应用Sso7d-IN融合蛋白进行HIV-1整合酶3′加工抑制剂筛选的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地说是将一种新构建的HIV-ι整合酶应用于3'加 工抑制剂体外筛选方法。
【背景技术】
[0002] Sso7d有助于稳定DNA双螺旋结构并促使DNA构型转变，Sso7d与IN基因连接，构建 出的Ss〇7d-IN有较好的溶解性和活性。与野生型整合酶不同的是，它可以更有效的催化整 合体的形成以及与寡核苷酸DNA底物的相关整合过程，并将其应用于对整合酶3'加工抑制 剂的体外筛选。
[0003]目前应用于整合酶3'加工抑制剂常用筛选的方法有：
[0004] 1.分子信标方法
[0005] 此方法是根据焚光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer， FRET)设计出的一段具有茎环结构的寡核苷酸链，两端分别偶联荧光基团和淬灭基团。He根 据此原理，设计了 38nt的单链DNA底物，退火形成与HIV-1LTR U5相同的序列，在该链的5'端 和3'端分别用荧光基团FAM和淬灭基团DABCYL修饰标记。无 IN蛋白存在时，FAM和DABCYL空 间距离近时，FAM受激发后发射的荧光被DABCYL吸收淬灭，检测不到荧光信号;加入IN后，整 合酶特异性识别3'末端的CAGT序列，切下连有DABCYL的GT二核苷酸，FAM与DABCYL的距离变 大，FAM受激发后发射的荧光不再受DABCYL淬灭，激发发射能检测到荧光信号。如抑制剂的 抑制效果好，荧光强度降低。本发明在此方法基础上，进行改进，不同的是应用Ss 〇7d-IN代 替IN，提高反应过程中阳性与阴性值间的差异，有利于抑制剂的筛选。（何红秋.HIV-1整合 酶活性检测方法建立和应用研究.北京工业大学博士论文.2010)。
[0006] 2.酶联免疫吸附法
[0007] 此方法利用时间分辨焚光(time resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)分析法筛 选，该方法的原理是:在合成的一段HIV-1LTR U5端DNA 3'端标记生物素，将其包被在微孔 板中，加入抑制剂孵育后加入整合酶，将生物素标记的核苷酸被洗掉，加入亲和素偶联的Eu (SA-Eu)，SA-Eu与未剪切的生物素标记的底物序列结合，用时间分辨荧光计可检测荧光信 号。加入抑制剂后，荧光强度会增强。（张旋，杨柳萌，郑永唐.HIV-1整合酶抑制剂体外筛选 方法研究进展，中国药理学通报，2012，28 (1): 14-17)。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是利用一种溶解性和活性更好的整合酶用于3'加工抑制剂的体外 筛选，提高了3'加工反应的活性。
[0009] 本发明提供的一种应用Ss〇7d-IN融合蛋白进行HIV-ι整合酶3'加工抑制剂筛选的 方法，包括以下步骤：
[0010] (1 )HIV-1 Ss〇7d-IN整合酶重组蛋白及待测化合物样品的制备
[0011]将合成的Ss〇7d基因片段与野生型整合酶（integraSe，IN)基因分别扩增，通过融 合PCR连接，构建Sso7d-IN表达载体，表达并纯化HIV-1 Sso7d-IN整合酶重组蛋白，分装保存 待用；室温下将待测化合物样品用二甲基亚砜(DMS0)配制成不同浓度的溶液，充分振荡溶 解后备用；
[0012] (2)DNA底物的制备
[0013]用退火缓冲液溶解DNA底物后，PCR仪设定程序94°C2min，每90s下降1°C，约2h后， 底物会自发形成互补双链。上述退火缓冲液含有10mM Tris，50mM NaCl，lmM EDTA，pH = 8.0；
[0014] DNA S^CDABCYL)；
[0015] (3)待测化合物样品的筛选
[0016] 反应在96孔不透明微孔板中进行，阳性对照组2孔，每孔分别加2yL DMS0,阴性对 照组2孔，每孔分别加2yL DMS0,其他实验组各孔加入2yL不同浓度的待测化合物样品；除阴 性对照组，其余都加 Sso7d-IN;具体操作如下:a、反应体系总体积为100yL，用ddH20洗板一 次，然后每孔加入2X反应缓冲液50yL，加入DTT 2yL，2.5yg纯化的HIV-lSso7d-IN整合酶重 组蛋白；b、然后阳性对照组的孔和阴性对照组的孔分别2yL DMS0,实验组的其他孔加入2yL 用DMS0稀释的待测化合物;然后ddH20补足体积;c、与HIV-lSs〇7d-IN整合酶重组蛋白在无 MnCl2的反应缓冲液中37°C孵育30min后，每孔加入终浓度为10mmol/L的Mn2+、20pmol DNA底 物，混匀；37°C反应2h，用酶标仪读取荧光读值;d、同样设置了待测化合物与DNA底物组，只 加2X反应缓冲液50yL、20pmol DNA底物、2yL用DMS0稀释的待测化合物，37°C孵育2h后用酶 标仪读取荧光读值;选择激发光波长为485nm，发射光波长为528nm;上述2X反应缓冲液含 有40mM HEPES、200mMNaCl、50 % (g/L)甘油，pH=7 · 6;
[0017] (4)按照以下公式计算待测样品的抑制率：
[0018]
[0019]通过测定不同浓度下的待测化合物样品抑制率可得出待测化合物的IC50值；
[0020]由于有些待测化合物样品对DNA荧光基团的RFU值有直接影响，会导致高浓度时待 测化合物RFU〈阴性对照RFU的情况，因此需要对待测化合物RFU进行修正，用修正后待测化 合物RFU带入上面的公式进行计算;在上述步骤d中设置待测化合物样品与DNA底物组，测定 化合物不同浓度下，DNA底物RFU值的变化即下述公式中的待测化合物样品与DNA底物组 RFU;修正后待测化合物RFU =待测化合物RFU+(阴性对照RFU-待测化合物样品与DNA底物 组RFU)，其中待测化合物RFU指的是步骤c中其他孔的实验组的待测化合物RFU。
[0021] 其中HIV-lSso7d-IN整合酶重组蛋白的制备方法进一步如下：
[0022] (1)将合成的Ss〇7d片段与IN基因经PCR扩增，得到所需质粒，以Pet_15b载体为基 础构建出Ss〇7d-IN表达载体。转入大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取阳性克隆菌接种于5mL含 有100mg/mL氨苄的LB液体培养基，37 °C摇床振荡培养12-14h得到培养物。
[0023] (2)将（1)中的培养物按体积比1 %接种于LB培养基中，37 °C摇床振荡培养2-3h至 菌液0D值达到0.6-0.8，加入过滤灭菌的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)至终浓度为 0.2mM，37 °C摇床振荡培养4-5h得到培养物。
[0024] (3)将（2)中得到的培养物离心得到沉淀，每lg沉淀用lOmL裂解缓冲液重悬，加 lmg/mL溶菌酶，4 °C孵育30min，置于冰浴超声破碎lOmin，4 °C离心收集上清液。上述裂解缓 冲液含有20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1M NaCl，5mM咪唑，10%(g/L)甘油，pH=7.5。
[0025] (4)将（3)中达到的上清液进行镍琼脂糖凝胶亲和层析，依次用含有20mM、40mM、 400mM咪唑的洗脱液进行梯度洗脱，将收集到的含有目的蛋白的洗脱液用饱和硫酸铵溶液 沉淀蛋白，弃去上清，沉淀用保存液溶解后，分装保存，得到纯化的HIV-lSs 〇7d-IN整合酶重 组蛋白保存液体;上述保存缓冲液含有10%(g/L)甘油，0.1M NaCl，20mM Tris，lmM EDTA， ImM DTT，pH=7.6。
[0026] 合成的Ss〇7d的基因片段如下，其中有11个甘氨酸作为linker与后面的一段IN基 因相连，便于与IN融合表达，构建质粒；
[0027]
[0028]本发明具有以下有益效果：
[0029]与之前表达的野生型整合酶相比较，在IN基因片段前连接Ss〇7d片段，构建出 Ss〇7d-IN有较好的溶解性和活性，纯化过程中无需使用高盐及pH值较高的缓冲液，可以更 有效的催化整合体的形成以及与寡核苷酸DNA底物的相关整合过程，反应过程设置了不加 化合物的阳性对照，从图中可以看到Ss 〇7d-IN的活性相较于IN有显著提高，3'加工反应阳 性值提高了5倍左右，可以用来对HIV-1整合酶3'加工抑制剂的体外筛选。
【附图说明】
[0030] 图1是设置不同的整合酶（分别为Ss〇7d-IN、IN以及无 IN对照组)得出3'加工反应 阳性值图；可以看出Ss〇7d-IN整合酶的活性相较于野生型整合酶有显著提高，反应组3'加 工荧光信号随时间增长而持续增加，IN组起始阶段随时间增加在4h后趋于稳定，而无 IN阴 性对照组的荧光信号在整个反应过程中无增长趋势。
[0031] 图2是使用一种二酮酸抑制剂2-(3-氯-4-氟苄基氨基)-7-羟基-6,7-二氢-5H-[1， 7]二氮杂萘-8-酮反应3h后对Sso7d-IN以及野生型IN的抑制效果图；验证Sso7d-IN是否可 以用来筛选HIV-1整合酶3'加工抑制剂，由图可以看出其对IN和Sso7d-IN有相同的趋势，抑 制效果相似。表明Ss 〇7d-IN能够代替IN，对其他化合物进行了筛选，得到的抑制率数值都已 经过修正。
【具体实施方式】
[0032] 下面结合【具体实施方式】对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
[0033] 实施例1
[0034] 按如下步骤对HIV-lSs〇7d-IN整合酶重组蛋白进行制备及对3'加工抑制剂进行体 外筛选。以黄芩素(具有抑制IN3'加工且能在细胞水平抑制病毒复制)为例：
[0035] (1)将合成的Ss〇7d片段与IN基因经PCR扩增，得到所需质粒，以Pet_15b载体为基 础构建出Ss〇7d-IN表达载体。转入大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取阳性克隆菌接种于5mL含 有100mg/mL氨苄的LB液体培养基，37 °C摇床振荡培养13h得到培养物。
[0036] (2)将（1)中的培养物按体积比1 %接种于LB培养基中，37 °C摇床振荡培养2.5h至 菌液0D值达到0.8，加入过滤灭菌的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.2mM，37 °C 摇床振荡培养4h得到培养物。
[0037] (3)将（2)中得到的培养物离心得到沉淀，每lg沉淀用10mL裂解缓冲液重悬，加