高。
[0029] (3)滤床基质采集与DNA分离操作方便简单，既能保证滤床垂直结构上的样品采 集，又能避免深挖基质对生物膜结果的破坏。
[0030] (4)采用实时荧光定量PCR方法能够对多个生物滤床或滤床的多个位点进行多个 样品同时测定，适用于大规模生物滤床的大日常检测和维护。
【附图说明】
[0031] 图1为模块式自然曝气生物滤床装置示意图；1为基质及水样采样口；2为跌水曝 气层；3为基质填充层，共4层，填充基质为火山石；5为流量控制器，控制循环进出水；6为 出水口；7为每层底部圆筛出水口；8为装置底部布水管；9为顶部进水管。
[0032] 图2为实施例1火山石基质表面微生物mlrA基因 PCR扩增电泳图。
[0033] 图3为实施例1中生物滤床每层微囊藻毒素 MC-LR的降解浓度和基质表面mlrA 基因的拷贝数变化图。
[0034] 图4、图5、图6分别为实施例2中MC-IR初始浓度为5、20、100yg/Ut，3fmlrA 初始浓度（IO3UO5UO6个拷贝/mL)下MC-LR的降解率变化图。
[0035] 图7为实施例2中微囊藻毒素初始浓度与其比降解速率(单位微囊藻毒素降解菌， 以mlrA为指标)。
【具体实施方式】
[0036] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明 做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试 剂、方法和设备。
[0037] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0038] 实施例1火山石自然曝气生物滤床微囊藻毒素降解菌的检测 1、本实施例检测模块式自然曝气生物滤床对胞外微囊藻毒素的降解潜能，该装置的