基于实时荧光定量pcr的黔北麻羊fshr基因组织表达谱的建立方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其是一种基于实时荧光定量PCR的黔北麻羊FSHR基 因组织表达谱的建立方法。
【背景技术】
[0002] 促卵泡素 （Follicle stimulating hormone，FSH)是脑腺垂体分泌的对卵巢卵泡 生长、发育、分化和成熟起重要作用的生殖类激素。其为生物大分子，不能透过细胞膜，必须 与促卵泡素受体（follicile stimulating hormone receptor，FSHR)结合才能发挥其生物 学功能。FSHR是G蛋白偶联受体超家族的成员之一，其受体蛋白肽链在功能和结构上可以 分为三个部分：胞内域、跨膜域和胞外域，即4个包质区、7个跨膜疏水区和N端的3个环状 区组成的细胞外区。促卵泡素对雌性动物的繁殖性能具有重要的作用。然而，促卵泡素必 须与促卵泡素受体结合才能发挥作用。所以，促卵泡素受体的质量和数量决定促卵泡素生 物学功能是否充分发挥。或者说，FSHR含量的多少可能与雌性动物的繁殖性能有一定的作 用。
[0003] 实时荧光定量PCR不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它 具有操作简便、快速高效、敏感性高、特异性强、有效解决了 PCR污染的问题、自动化程度高 等特点。山羊FSHR基因已有研宄表明对山羊的繁殖性能有一定的影响，但其生物学机理扔 不清楚。我们应用实时荧光定量PCR技术，建立山羊FSHR基因在不同组织中的表达谱，对 于阐明FSHR基因表达的作用机理具有一定的指导作用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是：提供一种基于实时荧光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因组织表达 谱的建立方法，它具有操作简便、快速高效、敏感性高、特异性强、有效解决了 PCR污染的问 题、自动化程度高等特点，比采用其它方法来建立组织表达谱适应性更强。
[0005] 本发明是这样实现的：基于实时荧光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因组织表达 谱的建立方法，采用Trizol法分别提取已屠宰的发情期产单羔和产双羔母羊的5种组织 的总RNA，所述的5种组织包括下丘脑、垂体、卵巢、输卵管和子宫；并对提取的总RNA进 行cDNA的反转录合成；以上述cDNA为模板，分别对FSHR和GAPDH进行常规PCR扩增； FSHR上游引物的序列为5 ' - CGAGTCATCCCAGAAGGAG-3 '，FSHR下游引物的序列为5 ' -GGCAGGTTGGAGAACACATT- 3'； GAPDH上游引物的序列为5' -CTGACCTGCCGCCTGGAGAAA -3'， GAPDH:下游引物的序列为5' -GTAGAAGAGTGAGTGTCGCTT- 3'；回收相应条带并与T-载 体连接，转化DH5 α感受态细胞，将鉴定为阳性的重组质粒进行测序，并将获得的重组质粒 进行10倍比稀释后，将其作为模板，进行实时荧光定量PCR扩增，获得标准曲线；焚光定量 PCR每个样品，并用CldH2O做阴性对照；采用2^λλ et定量分析方法对山羊FSHR基因在发情 期不同组织进行差异表达量分析，构建组织表达谱。
[0006] 所述的对对FSHR和GAPDH进行常规PCR扩增时，PCR反应条件为：95 °C预变性3 min;95 °C变性 30 s，58 °C 退火 30 s，72 °C延伸 30 min，34 个循环；最后 72 °C延伸 5 min， 4 °C 保存；反应体系为 20 yL:2XTaqPCRMasterMix 10 yL，DNA 模板 2 yL，上、下游 引物各1.5 μ L，加水至20 μ L。
[0007] 所述的回收相应条带并与T-载体连接，具体反应体系如下：胶回收的PCR产物 3 yL ;pUCm-T 载体 I yL ;10XLigation Buffer I yL ;5〇%PEG 4000 μ I ;Sterilized ddH20 3 μL ;Τ4 DNA Ligation I yL;混匀，16 °C连接过夜。
[0008] 所述的转化DH5a感受态细胞的转化步骤如下：取100 μ L感受态细胞，置于冰 上，完全解冻后将细胞均匀悬浮；将上述的连接液全部加入感受态细胞中混匀，冰上放置30 min ;42°C水浴热激90 s，冰上放置15~20 min;加 400 μ L SOC培养基，37 °C 200~250 rpm振荡培养1小时；室温下4000rpm离心5 min，用枪头吸掉400 μ 1上清液，用剩余的培 养基将细胞悬浮；将细菌涂布在预先用20 μ L IOOMm IPTG和100 μ L 20mg/ml X-gal涂 布的氨苄青霉素平板上；平板在37°C下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养 过夜。
[0009] 所述的构建组织表达谱，具体是：首先计算各组织样品的目的基因与内参基因的 Ct差值(Λ Ct= Λ Ctgwaffl - Λ Ct_SH )，然后计算每个组织样品Λ Ct平均值，选取垂体组 织为对照，用其它组织样Λ Ct减去垂体组织的Λ Ct，即ΛΛ Ct= (ΛΛ Ct目的基Η - ΛΛ Ct内 参基因）试验组_ (AA Ct目醜因_ ΔΔ Ctpi3参基因）对照组。
[0010] 由于采用了以上技术方案，本发明应用实时荧光定量PCR技术，建立山羊FSHR基 因在不同组织中的表达谱，对于阐明FSHR基因表达的作用机理具有一定的指导作用。而且 它具有操作简便、快速高效、敏感性高、特异性强及自动化程度高等优点，还有效解决了 PCR 污染的问题，因此比采用其它方法来建立组织表达谱适应性更强。本发明方法简单，易于实 施，成本低廉，使用效果好。
【附图说明】
[0011] 图1为FSHR荧光定量PCR标准曲线； 图2为GAPDH荧光定量PCR标准曲线； 图3为FSHR和GAPDH的溶解曲线，如图所示两对引物特异性较高； 图4为FSHR和GAPDH的扩增曲线； 图5为发情期产单羔和双羔黔北麻羊各组织的相对表达谱。
【具体实施方式】
[0012] 本发明的实施例：基于实时荧光定量PCR的黔北麻羊FSHR基因组织表达谱的建立 方法， 实时荧光定量PCR引物合成和质粒测序送英维捷基(上海）贸易有限公司测序；大肠杆 菌感受态细胞DH5a购自大连Takara公司；质粒小量抽提试剂盒、T-载体PCR产物克隆试 剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；MMLV反转录试剂 盒、SYBR GreenI荧光定量试剂盒购于北京康为试剂生物科技有限公司；采用美国伯乐公司 CFX96实时荧光定量PCR仪。
[0013] (I)山羊各组织RNA提取 (J)分别提取3头发情期产单羔和产双羔母羊5种组织(下丘脑、垂体、卵巢、输卵管和 子宫）样品50-100 mg，迅速置于液氮遇冷的玻璃匀浆器中，迅速研磨成粉末状。吸取1000 μ I Trizol于匀衆管中，吹打均匀后吸出于离心管中。多个样品如此重复，然后加入200 μ L氯仿。
[0014] (g|震荡混匀30s，室温静置5 min以上；12000 rpm 4°C离心15 min，吸取上清液 转移到新的离心管中，加入500 μ 1异丙醇，震荡30 S，室温静置10 min，12000 rpm 4 °C 离心10 min〇
[0015] (|)弃除上清液，加入1ml预冷75%乙醇，震荡混匀沉淀。12000rpm室温离心2 min 后，再吸弃上清液，加入1ml预冷75%乙醇；震荡后12000rpm室温离心2 min。
[0016] 丨弃除上清液，倒置于滤纸后常温10 min晾干；用30 μ L DEPC处理水溶解。
[0017] (2) cDNA的反转录合成 按照HiFiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书合成cDNA第一链，体系为20 yL ：dNTP Mix(2. 5mMEach) 4 μ L, Primer Mix 2 μ L, 5 X RT Buffer 4 yL,DTT(0. 1M) 2 yL,HiFiScript (200U/μ L) I yL,RNA Template 2 μ L, RNase-Free Water 5 yL〇42〇C 孵育45 min后，85孵育5 min，置于冰上冷却，-20°C长期保存。
[0018] (3)引物设计 参照 GenBank 收录的 /??? mRNA 基因序列（NM_001009289. 1)，运用 Primier 5. 0 和 Oligo软件设计跨外显子2、3的荧光定量引物和GAPDH。引物由生工生物工程(上海）股份 有限公司合成。
[0019] FSHR:上游引物 5' CGAGTCATCCCAGAAGGAG3' FSHR:下游引物 5' GGCAGGTTGGAGAACACATT 3' GAPDH:上游引物 5' CTGACCTGCCGCCTGGAGAAA 3' GAPDH:下游引物 5' GTAGAAGAGTGAGTGTCGCTT 3' (4)标准曲线的建立 2:丨以某一头山羊垂体组织cDNA为模板，分别对FSHR和GAPDH进行常规PCR扩增。PCR 反应条件为95 °C预变性3 min;95 °C变性30 s，58 °C退火30 s，72 °C延伸30 min，34个 循环；最后72 °C延伸5 min，4 °C保存。反应体系为