一种比率式检测肼的荧光探针及其合成方法与应用与流程

本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种比率式荧光法检测肼的分子探针及其制备方法和在检测肼方面的应用。

背景技术：

肼(N₂H₄)是一种具有高反应活性的物质，在化学与制药合成工业中有这广泛的应用，同时不可避免地会排放到环境中。美国国家环境保护局认定肼为一种潜在致癌物，规定其安全限量值为10 ppb (0.3μmol·L^-1)。肼排放到环境中，由于极易溶于水，容易通过皮肤和呼吸等途径被人体摄入，导致肝、肺、肾及神经系统的损伤。肼的排放不仅严重污染环境，而且影响人们的健康。所以开发高灵敏、高选择检测肼的方法对环境检测与保护是非常必要的。

传统的检测肼的方法主要有滴定测量（Malone H.E. Anal. Chem. 1961, 33, 575.）、电化学方法（Stetter J.R., Blurton K.F., Valentine A.M. J. Electrochem. Soc. 1978, 125, 1804；Channon R.B., Joseph M.B., Bitziou E. Anal. Chem. 2015, 87, 10064.）及色谱法（Gyllenhaal O., Grönberg L., Vessman J. J. Chromatogr. A 1990, 511, 303；Sun M., Bai L., Liu D.Q. J. Pharm. Biomed. Anal. 2009, 49, 529.）等。但这些方法一般都耗时较长、涉及复杂繁琐的样品处理过程或需要昂贵的精密仪器等。而利用分子探针荧光法检测肼具有样品处理简洁、成本低廉及操作简便快速等优点，近年来得到了发展与利用。但目前开发的用于检测肼的探针分子的响应原理大都是单波长荧光强度依耐性的，这类探针测试结果容易受样品基质及探针浓度的影响。而比率式的荧光探针(用两个波长处的荧光发射强度的比值来定量)能克服上述问题。

技术实现要素：

对于上述情况，本发明目的是提供一种新的易于制备、性能稳定的比率式荧光分子探针，并提供该探针的合成方法，还在此基础开发出对肼进行高选择性和高灵敏度的检测方法。

为实现本发明目的，本发明利用肼具有较强的亲电性，能对缺电子分子或基团进行亲电取代反应。而溴代脂肪酸在一定的溶液环境中溴能选择性的被肼取代。另一方面萘酰亚胺荧光骨架具有良好的荧光特性且通过在4位引入不同的官能团会使其产生比率式的荧光相应。基于此，设计了一种溴代脂肪酸为响应基团，萘酰亚胺骨架作为发光团的用于检测肼的荧光分子探针。

所述检测肼的荧光分子探针，其特征在于，结构通式如下：

其中R选自具有1至18个碳原子的烷基链中的任一种；n为2、3或4；X为Cl或Br。优选：R选自具有1至6个碳原子的烷基链中的任一种；n为2、3或4；X为Cl或Br。优选：R选自具有1至4个碳原子的直链烷基链中的任一种；n为2或3；X为Cl或Br。

进一步优选为：

化合物1

其合成方法具体如下：

将取代的4- 羟基-1,8-萘酰亚胺与卤代脂肪酸在有机溶剂中溶解后，加入催化剂在室温下偶联反应，分离纯化后得到探针分子化合物。

4- 羟基-1,8-萘酰亚胺骨架中的酰亚胺N取代基选自1至18个碳原子的烷基链中的任一种，优选为1-6个碳原子中的任一种。更优选1至4个碳原子的直链烷基链中的任一种。

卤代脂肪酸为：

其中：n为具为2、3或4；X为Cl或Br；n优选为2或3，X优选为Br。

所述反应溶剂选自二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮。

所述催化剂选4-二甲氨基吡啶，二环己基碳二亚胺，N,N-二异丙基碳二亚胺，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺中的一种或两种。

上述方法中反应温度为室温。

上述方法中反应时间为12-24 h。

优选其制备方法如下：

将取代的4- 羟基-1,8-萘酰亚胺与卤代脂肪酸溶于二氯甲烷，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与N-甲基吡咯烷酮后室温反应12h，减压蒸馏除去溶剂，柱层析住分离得到纯的探针化合物。

化合物1合成方法如下：

将N-丁基-4- 羟基-1,8-萘酰亚胺与4-溴丁酸在有机溶剂中溶解后，加入催化剂在室温下偶联反应，分离纯化后得到探针分子化合物1。反应流程如下：

利用该分子探针对肼进行定性和定量测定，用于水体、土壤或生物体系中肼的检测。

采用比色法检测时，溶液从无色变为黄色，实现待测样品中肼的定性检测；

采用荧光检测时，将所述分子探针溶解于水与二甲基亚砜的混合缓冲体系中，加入含不同浓度肼溶液，测试其在550 nm和420 nm处荧光强度，然后以溶液在550 nm和420 nm处荧光发射强度的比值对肼的浓度作标准图，根据标准图，定量检测待测肼溶液含量。

采用比色法或荧光法检测时，所述荧光分子探针对肼的检测浓度为1 – 30 μmol·L^-1，检测限为0.27 μmol·L^-1。

本发明所述检测肼的分子探针另一种应用方式是通过将薄层色谱板在含本发明所述分子探针的二氯甲烷溶液中浸泡后干燥，制备得到肼监测硅胶板，利用该硅胶板定性检测气态肼。

本发明所述荧光法检测肼的分子探针，优选采用N-丁基-4- 羟基-1,8-萘酰亚胺与4-溴丁酸通过酯化偶联反应合成得到，萘酰亚胺为荧光基团；4-溴丁酸酯为肼的响应基团。

在本说明书的实施例中更详细地说明了该探针的合成和检测方法。将本发明荧光分子探针溶解于水与二甲基亚砜(DMSO) 的混合缓冲溶液中，室温下便可以对肼进行测试。当加入肼后，肼能亲核取代溴原子，并进一步通过成环脱除反应，使萘酰亚胺4位的羟基游离出来形成氧负离子的结构。反应后探针分子的酰亚胺为大π共轭的吸电子基团，反应后形成的4位的氧负离子为给电子基团。从而产生强烈的分子内电荷转移(ICT) 效应，使探针溶液的吸收光谱与发射光谱都呈现出显著地红移。

本发明荧光法检测肼的探针的具体特征如下：

该荧光探针分子具有良好的稳定性和光学性质，反应前最大吸收波长为~350 nm，单独溶液呈无色，发射波长在~420处，为蓝色发射；随着肼的加入，探针分子在紫外吸收峰红移至~450 nm，溶液呈黄色，荧光发射峰红移至~550 nm，为黄绿色发射。

本发明所述的探针分子原料易得，合成产率较高，光学性能稳定（探针溶液能在室内稳定存放一个月以上，其光谱性质保持不变），灵敏度较高，对肼识别能力强，响应速度较快，响应范围为1.0 – 30 μmol·L^-1，检测限低（0.27 μM），因此该类型探针可用于水体、土壤以及生物体系及气态肼的检测。

附图说明

图1为本发明合成的分子探针的核磁共振氢谱；

图2 为本发明分子探针与肼反应前后的紫外谱图A与荧光光谱图B，其中，A图中，1-反应前，2-反应后；B图中，1-反应前，2-反应后；

图3为本发明5 μmol·L^-1分子探针在加入不同浓度肼后荧光发射光谱图，从a至s，肼浓度分别为0、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、 50、 60、 70、 80、 90、 100 μmol·L^-1，溶液体系为水与二甲基亚砜的混合缓冲溶液（H₂O/DMSO=9/1, v/v, 10 mM HEPES, pH 7.4），横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。

图4为肼的浓度标准曲线图，即5 μmol·L^-1分子探针，反应前后在550 nm和420 nm处荧光发射强度的比值（I₅₅₀/I₄₂₀）和肼浓度的线性关系；横坐标为肼的浓度，纵坐标为I₅₅₀/I₄₂₀。

图5为本发明分子探针对肼选择性；即5 μM本发明分子探针，加入100 μmol·L^-1不同离子(Ag⁺、 Al³⁺、 Ca²⁺、 Cd²⁺、Fe²⁺、 Fe³⁺、 K⁺、 Li⁺、Mg²⁺、 Mn²⁺、 Pb²⁺、Zn²⁺、 AcO^-、 Br^-、CO₃^2-、 Cl^-、F^-、HPO₄^2-、 I^-、N₃^-、 NO₂^-、NO₃^-、 SO₄^2-)后，在550 nm和420 nm处荧光发射强度的比值（I₅₅₀/I₄₂₀）的变化；横坐标为测试的干扰离子，纵坐标为I₅₅₀/I₄₂₀。

图6为本发明肼硅胶板检测气态肼的实验图；即本发明制备的薄层硅胶板在不同浓度肼水溶的密闭容器气氛中处理后的光学照片（上）和紫外灯下的照片图（下）。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例 1：荧光分子探针的合成

将N-丁基-4- 羟基-1,8-萘酰亚胺(0.27 g, 1.0 mmol)与4-溴丁酸(181 mg, 1.1 mmol)溶于二氯甲烷(10 mL)，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(170 mg, 1.1 mmol)与N-甲基吡咯烷酮(8.5 mg, 0.1 mmol)后室温反应12h。待反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，柱层析住分离（洗脱剂为二氯甲烷/甲醇=4/1的混合溶液）得到产物白色固体320mg (收率：76%)。产物结构式如下:

¹H NMR (400 Hz, CDCl₃): δ 8.56 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.53 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 8.19 (t, J = 10.3 Hz, 1H), 7.76 – 7.65 (m, 1H), 7.53 – 7.43 (m, 1H), 4.19 – 4.02 (m, 2H), 1.64 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 1.55 (s, 2H), 1.38 (dd, J = 14.8, 7.3 Hz, 2H), 1.27 – 1.21 (m, 2H), 1.15 – 1.06 (m, 2H), 0.91 (t, J = 7.2 Hz, 3H). MS [ESI]: m/z, calcd for [M+H]⁺ 418.0654; found 418.0648.

实施例2

将N-丁基-4- 羟基-1,8-萘酰亚胺270 mg (1.0 mmol)与4-溴丁酸181 mg (1.1 mmol)在二氯甲烷(10 mL)中溶解后加入4-二甲氨基吡啶与二环己基碳二亚胺，室温下反应过夜，待反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，柱层析住分离（洗脱剂为二氯甲烷/甲醇=4/1的混合溶液）得到产物白色固体,(收率：79%)。

实施例 3：探针对肼的荧光检测

将上述制得分子探针溶解于水与二甲基亚砜的混合缓冲溶液（H₂O/DMSO=9/1, v/v, 10 mM HEPES, pH 7.4)），配制成5 μmol·L^-1的探针溶液。在3 mL的比色皿中加入2mL配制的5 μmol·L^-1 的探针溶液，然后分别加入不同浓度的肼后均匀混合，测试其荧光光谱，结果如图3所示。以溶液在550 nm和420 nm处荧光发射强度的比值对肼的浓度作图，肼浓度在1.0 – 30 μmol·L^-1范围内时，两者之间呈现良好的线性关系(图4)，根据标准图，实现该浓度范围内待测样品中肼的定量检测，而且溶液从无色变为黄色，也适用于裸眼检测。并且此探针不受其它一些常见离子的影响，如：Ag⁺、 Al³⁺、 Ca²⁺、 Cd²⁺、Fe²⁺、 Fe³⁺、 K⁺、 Li⁺、Mg²⁺、 Mn²⁺、 Pb²⁺、Zn²⁺、 AcO^-、 Br^-、CO₃^2-、 Cl^-、F^-、 HPO₄^2-、 I^-、N₃^-、 NO₂^-、NO₃^-、 SO₄^2-。在上述干扰离子存在的条件下，探针对含肼仍具有良好的选择性和灵敏度(图5)。

通过将薄层色谱板在含1 mmol·L^-1 探针的二氯甲烷溶液中浸泡后干燥，制备得到了肼监测硅胶板。将制备的薄层硅胶板在不同浓度肼水溶（体积分数分别为：0，0.1%，1%，5%，10%，15%，20%，30%，40%）的密闭容器气氛中处理1h，可以明显地观测到硅胶板逐渐由无色变为黄色。在手持紫外灯下发射的荧光由蓝色逐渐变为黄绿色(图6)。

可以看出，本发明能实现对肼的定性、定量检测，灵敏度高，检测限达0.27μmol·L^-1，且抗干扰强。