lmg/mL溶菌酶，4 °C孵育30min，置于冰浴超声破碎lOmin，4 °C离心收集上清液。上述裂解缓 冲液含有20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1M NaCl，5mM咪唑，10%(g/L)甘油，pH=7.5。
[0038] (4)将（3)中达到的上清液进行镍琼脂糖凝胶亲和层析，依次用含有20mM、40mM、 400mM咪唑的洗脱液进行梯度洗脱，将收集到的含有目的蛋白的洗脱液用饱和硫酸铵溶液 沉淀蛋白，弃去上清，沉淀用保存液溶解后，分装保存。上述保存缓冲液含有10% (g/L)甘 油，0.1M NaCl，20mM Tris，lmM EDTA，lmM DTT，pH=7.6。
[0039] (5 )DNA底物的制备与待测化合的制备
[0040] 用退火缓冲液溶解DNA底物后，PCR仪设定程序94°C2min，每90s下降1°C，约2h后， 底物会自发形成互补双链。上述退火缓冲液含有10mM Tris，50mMNaCl，lmM EDTA，pH=8.0。 室温下将待测化合物用DMS0配成不同溶度的溶液，充分振荡溶解后备用。
[0041 ] DNA sHdabcyl)。
[0042] (6)待测化合物样品的筛选
[0043] 反应在96孔不透明微孔板中进行，阳性对照组2孔，每孔分别加2yL DMS0,阴性对 照组2孔，每孔分别加2yL DMS0，除阴性对照组，其余都加 Sso7d-IN。其他实验孔分别加50μ mol/L、10ymol/L、2ymol/L、0.4ymol/L的黄苳素各2yL，用ddH2〇洗板一次，然后每孔加入2 X 反应缓冲液50yL，加入DTT 2yL，2.5yg纯化的Sso7d-IN蛋白，ddH20补足体积，与Sso7d-IN在 无 MnCl2的反应缓冲液中37°C孵育30min后，每孔加入终浓度为10mmol/L的Mn2+，20pmol DNA 底物，混匀。37 °C反应2h，用酶标仪读取RFU。同样设置了待测化合物与DNA底物组，只加2 X 反应缓冲液50yL，20pmol DNA底物，用DMS0稀释的50ymol/L、10ymol/L、2ymol/L、0 · 4ymol/L 的黄芩素各2yL，37°C孵育2h后用酶标仪读取RFU。选择激发光波长为485nm，发射光波长为 528nm。上述2 X 反应缓冲液含有40mM HEPES，200mMNaCl，50% (g/L)甘油，pH= 7.6。通过读 值计算的黄芩素的IC5Q值为1.64μΜ。
[0044] 实施例2
[0045] 按如下步骤对HIV-lSs〇7d-IN整合酶重组蛋白进行制备及对3'加工抑制剂进行体 外筛选。以一种二酮酸抑制剂2-( 3-氯-4-氟苄基氨基)-7-羟基-6，7-二氢-5H-[ 1，7 ]二氮杂 萘-8-酮为例：
[0046] (1)将合成的Ss〇7d片段与IN基因经PCR扩增，得到所需质粒，以Pet_15b载体为基 础构建出Ss〇7d-IN表达载体。转入大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取阳性克隆菌接种于5mL含 有100mg/mL氨苄的LB液体培养基，37 °C摇床振荡培养13h得到培养物。
[0047] (2)将（1)中的培养物按体积比1 %接种于LB培养基中，37 °C摇床振荡培养2.5h至 菌液0D值达到0.8，加入过滤灭菌的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.2mM，37 °C 摇床振荡培养4h得到培养物。
[0048] (3)将（2)中得到的培养物离心得到沉淀，每lg沉淀用10mL裂解缓冲液重悬，加 lmg/mL溶菌酶，4 °C孵育30min，置于冰浴超声破碎lOmin，4 °C离心收集上清液。上述裂解缓 冲液含有20mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1M NaCl，5mM咪唑，10%(g/L)甘油，pH=7.5。
[0049] (4)将（3)中达到的上清液进行镍琼脂糖凝胶亲和层析，依次用含有20mM、40mM、 400mM咪唑的洗脱液进行梯度洗脱，将收集到的含有目的蛋白的洗脱液用饱和硫酸铵溶液 沉淀蛋白，弃去上清，沉淀用保存液溶解后，分装保存。上述保存缓冲液含有10% (g/L)甘 油，0.1M NaCl，20mM Tris，lmM EDTA，lmM DTT，pH=7.6。
[0050] (5 )DNA底物的制备与待测化合的制备
[00511用退火缓冲液溶解DNA底物后，PCR仪设定程序94°C2min，每90s下降1°C，约2h后， 底物会自发形成互补双链。上述退火缓冲液含有10mM Tris，50mMNaCl，lmM EDTA，pH=8.0。 室温下将待测化合物用DMS0配成不同溶度的溶液，充分振荡溶解后备用。
[0052] DNA sHdabcyl)。
[0053] (6)待测化合物样品的筛选
[0054] 反应在96孔不透明微孔板中进行，阳性对照组2孔，每孔分别加2yL DMS0,阴性对 照组2孔，每孔分别加2yL DMS0,除阴性对照组，其余都加 Ss〇7d-IN。其他实验孔分别加 0 · 2mg/mL、0 · 04mg/mL、0 · 008mg/mL、0 · 0016mg/mL 的 2- (3-氯-4-氟苄基氨基）-7-羟基-6，7-二氢-5H-[1，7]二氮杂萘-8-酮分别各2yL，用ddH20洗板一次，然后每孔加入2X反应缓冲液 50yL，加入DTT 2yL，2.5yg纯化的Sso7d-IN蛋白，ddH20补足体积，与Sso7d-IN在无 MnCl2的反 应缓冲液中37°C孵育30min后，每孔加入终浓度为10mmol/L的Mn2+，20pmol DNA底物，混匀。 37 °C反应2h，用酶标仪读取RFU。同样设置了待测化合物与DNA底物组，只加2 X反应缓冲液 50yL，20pmol DNA底物，用DMS0稀释的0·2mg/mL、0·04mg/mL、0·008mg/mL、0·0016mg/mL的2_ (3-氯-4-氟苄基氨基)-7-羟基-6，7-二氢-5H-[ 1，7 ]二氮杂萘-8-酮分别各2yL，37 °C孵育2h 后用酶标仪读取RFU。选择激发光波长为485nm，发射光波长为528nm。上述2 X反应缓冲液含 40mM HEPES，200mMNaCl，50%(g/L)甘油，pH = 7.6。通过读值计算的2-(3-氯-4-氟苄基氨 基)-7-羟基-6，7-二氢-5H-[ 1，7 ]二氮杂萘-8-酮的 IC5Q 值为 12 · 4 ΙμΜ。
[0055] 实施例3
[0056] 利用与实施例2相同的操作方法测得3'加工抑制剂的IC5Q值如下：
[0057]
[0058]
【主权项】
1. 一种应用Sso7d-IN融合蛋白进行HIV-I整合酶3/加工抑制剂筛选的方法，包括W下 步骤： (nHIV-lSso7d-IN整合酶重组蛋白的制备 将合成的Sso7d基因片段与野生型整合酶（integraseJN)基因分别扩增，通过融合PCR 连接，构建Sso7d-IN表达载体，表达并纯化HIV-lSso7d-IN整合酶重组蛋白，分装保存待用； 室溫下将待测化合物样品用二甲基亚讽(DMSO)配制成不同浓度的溶液，充分振荡溶解后备 用； (2) DNA底物的制备 用退火缓冲液溶解DNA底物后，PCR仪设定程序94°C2min，每90s下降rC，约化后，底物 会自发形成互补双链;上述退火缓冲液含有IOmM化is,50mM NaCiamM邸TA,pH=8.0; DNA底物为5'-(FAM)-ACT GCT AGA GAT TTT CCA CGT GGA AAA TCT CTA GCA GT-3'-(DABCYL)； (3) 待测化合物样品的筛选 反应在96孔不透明微孔板中进行，阳性对照组巧L，每孔分别加化L DMS0,阴性对照组2 孔，每孔分别加化L DMS0,其他孔的实验组中加入化L不同浓度的待测化合物样品；除阴性 对照组，其余都加 Sso7d-IN;具体操作如下:a、反应体系总体积为10化L，用dd此0洗板一次， 然后每孔加入2 X反应缓冲液50化，加入DTT 2化，2.5iig纯化的Sso7d-IN整合酶重组蛋白； b、然后阳性对照组的孔和阴性对照组的孔分别化L DMS0,实验组的其他孔加入化L用DMSO 稀释的待测化合物;然后dd此0补足体积;C、与HIV-lSso7d-IN整合酶重组蛋白在无 MnCb的 反应缓冲液中37°C解育30min后，每孔加入终浓度为lOmmol/L的Mn2+、2化mol DNA底物，混 匀；37°C反应化，用酶标仪读取巧光读值;d、同样设置了待测化合物与DNA底物组，只加2X 反应缓冲液50化、2化mol DNA底物、2化用DMSO稀释的待测化合物，37°C解育化后用酶标仪 读取巧光读值；选择激发光波长为485nm，发射光波长为528nm;上述2 X反应缓冲液含有 40mM 肥阳SJOOmM NaCl、50%(g/L)甘油，pH=7.6; (4) 按照W下公式计算待测样品的抑制率：通过测定不同浓度下的待测化合物样品抑制率可得出待测化合物的ICso值。2. 按照权利要求1的方法，其特征在于，由于有些待测化合物样品对DNA巧光基团的R即 值有直接影响，会导致高浓度时待测化合物RFlK阴性对照RFU的情况，因此需要对待测化合 物RRJ进行修正，用修正后待测化合物RRJ带入上面的公式进行计算;在上述步骤d中设置待 测化合物样品与DNA底物组，测定化合物不同浓度下，DNA底物R即值的变化即下述公式中的 待测化合物样品与DNA底物组RFU;修正后待测化合物RFU =待测化合物R即+(阴性对照RFU-待测化合物样品与DNA底物组RFU)，其中待测化合物RRJ指的是步骤C中其他孔的实验组的 待测化合物RFU。
【专利摘要】应用Sso7d-IN融合蛋白进行HIV-1整合酶3′加工抑制剂筛选的方法，属于生物技术领域。Sso7d是一小段硫磺矿硫化叶菌DNA蛋白。Sso7d与整合酶(IN)融合表达提高IN的溶解性和活性，在纯化过程中无需使用高盐及pH值较高的缓冲液，可以更有效的催化整合体的形成以及与寡核苷酸DNA底物整合的相关过程，与IN相比，3′加工反应活性提高了5倍左右，并在抑制剂筛选过程中提高阳性与阴性值之间的差异。
【IPC分类】C12Q1/25
【公开号】CN105648031
【申请号】
【发明人】胡利明, 毛志杰, 刘伟, 剧仑
【申请人】北京工业大学
【公开日】2016年6月8日
【申请日】2016年2月24日